南召辛夷SRAP遗传多样性分析及指纹图谱的构建_王岚.pdf

：文章编号：（）南召辛夷 遗传多样性分析及指纹图谱的构建王岚，郭晓琴，张宏，李靖靖（郑州工程技术学院 化工食品学院，河南 郑州 ；南召县辛夷产业办公室，河南 南召 ）摘要：利用毛细管电泳技术，鉴定 （）引物在 个南召辛夷种系中扩增条带的遗传多样性，聚类分析并构建 指纹图谱，为南召辛夷的种系鉴定和分子育种提供理论依据。结果表明：（）对 引物共扩增出 条带，其中 条多态性的条带（），每对引物扩增出多态性位点为 条，平均为 条；（）选用多态性高、鉴别能力强的对引物构建了 份南召辛夷种系基于 个位点的 指纹图谱；（）份南召辛夷的遗传相似系数为 。聚类结果显示，个南召辛夷样品可分为大类群，且与采摘地无直接关系。关键词：南召辛夷；遗传多样性；指纹图谱；分子标记中图分类号：文献标识码：开放科学（资源服务）标识码（）：o o o o o o ，o ，o ，（，；，）：（），：（），（），（），（），o ：（）；引言辛夷（）始载于 神农本草经，是我国民间常用的中药材，具有抗炎、抗过敏的作用。河南省南召县属北亚热带季风型大陆性气 候，年 平 均 气 温 ，平 均 年 降 水 量 ，对植物生长极为有利。目前国内辛夷市场，品系混乱、质量参差不齐、真伪难辨，严重影响了辛夷的药品质量及道地药材的品牌效应。辛夷作为豫南众多常见药用植物资源中的一员，目 前 国 内 外 对 其 研 究 主 要 集 中 于 化 学 成 分 分析、临床应用、栽培技术、品种选育及种属分类 等方面，利用分子标记进行遗传多样性的研究报道甚少。而药用植物资源是我国中医药收稿日期：；修订日期：；通信联系人，：基金项目：国家自然科学基金项目（）；河南省科技攻关计划项目（）；年度河南省高校青年骨干教师培养计划项目（）作者简介：王岚（），女，河南郑州人，副教授，在读博士生，主要从事植物分子生物学及生物技术研究。信阳师范学院学报（自然科学版）第 卷第期 年月 事业发展的重要基础，河南南召作为历史上辛夷的原产地，针对其道地性的分子生物学研究，有利于推动辛夷药用事业科学规范的发展。相 关 序 列 扩 增 多 态 性（，）是 一 种 基 于 技术的新型分子标记技术，具有结果稳定、高共显性、条带易于分离等优点，被广泛地应用到植物的研究中 。毛细管电泳法是一种高效液相分离技术，其具有操作简单、分辨率和灵敏度高、实验检测结果稳定、共显性稳定、可靠性高、自动化等优点，极大地提高了工作效率，在多种植物遗传性分析和基因分析中得到了广泛应用 。但目前国内外未见利用 分子标记和毛细管电泳技术用于辛夷的研究报道。本研究拟联合 分子标记 和 毛 细 管 电 泳 技 术，对 个 南 召 辛 夷（，）种系进行了遗传多样性分析，并构建了其 指纹图谱，以期为南召辛夷的种系鉴定和育种提供理论依据。材料和方法实验材料实验样品由河南省南阳市南召县辛夷产业办公室张宏提供，于 年 月 日采摘于河南省南召县辛夷树盛花期的花蕾，共 个样品（按照顺序分别设为 号），具体样品信息见表，采摘后用自封袋封装，冰箱冻存。表南召辛夷编号及品种名称 o o 编号品种采集地采集纬度采集经度采集海拔大毛桃小店乡马庄村北纬 东经 串鱼小店乡马庄村北纬 东经 猴巴掌小店乡马庄村北纬 东经 串鱼猴巴掌小店乡马庄村北纬 东经 辛夷王小店乡马庄村北纬 东经 驴奶头小店乡马庄村北纬 东经 紫玉兰皇后乡天桥村北纬 东经 红玉兰皇后乡天桥村北纬 东经 辛夷 提取及检测应用植物基因组 提取试剂盒（北京天根、）提取南召辛夷花蕾基因组，利用微量分 光 光 度 计（美 国 ）测 定 的 值及 值，利用分光光度计测定 浓度。冰箱冻存备测。分析参照文献 创建的 方法，并对扩增体系和程序进行优化。