欧美进口紫花苜蓿可培养种带细菌及其对动植物的致病性_张振粉.pdf

第 32 卷第 4 期Vol.32，No.4161-1722023 年 4 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA张振粉，黄荣，姚博，等.欧美进口紫花苜蓿可培养种带细菌及其对动植物的致病性.草业学报，2023，32（4）：161172.ZHANG Zhen-fen，HUANG Rong，YAO Bo，et al.Culturable seed-borne bacteria of lucerne imported from Europe and North America and theirpathogenicity to plants and animals.Acta Prataculturae Sinica，2023，32（4）：161172.欧美进口紫花苜蓿可培养种带细菌及其对动植物的致病性张振粉1，2*，黄荣1，2，姚博1，2，张旺东3，杨成德4，陈秀蓉4（1.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070；2.草业生态系统教育部重点实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；4.甘肃农业大学植物保护学院，甘肃 兰州 730070）摘要：为了探究进口紫花苜蓿种带细菌的多样性及其对动植物的致病性，本研究从北美和欧洲共收集到紫花苜蓿种子样品 34份，所有样品经室内研磨稀释分离培养，共获得 39株种带细菌分离物，结合常规表型特征及 16S rDNA 鉴定方法确定它们的分类地位；并在室内采用菌悬液皿内发芽及盆栽接种法和腹腔注射法分别测定了 21株代表细菌对供试紫花苜蓿和昆明小鼠的致病性。结果显示：1）39株细菌隶属 3门 15属，门分别为厚壁菌门、变形菌门和放线菌门，其中优势门为厚壁菌门；属地位的分别为芽孢杆菌属、假单胞菌属、马赛菌属、短芽孢杆菌属、欧文氏菌属、泛菌属、不动杆菌属、肠杆菌属、埃希氏肠杆菌属、假芽孢杆菌属、假节杆菌属、红球菌属、葡萄球菌属、土壤芽孢杆菌属和微杆菌属，其中优势属为芽孢杆菌属和假单胞菌属。2）红球菌属 GCKH 菌株仅对紫花苜蓿致病；不动杆菌属ZSR17、埃希氏肠杆菌属 ZSR25和马赛菌属 R1菌株仅对小鼠具有致病性；而欧文氏菌属 ZF1和 ZS3、泛菌属 CQ10和 ZS6菌株既可以引起紫花苜蓿致病，又可以引起小白鼠发病，是潜在的植物和动物跨界侵染共致病病原细菌。研究结果初步探明了欧美进口紫花苜蓿种带细菌的分类地位及其危害性，为综合防控这一类通过牧草种子携带的植物和动物独立致病细菌，以及植物和动物跨界侵染共致病病原细菌的侵入和传播奠定了理论依据。关键词：紫花苜蓿；种带细菌；多样性；植物和动物跨界共患；病原细菌Culturable seed-borne bacteria of lucerne imported from Europe and NorthAmerica and their pathogenicity to plants and animalsZHANG Zhen-fen1，2*，HUANG Rong1，2，YAO Bo1，2，ZHANG Wang-dong3，YANG Cheng-de4，CHEN Xiu-rong41.College of Pratacultural Science，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Key Laboratory of GrasslandEcosystem，Ministry of Education，Sino-U.S.Center for Grassland Ecosystem Sustainability，Lanzhou 730070，China；3.College ofVeterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；4.College of Plant Protection，Gansu AgriculturalUniversity，Lanzhou 730070，ChinaAbstract：To explore the diversity of seed-borne bacteria of imported alfalfa（Medicago sativa）and theirpathogenicity to animals and plants，34 samples of lucerne seeds imported from North America and Europe werecollected and analyzed.After Petri-dish isolation and culture，39 seed-borne bacterial isolates were obtained.Thetaxonomic status of the bacterial isolates was determined through observations of phenotypic characteristics and 16SDOI：10.11686/cyxb2022311http：/收稿日期：2022-08-02；改回日期：2022-09-05基金项目：国家自然科学基金（32060369；31460639），兰州市人才创新创业项目（2019-RC-116），2020年度陇原创新创业人才项目，甘肃农业大学青年导师基金项目（GAU-QDFC-2019-08）和甘肃省杰出青年基金（20JR10RA562）资助。