生物技术在植物育种中应用市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

第十三章第十三章生物技术在植物育种中应用生物技术在植物育种中应用第1页1、教学基本要求、教学基本要求（1）了解细胞工程与作物育种原理和）了解细胞工程与作物育种原理和基本方法；基本方法；（2）了解作物转基因技术原理和基本）了解作物转基因技术原理和基本方法；方法；（3）了解分子标识主要类型和分子标）了解分子标识主要类型和分子标识辅助选择育种原理和基本方法。识辅助选择育种原理和基本方法。第2页2、教学基本内容、教学基本内容第一节第一节细胞工程与作物育种细胞工程与作物育种一、细胞和组织培养与作物育种一、细胞和组织培养与作物育种二、植物原生质体培养和体细胞杂交二、植物原生质体培养和体细胞杂交第二节第二节作物育种转基因技术作物育种转基因技术一、转基因技术发展现实状况一、转基因技术发展现实状况二、二、*转基因育种程序转基因育种程序三、转基因作物品种选育三、转基因作物品种选育四、转基因作物生物安全性四、转基因作物生物安全性第三节第三节分子标识辅助选择育种分子标识辅助选择育种一、一、*分子标识类型和特点分子标识类型和特点二、惯用分子标识原理和遗传特征二、惯用分子标识原理和遗传特征三、三、MAS育种方法育种方法第3页第十三章第十三章生物技术在作物育种生物技术在作物育种中应用中应用第一节第一节 细胞工程与作物育种细胞工程与作物育种第4页 植物细胞工程植物细胞工程（plant cell plant cell engineeringengineering）是以植物组织和细胞培养技是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来一门学科。它以细胞为术为基础发展起来一门学科。它以细胞为基本单位，在体外（基本单位，在体外（in vitroin vitro）条件下进）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞一些生物学行培养、繁殖或人为地使细胞一些生物学特征按人们意愿生产某种物质过程。特征按人们意愿生产某种物质过程。第5页 细胞工程与作物遗传改良有着亲细胞工程与作物遗传改良有着亲密关系，利用细胞工程技术已培育出密关系，利用细胞工程技术已培育出一些大面积推广品种。一些大面积推广品种。第6页早期，哈布兰特在前人细胞学说影早期，哈布兰特在前人细胞学说影响下，提出响下，提出高等植物组织和器官能够高等植物组织和器官能够不停分割不停分割，并深入提出了，并深入提出了植物细胞全植物细胞全能性（能性（celltotipotency）理论。）理论。第7页植物细胞全能性是植物细胞工植物细胞全能性是植物细胞工程理论基础程理论基础。细胞全能性是指细胞细胞全能性是指细胞所含有形成各种细胞类型潜在能力，所含有形成各种细胞类型潜在能力，也包含植物细胞经脱分化再形成植也包含植物细胞经脱分化再形成植株能力。株能力。第8页 19，Hanning用萝卜胚培养，取得小植株，为组织培养工作奠定了基础。第9页1934年，年，White对番茄切段进行培对番茄切段进行培养，建立了第一个活跃生长无性繁殖系，养，建立了第一个活跃生长无性繁殖系，取得了离体培养真正成功。取得了离体培养真正成功。三年后，三年后，White又发觉又发觉B族维生素对族维生素对培养物生长有主要作用。培养物生长有主要作用。第10页经过几年努力，以经过几年努力，以White为主几为主几位科学家建立了植物组织培养位科学家建立了植物组织培养（plainttissueculture）综合培养）综合培养基，成为以后各种培养基基础。基，成为以后各种培养基基础。第11页1948年，年，Skoog等发觉腺嘌呤等发觉腺嘌呤/生长素生长素百分比是控制芽和根分化决定原因之一，这百分比是控制芽和根分化决定原因之一，这一发觉成为植物组织培养中控制器官形成激一发觉成为植物组织培养中控制器官形成激素模式。素模式。Miller（1956）发觉激动素比腺嘌呤更）发觉激动素比腺嘌呤更能促进芽形成。能促进芽形成。第12页1958年，年，Stewart&Shautz从胡萝卜从胡萝卜根根悬浮细胞悬浮细胞诱导分化成完整小植株，使诱导分化成完整小植株，使50多多年前哈布兰特提出细胞全能性假说首次得到科年前哈布兰特提出细胞全能性假说首次得到科学验证，这一结果大大加速了植物组织培养研学验证，这一结果大大加速了植物组织培养研究发展。究发展。1964年，年，Guha等从曼佗罗等从曼佗罗花药花药培养出培养出单倍体植株。单倍体植株。第13页1970年，年，Kameya等利用等利用花粉花粉培养取培养取得单倍体植株。