正向引物（、和 ），反向引物（、和 ）均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。筛选出对条带清晰、多态性号、重复性好的引物，引物序列详见表。扩增采用 反应体系，其中 缓冲液（含 ），正、反向引物各，模板 ，聚合酶，余双蒸水补齐。表对多态性 引物组合序列（）及 反应条件 o o o （）o o o 引物组合正向引物反向引物 反应条件步骤一步骤二 预变性 变性 变性 退火 退火 延伸 延伸 个循环 个循环保存第 卷第期信阳师范学院学报（自然科学版）：年月数据分析根据 扩增产物的毛细管电泳结果，使用峰检出（）功能，输入所有可能条带的参数，软件自动生成包含每个样本的条带大小、浓 度、相 对 丰 度，量 浓 度 等 详 细 信 息 的 和 表格，调整阈值、最小峰间距，以容差为度处理条带数据，计算条带数目、大小和多态性比例。利用遗传统计学软件（版 本）计 算 各 样 品 间 遗 传 相 似 系 数；运 用 法进行聚类分析；根据无带和有带情况利用 软件自动转换为“”和“”数据矩阵。结果与分析 多态性分析根据对 引物对 个河南辛夷样品扩增产物的毛细管电泳结果，制作以 引物为例的分离图谱（如图）。引 物 的 分离图 谱以 序列作为 ，显示引物的结合位置，可以看出品系间的条带数。在不同辛夷品系间条带数不同，其中以样品和 的最多，这种样品组引物的电泳条带数均为 条。扩增结果显示（表）：对 引物共扩增出 条带，条带大小为 ，多态性条带 条，每对引物扩增出多态性条带平均为（）条，多态性条带比例平均为 （）。其中对引物中含南召辛夷的 个特征位点，可作为品系的特异引物。表对多态性 引物组合的 扩增结果 o o o o o 引物组合 条带大小 总条带数多态性条带数量比例 合计 平均 注：横轴为条带大小；纵轴为荧光的相对强度（）。图引物 对 个南召辛夷扩增的毛细管电泳结果汇总图 o o o o o 遗传相似性及聚类分析如图所示，个辛夷品系的遗传相似系数为 。其中样品、及 与其余 个样品间遗传相似系数最小，为，表明它们之间遗传基础差异较大，亲缘关系较远。在遗传相似系数为 处，可将 个南召辛夷种（系）分为大类群：类群包括 号、号皇后乡天桥村紫玉兰和 号皇后乡天桥村红玉兰；类群包括号小店乡马庄村串鱼和 号小店乡马庄村驴奶头；类群包括 号、号皇后乡天桥村紫玉兰，号、号和 号皇后乡天桥村红玉兰；类群包括 号皇后乡天桥村紫玉兰和 号皇后乡天桥村红玉兰；类群包括 号、号和 号小店乡马庄村辛夷王；其余辛夷为类群。上述结果表明，个南召辛夷品系的遗传基础存在差异，与品系分布的地理位置无明显相关性。王岚，郭晓琴，张宏，等 南召辛夷 遗传多样性分析及指纹图谱的构建图 份南召辛夷的 聚类图 o o o 指纹图谱构建在 对 多 态 性 引 物 中，引 物 和 可将 个南召辛夷品种绝大部分区分开，故用这对引物组合来构建指纹图谱。多态性条带构建 个辛夷品种的 指纹图谱，其中多态性条带的 片段长度分别为、和 ，结果见图。经验证，在相似率为 时，该指纹图谱的置信概率为，故用该指纹图谱可对南召辛夷品种进行鉴定。注：黑色代表有条带，白色代表无条带；为引物 的特征性位点。图 标记构建 份南召辛夷 指纹图谱 o o o 讨论辛夷种质资源的遗传多样性遗传多样性在物种的进化过程中起重要作用，低水平的遗传多样性影响种群的进化和生存能力，而多态性研究是评价遗传多样性的重要依据之一。研究辛夷种质资源的 遗传变异是改良和杂交育种的分子生物学基础，可为亲本选配和种质资源的保护提供理论依据。我国目前暂无统一的辛夷分子身份数据库，本研究通过分析和处理毛细管电泳的分离图谱，根据对 引物对 个河南辛夷样品扩增产物进行毛细管电泳，扩增出 个条带，其中多态性条带 条，引物多态性位点百分率（）为 ，均表现为高多态性。