作者简介：张振粉（1984-），男，福建霞浦人，副教授，博士。E-mail： 通信作者 Corresponding author.Vol.32，No.4ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）rDNA amplicon sequencing.Twenty-one representative strains with potential pathogenicity were selected forevaluation in a plant model（alfalfa，M.sativa）and an animal model（mouse，Mus musculus）.Petri-dishes test andpot experiments were performed to study the impact of the bacterial isolates on alfalfa plants.The mouse infectionmodel consisted of intraperitoneal injection of a bacterial suspension（109CFU mL-1）at a dose of 0.1 mL 10 g-1.We found that the alfalfa seeds harbored a diverse community of bacteria.These bacterial isolates were grouped in 39morphospecies that corresponded to three phyla and 15 genera.Out of 39 isolates，24（61.54%）were Gram positiveand 15（38.46%）Gram negative.Among them，Firmicutes was the predominant phylum observed in all groups andBacillus was the dominant genus.The results of pathogenicity tests showed that bacterial strain GCKH（Rhodococcus sp.）was only pathogenic to alfalfa while ZSR17（Acinetobacter sp.），ZSR25（Escherichia sp.），and R1（Massilia sp.）were pathogenic to mice.Notably，ZF1（Erwinia sp.），ZS3（Erwinia sp.），CQ10（Pantoea sp.），and ZS6（Pantoea sp.）could cause disease in both alfalfa and mouse hosts，indicating that they arepotential co-pathogenic bacteria capable of cross-kingdom infection.The results provide a preliminary overview ofthe taxonomic status of seed-borne bacteria carried by lucerne seeds imported from Europe and America and thepotential harmfulness of these bacterial strains.These findings lay a theoretical foundation for the integratedmanagement and prevention of the invasion and transmission of the plant-pathogenic，animal-pathogenic，or co-pathogenic bacteria on forage seeds that have the potential to cause infections in plants and animals.Key words：lucerne；seed-borne bacteria；diversity；cross-kingdom co-pathogen of plants and animals；pathogenicbacteria紫花苜蓿（Medicago sativa）素有“牧草之王”的美誉，可用于青饲、青贮、加工草粉、调制青干草、配合饲料或混合饲料1-3；由于具有抗胆固醇、抗肿瘤和抗氧化等特性，紫花苜蓿芽也经常被人们食用4-5。紫花苜蓿是我国和北半球温带地区最主要的牧草和草田轮作的首选草种，在农牧业生产，应对全球气候变化，保障食物安全和增加农牧民收入等方面发挥着重要作用；但是其种子用量 80%以上都依赖进口，且主要来自北美和欧洲等地6-7。毋庸置疑，种带病菌通过植物种子生产、商业贸易和科技交流等活动进行传播8。而且，种子携带并传播病菌既是众多地区植物发生新病害的原因，又是导致动物疾病和人类食源性疾病的罪魁祸首9。