得单倍体植株。1971年，年，Takebe等首次从烟草等首次从烟草原生质原生质体体取得再生植株；取得再生植株；1972年，年，Carlson等取得第一个烟草等取得第一个烟草种种间体细胞杂种间体细胞杂种植株。植株。第14页至此，在愈伤组织水平、单个细胞至此，在愈伤组织水平、单个细胞水平、单个生殖细胞水平、原生质体水水平、单个生殖细胞水平、原生质体水平和体细胞杂种水平都取得了完整植株，平和体细胞杂种水平都取得了完整植株，充分证实了植物细胞全能性。充分证实了植物细胞全能性。植物组织培养流程示意图以下。植物组织培养流程示意图以下。第15页外植体起源外植体起源外植体培养外植体培养愈伤组愈伤组织织再生小植株再生小植株再生植株再生植株第16页植物细胞工程应用在植物细胞工程应用在20世纪世纪60年年代就已受到重视，但真正应用研究在代就已受到重视，但真正应用研究在70年代才进入高潮。我国第一个用花药培年代才进入高潮。我国第一个用花药培养育成烟草品种，随即又育成了一些水养育成烟草品种，随即又育成了一些水稻、小麦新品种。稻、小麦新品种。第17页经济植物经济植物快繁与脱毒快繁与脱毒、体细胞变异筛选、体细胞变异筛选、新种质创造、细胞器移植、新种质创造、细胞器移植、DNA导入等均对导入等均对作物改良和农业生产起到了促进作用。作物改良和农业生产起到了促进作用。第18页一、一、植物细胞和组织培养技术植物细胞和组织培养技术第19页（一）培养基及其组成（一）培养基及其组成第20页 1 1、培养基（、培养基（MediumMedium）种类和特）种类和特点点惯用培养基有惯用培养基有MS、B5、White、N6、KM-8p、SH等。等。第21页2、培养基成份、培养基成份培养基中都应包含植物生长必需培养基中都应包含植物生长必需16种营种营养元素和一些生理活性物质，通常将这些物养元素和一些生理活性物质，通常将这些物质分为三大类，即无机营养物、有机物质和质分为三大类，即无机营养物、有机物质和植物生长调整物质（表）。植物生长调整物质（表）。第22页表表植物组织培养所需养分和激素植物组织培养所需养分和激素水水有机物有机物大量元素大量元素微量元素微量元素PH糖糖NFeCo氨基酸氨基酸PZnNi维生素维生素KBAl生长素生长素CaMnMo细胞分裂素细胞分裂素MgCuI调整物质调整物质赤霉素赤霉素S脱落酸脱落酸乙烯乙烯酵母提取物酵母提取物椰子汁椰子汁成份不定物质成份不定物质植物提取物植物提取物水解酪蛋白水解酪蛋白蛋白胨蛋白胨第23页（二）培养基配制（二）培养基配制第24页1、母液配制、母液配制为了为了降低配制培养基时每次称量药降低配制培养基时每次称量药品麻烦，降低极微量药品在每次称重时品麻烦，降低极微量药品在每次称重时误差误差，普通先配制，普通先配制高浓度贮备液，即高浓度贮备液，即母母液液。第25页大量元素可配成大量元素可配成10倍母液倍母液，使用，使用时每配制时每配制1000ml培养基需要从母液培养基需要从母液中取中取100ml。配制母液时应做到分别。配制母液时应做到分别称量，充分溶解，在混合次序上应最称量，充分溶解，在混合次序上应最终加入终加入Ca2+，混合时要边加边，混合时要边加边混合。混合。第26页微量元素因为使用量低，普通配微量元素因为使用量低，普通配成成100倍甚至倍甚至1000倍母液倍母液，使用时每配，使用时每配制制1L培养基从母液中取培养基从母液中取10ml或或1ml，配制时应注意充分溶解后再依次混合。配制时应注意充分溶解后再依次混合。第27页 第三种母液即铁盐，第三种母液即铁盐，铁盐必须单铁盐必须单独配制，独配制，若与其它元素混合易造成沉若与其它元素混合易造成沉淀。淀。普通采取鳌合铁普通采取鳌合铁，即，即FeSO4与与EDTA钠盐混合物，普通扩大钠盐混合物，普通扩大200倍。倍。第28页 EDTA钠盐须用温水溶解，然钠盐须用温水溶解，然后与后与FeSO4液混合，在液混合，在7580之间让其鳌合之间让其鳌合1h。使用鳌合铁目使用鳌合铁目标是防止沉淀，并使培养基能迟缓标是防止沉淀，并使培养基能迟缓不停地供给不停地供给Fe+。第29页 第四种母液为有机化合物母液，主要是第四种母液为有机化合物母液，主要是维生素和氨基酸类物质，维生素和氨基酸类物质，这类物质不能配成这类物质不能配成混合母液，混合母液，一定要分别配成单独母液，一定要分别配成单独母液，浓度浓度为每毫升含为每毫升含0.1、1、10mg，使用时依据，使用时依据需要量取。需要量取。第30页最终一个母液是激素，最终一个母液是激素，每种激素每种激素应单独配制母液应单独配制母液，其浓度为，其浓度为0.1、0.5或或1.0mg/ml。各种激素难溶于水，。