表明这些引物均可作为南召辛夷遗传基础评价的核心引物，虽然 略低于郭乐等 在望第 卷第期信阳师范学院学报（自然科学版）：年月春玉兰遗传多样性 分析中的 ，这可能与采用不同的分子标记及引物有关，但也能很好地对南召辛夷群内遗传多样性分析。辛夷种质资源的遗传相似系数与聚类分析辛夷品种资源丰富，遗传背景复杂。本文中 个辛夷品系间的遗传相似系数（）为 ，说明这些南召辛夷品种在 水平上存在丰富的遗传多样性。聚类分析结果显示：在 为 处，个辛夷品种可分为个类群，它们之间既有相似的遗传背景又存在一定的差异，且与地理位置来源无直接关系。这也与郭乐等 用 分析报道的望春玉兰遗传关系与它们的地理来源并无严格的一致性关系基本一致。辛夷种质资源 指纹图谱的构建目前构建植物 植物图谱主要包括特征谱带法、引物组合法和单引物法 。本研究选用辛夷品系特征位点多态性高，鉴别能力强的引物 和 组 合 构 建 了 南 召 辛 夷 指纹图谱。一般来说，生态环境不同、经纬度相差较大、地理分布不同的作物，其资源群体间遗传差异较大，这也与其他作物上的研究结果相一致。用此图谱虽然对有些在同一地点不同辛夷树采摘、遗传相似度极高的样品无法区分，但其余绝大部分辛夷品系都能得到有效区分。结论本研究可以满足南召辛夷 遗传多样性分析及指纹图谱的构建要求，对于有些样品无法鉴别，可通过扩充多态性引物组合或筛选新的分子标记来进行区分。另外由于南召辛夷分布地点广泛，本研究样品采集数量较少，代表性不足，需要在今后的进一步研究中，扩充样品量，提高指纹图谱的鉴定位点，为南召辛夷的品系鉴定、种权保护和遗传多样性分析提供更加可靠的理论依据。参考文献：丁兆平神农本草经解读 味北京：华夏出版社，：，：周毅叶，王祺，贾妍卓，等基于网络药理学的辛夷治疗过敏性鼻炎作用机制研究中国中医药信息杂志，（）：，（）：，：张行，吴迎春，郭夫江，等道地药材南召辛夷现状调研中药材，（）：，（）：卢东升，王金平 豫南常见药用植物资源调查与评价 信阳师范学院学报（自然科学版），（）：，（），（）：万楷杨，李秋芳不同产地望春花药材中挥发油的化学成分分析亚太传统医药，（）：，（）：王萍，张海燕，刘英孟，等 辛夷挥发油的化学成分、药理作用及临床应用研究进展 中国药房，（）：，（）：王平川，侯薇，马戈，等辛夷清肺饮加味联合氯雷他定片治疗急性发作期变应性鼻炎（肺经伏热证）的疗效观察中国中医急症，（）：，（），（）：王岚，郭晓琴，张宏，等 南召辛夷 遗传多样性分析及指纹图谱的构建 ，：黄杰，李春明，余永亮，等 南召辛夷矮化丰产栽培技术 河南林业科技，（）：，（）：傅大立辛夷植物资源分类及新品种选育研究长沙：中南林学院，：，薛天贵，辜云杰，周进，等 辛夷嫁接育苗技术研究 安徽农业科学，（）：，（）：，（），：，（）：，：李仁学，江玲，顾钦，等 基于 标记的大别山薯蓣群体结构分析 湖北农业科学，（）：，（）：王博，白湧沨，翟一静，等毛细管电泳化学发光法测定牛奶中己烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚信阳师范学院学报（自然科学版），（）：，（），（）：常玉卉，张艾英，刘盼，等 荧光标记毛细管电泳与谷子品种遗传多样性分析分子植物育种，（）：，（）：程玮哲，樊军锋，周永学，等基于荧光 标记的 个白杨派种质资源遗传多样性分析西北林学院学报，（）：，（）：，：，：郭乐，康永祥，邢振杰，等望春玉兰种质资源遗传多样性 分析植物研究，（）：，（），（）：杨晴，杨菲，杨康，等 秦皇岛产柽柳 遗传多样性分析与指纹图谱构建 中草药，（）：，（）：钱雨清基于 标记的烟草 指纹图谱的构建与遗传分析泰安：山东农业大学，：，陶爱芬，魏嘉俊，刘星，等应用 标记绘制 份南瓜属种质资源 指纹图谱植物遗传资源学报，（）：，（）：责任编辑：任长江第 卷第期信阳师范学院学报（自然科学版）：年月