国内外种子的频繁贸易，一方面增加了紫花苜蓿种带植物病原细菌的侵入和传播风险，进而限制紫花苜蓿的优质高产，如检疫病害细菌性萎蔫病（Clavibacter michiganense subsp.insidiosum）可造成苜蓿绝产10，桃色欧文氏菌菌株 Cp2对紫花苜 蓿 根 系 的 伸 长 和 生 长 有 很 强 的 抑 制 作 用11，以 及 紫 花 苜 蓿 芽 细 菌 性 腐 烂 病（Enterobacter cloacae；Pectobacterium chrysanthemi）和芽细菌性萎蔫病（Erwinia persicina）可分别造成紫花苜蓿幼苗减产 15%100%和 25%12-14；另一方面也增加了紫花苜蓿种带人畜共患或动物病原细菌的侵入和传播风险，对畜产品安全和人类健康是一个巨大的隐患，如食用带有肠道沙门氏菌的不同血清型：新港沙门氏菌（Salmonella enterica serovarnewport）、疯 牛 沙 门 氏 菌（Salmonella enterica serovar bovismorbificans）以 及 大 肠 埃 希 氏 菌（Escbericbia coli）O157 H7等病原细菌的苜蓿芽因通过型分泌装置将细菌毒力蛋白运送至宿主细胞中，导致宿主细胞的功能如信号传导路径、细胞骨架结构、膜转运以及细胞因子的表达改变等而导致的食源性疾病疫情时有发生10，14-16。综上所述，紫花苜蓿种子贸易等活动将造成种带病原细菌的侵入和传播，从而威胁紫花苜蓿产量以及产生食源性人畜共患病事件，而紫花苜蓿种带病原细菌的种类和分类地位及其在草地-动物界面中的危害性研究却少有报道。加强紫花苜蓿安全生产管理和动物源性细菌病的预防、控制和对策研究，是保障我国饲料、畜产品优质高产和提高食品安全水平的关键之一17。紫花苜蓿安全是肉和奶等动物源性畜产品安全的基础，直接关系到生态安全和人类的健康。为此，本研究通过分离鉴定紫花苜蓿种带细菌，初步确定其对紫花苜蓿和小鼠的危害性，为探明紫花苜蓿种带病原细菌在草畜系统中的潜在威胁及综合防控种带病原细菌侵入和传播提供理论依据。162第 32 卷第 4 期草业学报 2023 年1材料与方法1.1试验材料供试种样收集自北美和欧洲的不同紫花苜蓿种植区，共 34份，于 5 恒温保藏，其相关信息见表 1。采用营养琼脂培养基（nutrient agar，NA）：牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂 15.020.0 g，水 1000 mL，pH7.07.2，121 灭菌 20 min，倒培养基备用，进行种带细菌的分离和纯化。无特定病原体（specific pathogen free，SPF）昆明（Kunming，KM）小鼠（Mus musculus）（每只净重 202 g）由兰州大学动物实验中心提供。表 1供试种样的来源及相关信息Table 1Origin and information of seed samples tested编号CodeLot1Lot2Lot3Lot4Lot5Lot6Lot7Lot8Lot9Lot10Lot11Lot12Lot13Lot14Lot15Lot16Lot17Lot18Lot19Lot20Lot21Lot22Lot23Lot24Lot25Lot26Lot27Lot28Lot29Lot30Lot31Lot32Lot33Lot34紫花苜蓿品种M.sativa variety皇冠 PhabulousSR4030巨能 551 Magnum 551耐盐之星 Magnum Salt斯贝德 Spade维多利亚 Victory巨能 995 Magnum 995英斯特 Inster威神 VisionMT4015驯鹿 CaribouSK3010巨能 7 Magnum 7MF4020巨能 601 Magnum 601巨能 7-耐湿 Magnum 7-Wet巨能 2 Magnum 2巨能 801 Magnum 801旱地 Handi金皇后 Golden empress阿尔冈金 Algonguin梅佐 Mezzo直布罗陀 Gibraltar超新星 Super Nova特蕾莎 TEREZA法多 FADO劲能 4.2 Power 4.2玛格达 Magda富通 Fortune瑞诺 Creno萨斯卡娅 SaskiaPS2065MF希模 Sibemol莎莎 Salsa产地Production region北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America北美 North America欧洲 Europe欧洲 Europe欧洲 Europe欧洲 Europe欧洲 Europe欧洲 Europe欧洲 Europe欧洲 Europe欧洲 Europe欧洲 Europe欧洲 Europe欧洲 Europe欧洲 Europe生产年份Production year2014201420142014201420142014201420142014201420142014201420142014201420142014201420152015201520152015201520152015201520152015201520152015提供者Seed provider北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company北京克劳沃公司 Beijing Clover Company丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc丹农种子集团 Dannong Seeds Bloc163Vol.32，No.4ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）1.2种带细菌的分离采用稀释涂布平板法分离培养。