各种激素难溶于水，配制时应注意溶解次序。配制时应注意溶解次序。第31页IAA、NAA、GA3、玉米素先溶于少、玉米素先溶于少许许95%酒精，再加水定容；酒精，再加水定容；NAA可溶于热可溶于热水或少许酒精后，再加水定容；水或少许酒精后，再加水定容；2，4-D不不溶于水，可用溶于水，可用1molNaOH溶解后再定容；溶解后再定容；KT和和BA应先溶于少许应先溶于少许1molHCl中，然后中，然后定容。定容。第32页表表一些植物组织培养基成份（一些植物组织培养基成份（mg/L）-成份成份MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-大量元素大量元素NH4NO31650-1650-720-16501200KNO319002527.51900809502500-19001900CaCl2 2H2O440150-20075440440CaCl2-440-166-MgSO4 7H2O370246.5370750185400250370370KH2PO4170-170-68-170340NH4H2PO4-340-（NH4）2SO4-134-Ca（NO3）2 4H2O-300-NaNO3-600-NaH2PO4 H2O-150-19-125-KCl-65-750-第33页-成份成份MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-微量元素微量元素KI 0.83 0.75 3.32 0.75 -1 0.01 0.83 -KI 0.83 0.75 3.32 0.75 -1 0.01 0.83 -H H3 3BOBO3 3 6.2 3 24.8 1.5 10 5 1 6.2 0.63 6.2 3 24.8 1.5 10 5 1 6.2 0.63MnSOMnSO4 44H4H2 2O 22.3 -89.2 5 25 -0.1 22.3 2.23O 22.3 -89.2 5 25 -0.1 22.3 2.23MnSOMnSO4 4HH2 2O -10 -10 -O -10 -10 -Zn SOZn SO4 47H7H2 2O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6 -O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6 -Zn SOZn SO4 44H4H2 2O -O -Zn NaZn Na2 2EDTA -15EDTA -15NaNa2 2MoOMoO4 42H2H2 2O 0.25 0.25 1.0 -0.25 0.1 -0.25 0.025O 0.25 0.25 1.0 -0.25 0.1 -0.25 0.025MoOMoO3 3 -0.001 -0.001 -Cu SOCu SO4 4 -0.2 -0.2 -Cu SOCu SO4 45H5H2 2O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025 -0.03 0.025 0.0025O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025 -0.03 0.025 0.0025CoClCoCl2 26H6H2 2O 0.025 0.025 0.1 -0.1 -0.025 0.0025O 0.025 0.025 0.1 -0.1 -0.025 0.0025CoSOCoSO4 47H7H2 2O -0.03 -O -0.03 -AlClAlCl3 3 -NiClNiCl2 26H6H2 2O -0.03 -O -0.03 -第34页-铁盐成份铁盐成份MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-FeCl366H2O-1-Fe2(SO4)3-2.5-FeSO477H2O27.8-27.8-27.815-27.827.8Na2EDTA2HEDTA2H2 2O O37.3-37.3-37.320-37.337.3NaFe EDTA-28-1-第35页成份成份MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER有机物有机物盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.5110.010.50.5-0.5盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.110130.010.55-0.40.5烟酸烟酸0.5110.0555-0.5肌醇肌醇100100100-1001000-100-甘氨酸甘氨酸2-32-2脯氨酸脯氨酸-1381-叶酸叶酸-0.5-生物素生物素-0.05-蔗糖蔗糖3%2%3%2%2%3%-3%4%第36页2、培养基配制、培养基配制以配制以配制1L培养基为例，培养基配制方法培养基为例，培养基配制方法以下：以下：第37页混合各成份母液。