分别称取 34种紫花苜蓿种子 0.2 g，分为消毒组和未消毒组。消毒组采用质量浓度为 75%的酒精浸泡 1 min，后转入 3%NaClO 溶液中浸泡 5 min，无菌水冲洗 34次；未消毒组不做任何处理，后分别加入 10 mL 无菌水进行研磨并逐步稀释配制 100、10-1、10-2和 10-34个稀释梯度浓度的菌悬液。各取 200 L 涂布于 NA 平板上，每梯度 3次重复，并以无菌蒸馏水接种为对照组18。涂板后置于 28 恒温培养 35 d后分离、纯化和保存。紫花苜蓿种带细菌分离工作于 2017年 6月-2018年 10月陆续进行。1.3种带细菌的数量及形态特征分析培养 35 d后，根据菌落形态、大小、光泽度和产色素等形态特征分类纯化并统计种带细菌数量、菌落数和前两位优势种群，后将纯化后的菌种 4 短暂保存于 NA斜面上，进行编号保藏备用，并采用革兰染色法区分革兰阳性（G+）和革兰阴性（G-）类群，并在生物学显微镜下测量细菌菌体大小19。种带细菌数量(CFUg-1)=5MD/W式中：M 为平均单皿菌落总数；D为稀释倍数；W 为种子质量（g）20。1.4种带细菌的分子鉴定及系统发育分析种带细菌 16S rDNA 基因序列扩增引物为通用引物 27F/1492R，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体方法参照说明书；扩增和检测方法参考文献 21，与 NCBI 数据库（http：/www.ncbi.nlm.nih-gov/blast.cgi）中序列进行相似性比较，并向 GenBank提交序列，后通过 Mega 7.0软件邻域连接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，并采用 Evolview软件对系统发育树进行注释和美化。1.5种带细菌的紫花苜蓿和昆明系小鼠致病性测定将已纯化的代表菌株制备成菌悬液（109CFU mL-1）后备用，菌悬液详细制作方法参照文献 22，各菌株对供试紫花苜蓿的室内致病性测定于 2019年 3月-2019年 11月进行。1.5.1紫花苜蓿皿内发芽侵染和盆栽侵染参照张振粉等22的方法，在室内条件下通过菌悬液（109CFU mL-1）接种皿内紫花苜蓿种子（每皿 50粒种子，5次重复）及针刺伤口接种盆栽生长 50 d后的紫花苜蓿叶片和茎杆（每盆 10株苜蓿，重复 5次），测定种带细菌代表菌株对紫花苜蓿的致病性。1.5.2昆明系小鼠腹腔注射侵染用无菌医用注射器（1 mL）吸取菌悬液 0.1 mL，采取腹腔注射法23将 0.1mL菌液注射到 SPF级 KM 小鼠体内（雌雄各半，体重 2025 g），对照组腹腔注射等量无菌水；处理组与对照组各10只，于笼中饲养。每隔 4 h观察并记录小鼠的活动情况和生命体征等。本试验于 2020年 3月-2020年 12月在甘肃农业大学动物医学院严格按照“甘肃农业大学实验动物福利伦理审查（GAU-LC-2020-35）”的要求进行。1.6数据分析使用 Microsoft Excel 2020对数据进行整理汇总及作图，其结果以“平均值标准误”（meanSE）表示。运用SPSS 26.0对数据进行单因素方差分析，研究种子处理（种子消毒及未消毒）对细菌总数量和菌落数的影响；采用t检验效应分析同一个单菌落在种子处理间的影响。2结果与分析2.1种带细菌的多样性从 34份欧美进口的紫花苜蓿种子上共分离得到 39株细菌分离物。各地种样在菌落形态、颜色和质地的多样性方面有明显的差异，且在种子数量和丰富度上也有较大差异，其中 39 株种带细菌纯化后单菌落形态特征如图 1。在所有供试紫花苜蓿品种中，除了种样 Lot4和 Lot27，其余未消毒处理组的种带细菌总数量均显著高于（P0.05）消毒组；采用种子表面消毒可以降低紫花苜蓿种带细菌群落多样性，且在种样 Lot11、Lot15、Lot16、Lot17、Lot23 和 Lot29 上显著下降（PLot21Lot8Lot25Lot20Lot26Lot11Lot14Lot34Lot19，细菌总数量最低的是 Lot6，为 6.30105CFU g-1；未消毒组的紫花苜蓿种样的种带细菌种群数最高的是 Lot23，前 10位的次序为：Lot23Lot16Lot15Lot17、Lot29Lot11、Lot19、Lot34Lot1、Lot3，最低的是 Lot4、Lot12 和 Lot27。消毒处理组的紫花苜蓿种样 Lot20 的种带细菌总数量为 6.70107CFU g-1，是供试的 34 种紫花苜蓿品种中最高的，且前 10 位排序分别为：Lot20Lot8Lot25Lot22Lot21Lot27Lot32Lot16Lot31Lot1，细菌总数量最低的是 Lot5，为 1.70105CFU g-1；消毒组的紫花苜蓿种样的种带细菌种群数较高的是 Lot2、Lot5、Lot6、Lot9、Lot13、Lot14、Lot17、Lot20、Lot25、Lot28、Lot29和 Lot32，最低的是 Lot3和 Lot26。不同产地来源的紫花苜蓿种带各优势细菌种群整体差异较小，但是不同品种间优势细菌种群差异较大。2.2种带细菌的分类地位39 株代表细菌经革兰染色，其中 24 株表现为革兰阳性（G+），占所有菌株的 61.54%；15 株为革兰阴性（G-），占比 38.46%；菌体为 0.190.57 m0.353.61 m 至 0.731.17 m3.8411.09 m。