取大量元素混合各成份母液。取大量元素母液母液100ml、微量元素母液、微量元素母液10ml、铁、铁盐母液盐母液5ml于一个于一个1L烧杯中，依次加烧杯中，依次加入有机成份和激素，并加水至入有机成份和激素，并加水至500ml。第38页熔化琼脂：称熔化琼脂：称78g琼脂和所需琼脂和所需蔗糖于另一蔗糖于另一1L烧杯中，加水至烧杯中，加水至500ml，待糖溶解后，加热使琼脂充分熔化。，待糖溶解后，加热使琼脂充分熔化。第39页将（将（1）和（）和（2）混合，搅拌均匀，）混合，搅拌均匀，补水至补水至1000ml。第40页调调PH。普通用。普通用0.1molNaOH或或1NHCl调调PH至所需至所需PH。普通。普通PH调至调至5.8，但，但也有也有PH调到调到7.0，不一样材料最适，不一样材料最适PH不一样。不一样。对培养基凝固来说，对培养基凝固来说，PH较高时，培养基过硬，较高时，培养基过硬，不便于培养材料吸收营养；不便于培养材料吸收营养；PH过低，低到过低，低到4.0以下时，培养基极难凝固。以下时，培养基极难凝固。第41页分装：将培养基分装于分装：将培养基分装于100ml或或50ml三角瓶中，每瓶三角瓶中，每瓶50或或30ml左左右，封口包装。右，封口包装。第42页灭菌：普通用灭菌：普通用1.1kg/cm2压力，压力，在在121下灭菌下灭菌1520min。灭菌时间。灭菌时间应依据材料掌握。时间短，灭菌不彻底；应依据材料掌握。时间短，灭菌不彻底；时间长，会引发培养基成份降解。时间长，会引发培养基成份降解。第43页放置备用。灭菌后取出培养瓶放置备用。灭菌后取出培养瓶放置在培养台上，使之冷却凝固。培放置在培养台上，使之冷却凝固。培养瓶应平放，以免形成斜面。养瓶应平放，以免形成斜面。第44页（三）无菌操作方法（三）无菌操作方法第45页1、消毒剂、消毒剂在接种前，必须使材料完全无菌，这是在接种前，必须使材料完全无菌，这是取得植物组织培养成功基本确保。要确保这取得植物组织培养成功基本确保。要确保这一点，取材时应选取植物组织内部无菌材料。一点，取材时应选取植物组织内部无菌材料。从健壮植株上取材，不要有伤口；严格预防从健壮植株上取材，不要有伤口；严格预防病虫。病虫。第46页应在晴天取材，最好中午或下午取材。应在晴天取材，最好中午或下午取材。最好防止选取田间材料，选取无菌苗很好。最好防止选取田间材料，选取无菌苗很好。非要用田间材料时，为防止消毒困难，可将非要用田间材料时，为防止消毒困难，可将材料种在大棚或生长箱里。惯用消毒剂见表。材料种在大棚或生长箱里。惯用消毒剂见表。第47页表表植物材料消毒惯用消毒剂及使用方法植物材料消毒惯用消毒剂及使用方法-消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度消除难易消除难易消毒时间消毒时间消毒效果消毒效果（%）（min）-次氯酸钠次氯酸钠2易易530很好很好次氯酸钙次氯酸钙910易易530很好很好漂白粉漂白粉饱和溶液饱和溶液易易530很好很好氯化汞氯化汞0.11.0较难较难210最好最好酒精酒精7075易易0.22好好H2O21012最易最易515好好溴水溴水12 易易210很好很好AgNO31较难较难530好好抗生素抗生素450mg/L中中3060很好很好第48页对于难消毒材料，如有茸毛、粗糙不平对于难消毒材料，如有茸毛、粗糙不平材料等，在消毒前，普通先用肥皂水洗，自材料等，在消毒前，普通先用肥皂水洗，自来水冲净，在来水冲净，在70%酒精或酒精或1LHCl中浸中浸30s，再加入消毒剂。不一样材料消毒方式和所，再加入消毒剂。不一样材料消毒方式和所需时间不一样，研究者应依据不一样材料确需时间不一样，研究者应依据不一样材料确定详细消毒方案。定详细消毒方案。第49页2、无菌操作、无菌操作准备好接种材料用培养基、待消毒材料、准备好接种材料用培养基、待消毒材料、无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、无菌无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、无菌操作工具（如剪刀、镊子、解剖刀等，这些工操作工具（如剪刀、镊子、解剖刀等，这些工具可用高温消毒，也可用高压高温灭菌，也可具可用高温消毒，也可用高压高温灭菌，也可随用随消毒）、随用随消毒）、70%酒精等。酒精等。第50页将超净工作台打开，让其运行将超净工作台打开，让其运行10min左左右，在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖，右，在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖，将将HgCl2（0.1%）倒入有待消毒材料烧杯中，）倒入有待消毒材料烧杯中，510min后取出另一盛有没有菌水烧杯中，后取出另一盛有没有菌水烧杯中，无菌水冲洗无菌水冲洗34次，然后将材料取出接种在培次，然后将材料取出接种在培养基中，封口，放入培养室培养。养基中，封口，放入培养室培养。第51页无菌操作时应注意下面几个问题：整过无菌操作时应注意下面几个问题：整过操作过程一切用具必须一直保持无菌状态；操作过程一切用具必须一直保持无菌状态；无菌操作前必须用肥皂洗手，然后用无菌操作前必须用肥皂洗手，然后用70%酒酒精洗手；操作时无菌器皿一旦打开，应尽可精洗手；操作时无菌器皿一旦打开，应尽可能防止手再从其上横过；防止强呼吸，呼吸能防止手再从其上横过；防止强呼吸，呼吸时应将脸移开超净台；每次重新操作都要把时应将脸移开超净台；每次重新操作都要把工具在火焰上消毒，防止交叉污染。工具在火焰上消毒，防止交叉污染。第52页3、无菌培养、无菌培养材料接种后移入培养室培养，普通材料接种后移入培养室培养，普通培养室要求非常卫生，恒温，有理想光培养室要求非常卫生，恒温，有理想光照控制系统，普通材料要求照控制系统，普通材料要求25左右，左右，晚上普通不低于晚上普通不低于20。第53页二、二、细胞和组织培养与作物育种细胞和组织培养与作物育种第54页（一）（一）体细胞克隆变异及其育种利用体细胞克隆变异及其育种利用第55页在近在近50年中，以植物组织培养年中，以植物组织培养为基础生物技术研究与发展为植物育为基础生物技术研究与发展为植物育种提供了一些新试验方法和伎俩，而种提供了一些新试验方法和伎俩，而且培养出一些在生产上有利用价值品且培养出一些在生产上有利用价值品种。种。第56页体细胞克隆变异指植物组织和体细体细胞克隆变异指植物组织和体细胞培养物在培养过程中产生变异胞培养物在培养过程中产生变异。Larkin等（等（1981）在其综述文章中开始）在其综述文章中开始使用使用“体细胞克隆变异体细胞克隆变异”（somaclonalvariation）这一概念。）这一概念。第57页 为了区分起源于体细胞和单倍体细胞变异，Evans未来自配子体组织变异称为“配子体克隆变异”（gametoclonal variation），以与体细胞克隆变异区分开。第58页对于遗传变异分析而言，对于遗传变异分析而言，Orton为了统为了统一术语，引进了一术语，引进了R0、R1、R2等，分别表示等，分别表示再再生生当代、自交第一代、第二代等，至今这一当代、自交第一代、第二代等，至今这一概念还在广泛应用。概念还在广泛应用。第59页1、体细胞克隆变异遗传基础、体细胞克隆变异遗传基础（1）染色体数目变异）染色体数目变异最多最多见是多倍体，主要是培养基中使用见是多倍体，主要是培养基中使用了细胞分裂素。了细胞分裂素。第60页变异大小与培养状态、年纪、原变异大小与培养状态、年纪、原始材料倍性及培养时期相关。研究发始材料倍性及培养时期相关。研究发觉：二倍体变异频率随培养时间延长觉：二倍体变异频率随培养时间延长而降低，四倍体变异频率却随培养时而降低，四倍体变异频率却随培养时间延长而增加。间延长而增加。第61页（2）染色体结构变异）染色体结构变异染色体结构变染色体结构变异似乎是体细胞克隆变异主要起源，最主要是异似乎是体细胞克隆变异主要起源，最主要是染色体缺失、倒位、重复和异位。很多体细胞染色体缺失、倒位、重复和异位。很多体细胞再生株减数分裂时形成多价体、染色体桥、小再生株减数分裂时形成多价体、染色体桥、小片段、环等，充分说明了染色体结构变异存在。片段、环等，充分说明了染色体结构变异存在。第62页（3）点突变）点突变这类突变可分为各种类这类突变可分为各种类型，一个类型是型，一个类型是自发突变自发突变，最早证实点突变，最早证实点突变存在是从烟草中利用体外筛选取得抗存在是从烟草中利用体外筛选取得抗chlorsulfuron突变体。很多经过细胞筛选取突变体。很多经过细胞筛选取得抗病、抗除草剂等突变体属于这类。得抗病、抗除草剂等突变体属于这类。第63页另一个点突变是诱发突变，培养另一个点突变是诱发突变，培养基中加入化学诱变剂或进行诱变处理。