39 株细菌代表性菌株属于 3门 15属（表 3，图 2），其中归属于厚壁菌门（Firmicutes）的芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的细菌分离物 有 13 株，短 芽 孢 杆 菌 属（Brevibacillus sp.）3 株，假 芽 孢 杆 菌 属（Fictibacillus sp.）2 株，葡 萄 球 菌 属图 1紫花苜蓿种带细菌的单菌落形态特征Fig.1Morphological characteristics of single colony of alfalfa seed-borne bacteria不同字母和数字组合代表种带细菌菌株的编号。Different combinations of letters and numbers represent the number of bacterial strains.165Vol.32，No.4ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）（Staphylococcus sp.）1 株，土壤芽孢杆菌属（Terribacillus sp.）1株，微杆菌属（Microbacterium sp.）1株；属于变形菌门（Proteobacteria）的假单胞菌属（Pseudomonas sp.）5 株，马赛菌属（Massilia sp.）3 株，欧文氏菌属（Erwiniasp.）2株，泛菌属（Pantoea sp.）2株，不动杆菌属（Acinetobacter sp.）1株，肠杆菌属（Enterobacter sp.）1株，埃希氏肠杆菌属（Escherichia sp.）1株；属于放线菌门（Actinobacteria）的假节杆菌属（Pseudarthrobacter sp.）2株，红球菌属（Rhodococcus sp.）1株（表 3）。表 2不同产地紫花苜蓿种带细菌的种群及数量Table 2Seed-borne bacteria population and quantity of different varieties lucerne collected from the different locations编号CodeLot1Lot2Lot3Lot4Lot5Lot6Lot7Lot8Lot9Lot10Lot11Lot12Lot13Lot14Lot15Lot16Lot17Lot18Lot19Lot20Lot21Lot22Lot23Lot24Lot25Lot26Lot27Lot28Lot29Lot30Lot31Lot32Lot33Lot34种带细菌总数量Number of the colony（CFU g-1）未消毒 Non-sterilized1.70107p*5.16107j*8.80106q*1.43106s3.50106r*6.30105t*1.80107p*2.18108c*5.15107j*4.80107k*6.52107g*3.67107m*4.26107l*6.20107h*3.78107m*3.80107m*5.50107i*5.26107j*5.52107i*1.21108e*3.37108b*4.50108a*6.60106r*9.70106q*2.16108d*8.78107f*1.67107p3.26107n*5.25107j*2.78107o*4.80107k*5.50107i*5.26107j*5.53107i*消毒 Surface sterilized3.70106i3.30106ij1.15106no7.00105op1.70105p2.20105p2.00106m4.30107b8.00106g1.60106mn2.70106kl9.00106f1.70106mn2.20106lm2.00106m4.30106h8.00106g1.60106mn2.70105p6.70107a1.16107e1.50107d2.00105p3.70105p3.30107c1.11106no9.00106f1.70106mn2.20106lm2.00106m4.30106h8.00106g1.60106mn2.70106jk种带细菌种群数The number of bacterial population未消毒 Non-sterilized3.330.33e3.330.88e3.330.67e2.330.33e3.330.33e3.330.88e3.000.00e3.330.58e3.330.33e3.330.33e3.670.33de*2.330.33e3.330.67e3.330.67e6.000.58bc*7.330.33ab*5.330.33cd*3.330.33e3.670.67de2.670.67e3.000.58e2.670.67e7.670.88a*3.330.33e3.330.33e3.330.88e2.330.33e3.330.33e5.330.88cd*3.000.58e3.330.33e3.330.88e3.330.33e3.670.33de消毒 Surface sterilized2.330.33ab3.330.33a1.330.33b2.330.33ab3.330.88a3.330.33a2.000.58ab2.330.67ab3.330.33a2.330.33ab2.330.33ab2.330.33ab3.330.33a3.330.88a2.000.58ab2.330.33ab3.330.33a2.330.33ab2.330.33ab3.330.33a2.000.58ab2.330.33ab2.000.58ab2.330.88ab3.330.33a1.330.33b2.330.33ab3.330.33a3.330.88a2.000.58ab2.330.67ab3.330.33a2.330.33ab2.330.33ab优势种群（前 