基中加入化学诱变剂或进行诱变处理。因为培养过程中，培养物一直处于诱因为培养过程中，培养物一直处于诱变环境条件下，所以突变终究是变环境条件下，所以突变终究是自发自发还是还是诱发诱发极难搞清楚。极难搞清楚。第64页第三种点突变是第三种点突变是基因表示及基因放大或基因表示及基因放大或衰减。衰减。高等植物一些基因在发育过程中受到高等植物一些基因在发育过程中受到某一环境刺激，能够某一环境刺激，能够放大自己，即基因拷贝放大自己，即基因拷贝数大量增加数大量增加，这意味着该基因转录，这意味着该基因转录mRNA及及蛋白质增加。最初在动物细胞培养中发觉这蛋白质增加。最初在动物细胞培养中发觉这一现象，以后在植物中发觉也存在。一现象，以后在植物中发觉也存在。第65页比如，对某一物质抗性，能够经过逐步比如，对某一物质抗性，能够经过逐步增加浓度方法而使细胞对该物质抗性提升很增加浓度方法而使细胞对该物质抗性提升很多倍，这就是基因放大系统存在很好例证。多倍，这就是基因放大系统存在很好例证。一样，也发觉植物细胞一样，也发觉植物细胞DNA丢失（衰减），丢失（衰减），如大豆悬浮系经过较长时间培养，其核糖体如大豆悬浮系经过较长时间培养，其核糖体基因丢失了基因丢失了1/3。第66页第四种点突变是有丝分裂交换。这种交第四种点突变是有丝分裂交换。这种交换尽管很微弱地改变了基因次序，但仍影响换尽管很微弱地改变了基因次序，但仍影响基因表示。这种改变包含：某一基因拷贝丢基因表示。这种改变包含：某一基因拷贝丢失，某一基因拷贝重复或修复过程中基因转失，某一基因拷贝重复或修复过程中基因转变。变。第67页转座因子也是造成体细胞突变原因之一，转座因子也是造成体细胞突变原因之一，转座子经过插入与解离使一些基因表示受到转座子经过插入与解离使一些基因表示受到调控。调控。第68页最终细胞质基因叶绿体和线粒体基因也最终细胞质基因叶绿体和线粒体基因也能发生突变。能发生突变。Gengenbachetal（1975）利用玉米利用玉米T小种毒素筛选取得了抗小种毒素筛选取得了抗T小种细胞小种细胞系，这个基因已知位于胞质中。系，这个基因已知位于胞质中。第69页离体培养细胞会产生各种类型突变离体培养细胞会产生各种类型突变体，除抗性突变体外，还有形态性状突体，除抗性突变体外，还有形态性状突变体、不育性、产量和品质性状改变等。变体、不育性、产量和品质性状改变等。形态变异如矮化性、叶型等，利用这些形态变异如矮化性、叶型等，利用这些变异能够进行高光效育种。变异能够进行高光效育种。第70页培养再生植株中出现不育性频率较高，培养再生植株中出现不育性频率较高，但大多为核基因突变，能够用来培育不育系。但大多为核基因突变，能够用来培育不育系。产量和品质突变必须在田间经过适当分析才产量和品质突变必须在田间经过适当分析才能确定。试验室内细胞水平突变体筛选多数能确定。试验室内细胞水平突变体筛选多数在抗性突变体方面开展工作，如抗病、耐盐、在抗性突变体方面开展工作，如抗病、耐盐、抗重金属等。抗重金属等。第71页2、突变体筛选、突变体筛选为了增加突变频率，需要进行诱变处理。为了增加突变频率，需要进行诱变处理。将外植体、愈伤或悬浮系用诱变剂处理，如将外植体、愈伤或悬浮系用诱变剂处理，如使用化学诱变剂，要充分洗涤后再进入下一使用化学诱变剂，要充分洗涤后再进入下一步工作。使用多大剂量和处理多长时间才能步工作。使用多大剂量和处理多长时间才能到达很好诱变效果，应依据详细试验确定。到达很好诱变效果，应依据详细试验确定。第72页在突变体筛选中常采取两种选择法，即在突变体筛选中常采取两种选择法，即一步筛选法和多步筛选法。一步筛选法和多步筛选法。一步筛选法是一步筛选法是将培养物接种在含有最低将培养物接种在含有最低全部致死剂量培养基上全部致死剂量培养基上，表现出生长培养物，表现出生长培养物再转移到含有抑制剂新鲜培养基上。再转移到含有抑制剂新鲜培养基上。第73页能够看出，这种方法是一次就把能够看出，这种方法是一次就把筛选压设定很高筛选压设定很高，使不抗细胞（野生，使不抗细胞（野生细胞）完全不可能生长，筛选出能生细胞）完全不可能生长，筛选出能生长细胞即为耐（抗）性细胞系。长细胞即为耐（抗）性细胞系。第74页但在有些情况下这种方法不一定实用，但在有些情况下这种方法不一定实用，有细胞在超出最低全部致死浓度时，细胞均有细胞在超出最低全部致死浓度时，细胞均死亡，或单个细胞不能生存。多步筛选法是死亡，或单个细胞不能生存。多步筛选法是首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，每次首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，每次继代将上代能生长细胞系继代到筛选剂浓度继代将上代能生长细胞系继代到筛选剂浓度提升新鲜培养基上。提升新鲜培养基上。第75页在这种筛选体制下，抗性细胞应在这种筛选体制下，抗性细胞应该比野生细胞长快，经过逐步增加筛该比野生细胞长快，经过逐步增加筛选剂水平，最终会筛选出在抑制剂超选剂水平，最终会筛选出在抑制剂超出最低全部致死浓度时也能旺盛生长出最低全部致死浓度时也能旺盛生长细胞系。细胞系。第76页不过，去除抑制剂后，抗性培养物稳定不过，去除抑制剂后，抗性培养物稳定性是常出现一个问题，抗性丢失来自很多原性是常出现一个问题，抗性丢失来自很多原因，包含细胞对抑制剂生理适应。可见，多因，包含细胞对抑制剂生理适应。可见，多步筛选易取得在某一抑制剂水平下，细胞稳步筛选易取得在某一抑制剂水平下，细胞稳定生长细胞系。定生长细胞系。第77页筛选材料对象能够是原生质体、愈伤筛选材料对象能够是原生质体、愈伤块、悬浮培养物和花粉块、悬浮培养物和花粉/小孢子培养物。利小孢子培养物。利用原生质体进行抗性筛选有一大优点：筛用原生质体进行抗性筛选有一大优点：筛选出克隆极有可能来自单细胞，不过操作选出克隆极有可能来自单细胞，不过操作困难。困难。第78页利用愈伤块筛选是最简单方法，但这种利用愈伤块筛选是最简单方法，但这种筛选存在一定缺点，愈伤块里各个细胞不能筛选存在一定缺点，愈伤块里各个细胞不能均等地接触抑制剂，下部愈伤细胞比上部细均等地接触抑制剂，下部愈伤细胞比上部细胞吸收到较多抑制剂，这么就使筛选结果在胞吸收到较多抑制剂，这么就使筛选结果在一定程度上失去可靠性。一定程度上失去可靠性。第79页悬浮细胞筛选也很惯用，细胞接触选择悬浮细胞筛选也很惯用，细胞接触选择剂较均匀，但存在一定操作复杂性。花粉剂较均匀，但存在一定操作复杂性。花粉/小孢子培养物用于突变体筛选有一定优势，小孢子培养物用于突变体筛选有一定优势，突变体很轻易表现出来，也很易纯合。突变体很轻易表现出来，也很易纯合。第80页3、在作物改良上应用、在作物改良上应用利用上述方法便可筛选体细胞克隆变利用上述方法便可筛选体细胞克隆变异，将这一技术应用于作物改良技术路线异，将这一技术应用于作物改良技术路线见图。见图。第81页优良品种优良品种细胞培养细胞培养R0R1群体群体改良体细胞克隆改良体细胞克隆确定遗传方式确定遗传方式田间试验田间试验遗传稳定性测试遗传稳定性测试多点田间试验多点田间试验育成新品系育成新品系继续田间试验，种子富集继续田间试验，种子富集区域试验区域试验审审定定投入生产投入生产图图利用体细胞克隆变异育种技术路线利用体细胞克隆变异育种技术路线第82页（二）（二）单倍体细胞培养及育种利用单倍体细胞培养及育种利用第83页1、单倍体细胞培养在遗传和育种中应用价值、单倍体细胞培养在遗传和育种中应用价值花药培养（花药培养（antherculture）是指在取得）是指在取得单倍体一个技术，之后，花粉和小孢子培养逐单倍体一个技术，之后，花粉和小孢子培养逐步取得成功，从而使单倍体细胞培养体系愈加步取得成功，从而使单倍体细胞培养体系愈加完善。单倍体在遗传和育种研究中有以下优点：完善。单倍体在遗传和育种研究中有以下优点：第84页（1）后代快速纯合）后代快速纯合经过单倍体快速经过单倍体快速产生纯系。在异花授粉作物中，可用单倍体产生纯系。在异花授粉作物中，可用单倍体产生加倍单倍体（产生加倍单倍体（DH系），从中筛选纯合自系），从中筛选纯合自交系用于杂交制种。因为加速纯合，从而就交系用于杂交制种。因为加速纯合，从而就缩短了育种周期（图）。缩短了育种周期（图）。第85页母本母本父本父本F1花药培养花药培养F2花粉植株花粉植株加倍加倍品系比较试验品系比较试验选择判定选择判定区域试验区域试验图图杂交育种与单倍体育种周期比较杂交育种与单倍体育种周期比较第86页（2）提升选择效率）提升选择效率假如某一性状受假如某一性状受一对基因控制，在一对基因控制，在AAaaF2中，纯合中，纯合AA个体只有个体只有1/4。如。如F1采取花药或花粉培养，采取花药或花粉培养，产生后代中产生后代中AA个体占个体占1/2，比常规杂交育，比常规杂交育种提升一倍。种提升一倍。第87页（3）排除杂种优势对后代选择干扰）排除杂种优势对后代选择干扰对于杂交育种来讲，因为低世代很多基因位对于杂交育种来讲，因为低世代很多基因位点尚处于杂合状态，会有不一样程度杂种优点尚处于杂合状态，会有不一样程度杂种优势表现，对个体选择会造成一定误差。采取势表现，对个体选择会造成一定误差。采取DH群体进行选择育种，因为各基因位点在群体进行选择育种，因为各基因位点在理论上均处于纯合状态，选择到变异能更大理论上均处于纯合状态，选择到变异能更大程度上代表真实变异。