2位）The top two dominantbacterial populationZSR17，ZSR18ZF1，ZF23YCK6，YCK61ZSR20，ZSR21TM1，ZS3ZS6，CQ10CQ10，ZS6ZSR27，ZSR28YCK4，YCK5YCK2，ZFSH4ZSR33，ZSR30ZSR18，ZSR31ZSR19，ZSR32ZSR17，ZSR28ZF1，ZF23ZSR17，ZSR18ZF23，QH1ZF11，CH1ZF32，GCKHGCKH，R1R1，ZF1ZSR18，ZSR19YCK5，YCK51ZSR29，ZSR31ZSR30，ZSR32ZFSH3，ZFSH4TM1，YCK4TM1，QH1ZSR22，ZSR23ZS3，ZS6ZS3，CQ10ZSR23，ZSR24ZSR25，ZSR26CQ10，ZS3注：同列不同小写字母表示差异显著（P0.05），*表示同一个单菌落消毒和未消毒处理间差异显著（P0.05）。Note：Lowercase letters in the same column represent significant differences（P0.05），*means the same single colony has significant differencesbetween sterilized and non-sterilized treatments seed treatments（P0.05）.166第 32 卷第 4 期草业学报 2023 年表 339株紫花苜蓿种带细菌菌株的鉴定Table 3Identification of 39 bacterial strains from alfalfa seeds菌株StrainZSR17ZSR18ZSR19ZSR20ZSR21ZSR22ZSR23ZSR24ZSR25ZSR26ZSR27ZSR28ZSR29ZSR30ZSR31ZSR32ZSR33ZF9ZFSH2ZF1ZF23QH1ZF11CH1ZF32GCKHR1YCK61YCK6YCK51YCK5YCK4YCK2ZFSH4ZFSH3TM1ZS3ZS6CQ10大小Size（m）0.370.600.782.280.601.100.892.340.190.570.353.610.310.660.783.050.340.690.431.650.380.840.542.770.430.890.824.190.380.690.782.340.260.490.421.120.601.201.656.670.691.391.5711.540.250.560.692.860.541.202.045.960.531.031.847.730.621.332.727.570.460.941.525.770.601.621.463.460.731.173.8411.090.380.731.305.740.571.401.627.001.283.832.104.780.651.531.847.320.501.030.571.820.490.731.493.500.450.851.274.230.340.990.491.500.360.850.682.750.360.690.612.140.300.580.571.400.370.660.992.690.360.850.691.870.461.211.023.200.310.550.431.630.340.550.622.950.260.600.943.540.460.860.841.960.310.550.431.630.340.550.622.650.460.860.841.96革兰氏染色Gram stain-+-+-+-+-+-NCBI中相似菌株Similar strain不动杆菌属 Acinetobacter sp.假单胞菌属 Pseudomonas sp.肠杆菌属 Enterobacter sp.萎缩芽孢杆菌 Bacillus atrophaeus微杆菌属 Microbacterium sp.奇异假芽孢杆菌 Fictibacillus barbaricus耐寒短芽孢杆菌 Brevibacillus frigoritolerans浅黄假单胞菌 Pseudomonas luteola埃希氏菌属 Escherichia sp.内生芽孢杆菌 Bacillus endophyticus嗜盐土地芽孢杆菌 Terribacillus saccharophilus简单芽孢杆菌 Bacillus simplex简单芽孢杆菌 B.simplex简单芽孢杆菌 B.simplex奇异假芽孢杆菌 F.barbaricus简单芽孢杆菌 B.simplex耐寒短芽孢杆菌 B.frigoritolerans蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus短小芽孢杆菌 Bacillus pumilus欧文氏菌属 Erwinia sp.地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis蜡样芽孢杆菌 B.cereus蜡样芽孢杆菌 B.cereus葡萄球菌属 Staphylococcus sp.枯草芽孢