程度上代表真实变异。第88页（4）遗传研究良好材料体系）遗传研究良好材料体系单倍体单倍体是基因互作检测、遗传变异估是基因互作检测、遗传变异估计、连锁群构计、连锁群构建、建、QTL预计及定位等数量遗传学良好材料。预计及定位等数量遗传学良好材料。尤其是近代分子生物学发展，尤其是近代分子生物学发展，DH系成为分系成为分子标识作图良好群体，它在一定程度上成为子标识作图良好群体，它在一定程度上成为一个永久一个永久BC或或F2群体。群体。第89页（5）突变体筛选突变体筛选因为单倍体各基因因为单倍体各基因均处于纯合状态，突变体很轻易表现出来，均处于纯合状态，突变体很轻易表现出来，从而大大提升了抗性或其它突变体筛选效率，从而大大提升了抗性或其它突变体筛选效率，利用这一体系取得各种突变体事例已很多，利用这一体系取得各种突变体事例已很多，这里就不一一赘述。这里就不一一赘述。第90页2、离体培养条件下小孢子发育、离体培养条件下小孢子发育小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢子，然后经单核早期、单核靠边期、双核期子，然后经单核早期、单核靠边期、双核期（一个营养核和一个生殖核），最终抵达三核（一个营养核和一个生殖核），最终抵达三核期而成为成熟花粉粒。在离体培养条件下，花期而成为成熟花粉粒。在离体培养条件下，花粉正常发育路径受到抑制。粉正常发育路径受到抑制。第91页3、影响花药培养原因、影响花药培养原因（1）供体植株生长条件）供体植株生长条件供体植株生供体植株生长条件对培养效果有主要影响，有时只有在长条件对培养效果有主要影响，有时只有在控温、一定光周期和光强条件下，其花药才控温、一定光周期和光强条件下，其花药才能有反应。环境条件对于不一样植物种有很能有反应。环境条件对于不一样植物种有很大不一样，所以没有一个固定环境控制模式。大不一样，所以没有一个固定环境控制模式。第92页（2）供体植株年纪供体植株年纪供体植株对培养供体植株对培养效果也有一定影响，普通讲，开花早期植株效果也有一定影响，普通讲，开花早期植株花蕾易于培养。花蕾易于培养。第93页（3）花粉发育时期）花粉发育时期用于培养花蕾，用于培养花蕾，其花药内小孢子发育时期对培养效果有较大其花药内小孢子发育时期对培养效果有较大影响，但因物种而异。在烟草中，处于第一影响，但因物种而异。在烟草中，处于第一次有丝分裂期花粉效果最好，而在禾本科和次有丝分裂期花粉效果最好，而在禾本科和芸苔属中，单核早期最好。芸苔属中，单核早期最好。第94页（4）花蕾和花药预处理花蕾和花药预处理对于有些物种，培对于有些物种，培养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提升培养效养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提升培养效果。如大麦花药，果。如大麦花药，4处理处理28d，或，或7处理处理14d，能收到最好效果。可对整穗、小穗、甚至分离花药能收到最好效果。可对整穗、小穗、甚至分离花药施加预处理，只要注意处理期间不要与水接触。也施加预处理，只要注意处理期间不要与水接触。也有些人将花药接种后放在低温下预处理，不一样材有些人将花药接种后放在低温下预处理，不一样材料需不一样预处理方式，没有一个固定模式。料需不一样预处理方式，没有一个固定模式。第95页（5）培养基）培养基终究使用固体或液体培终究使用固体或液体培养基应依据培养材料要求定。多数情况下，养基应依据培养材料要求定。多数情况下，MSMS、N N6 6及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物中用较多。花药培养时往往需要一定渗透压，中用较多。花药培养时往往需要一定渗透压，有要求低浓度蔗糖（有要求低浓度蔗糖（2%2%4%4%），有要求高浓度），有要求高浓度蔗糖（蔗糖（8%8%12%）。）。第96页二细胞结构成熟花粉往往需低浓度糖，二细胞结构成熟花粉往往需低浓度糖，而三细胞结构成熟花粉植物往往需高渗条件，而三细胞结构成熟花粉植物往往需高渗条件，如油菜小孢子培养时，糖浓度可用到如油菜小孢子培养时，糖浓度可用到13%17%。培养基中所添加维生素和激素。培养基中所添加维生素和激素对培养效果可产生主要影响。对于一些植物对培养效果可产生主要影响。对于一些植物种来讲，添加某种植物提取物或椰汁能够改种来讲，添加某种植物提取物或椰汁能够改进培养效果。进培养效果。第97页（6）培养条件）培养条件多数植物在多数植物在25下培下培养能诱导愈伤组织，可一些植物，尤其是芸养能诱导愈伤组织，可