泮托拉唑钠倍半水合物原料药的细菌内毒素检查方法研究_陈程.pdf

4讨论4.1检测波长的考察以及色谱条件的优化取 2.2.2 项下的供试品溶液，按 2.1 项色谱条件，进样测定，并进行全波长扫描，对比不同波长图谱情况，结果可以得知莲须标准汤剂在300nm 处所得色谱信息最丰富，且基线较平稳，所以选择此波长作为测定波长。并且通过考察有机相种类(甲醇、乙腈)、水相(水、甲酸溶液、乙酸溶液)、有机酸的用量、柱温、流速等，对色谱条件进行了优化。4.2供试品溶液制备方法考察本实验依次考察了用不同的提取溶剂(水、70%乙醇、甲醇、70%甲醇)、提取方法(超声提取与回流提取)以及提取时间(20、30、60 min)制备供试品溶液制备，按峰分离度、峰个数、总峰面积等进行比较，结果表明以 70%甲醇提取峰较齐全，总峰面积较大，最终选取 70%甲醇作为提取溶剂;回流提取与超声提取效率差异较小，且色谱峰分离效果相当，确定采用相对更加便利的超声法制备供试品;超声时间为 20 min、30 min、60 min 时，主要峰总峰面积差异不大。为了保证提取完全并节约时间，选择超声时间为30 min。4.3指标成分的选择莲须主要化学成分为异槲皮苷、木犀草素、槲皮素等黄酮类成分。其中异槲皮苷是其主要的黄酮类成分之一，测定异槲皮苷含量，可以反映莲须的质量情况，可以作为莲须的质量控制指标。过往的文献含量测定一般用紫外分光光度法测定总黄酮的含量6，或者使用高效液相法(HPLC)测定槲皮素和木犀草素的含量7，8，未见有报道用超高效液相色谱法(UPLC)测定其中的异槲皮苷含量。本研究用超高效液相色谱法(UPLC)测定莲须中的异槲皮苷含量，并结合指纹图谱的方法，提供了一个较有效的莲须质量控制方法。5总结中药指纹图谱用于中药的质量控制，能够提供较为丰富的信息，有利于全面控制药材的质量，本研究建立莲须药材的指纹图谱，并建立莲须主要成分异槲皮苷的含量测定方法，测定和分析了不同产地 19 批莲须的指纹图谱和异槲皮苷含量情况，为莲须药材的全面质量控制提供了依据。参考文献1 国家药典委员会编.中国药典(一部)S.北京:中国医药科技出版社，2020，286.2 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草 M.上海:上海科技出版社，1999，3:404-405.3 高华娟，吴锦忠，黄泽豪，等.莲须药用研究进展 J.海峡药学，2006，18(3):20-22.4 李庆，郭爽，张建逵，等.莲须显微特征指数与化学成分相关性研究 J.中华中医药学刊，2018，36(2):348-350.5 荆瑞俊，姜小莹，侯书荣，等.毛细管电泳紫外检测法测定莲须中的槲皮素、木犀草素、山萘酚、异槲皮甙 J.分析化学，2007，35(8):1187-1190.6 苏本华，苏春英，孙静.分光光度法测定莲须中总黄酮的含量J.中医药信息，2011，28(3):81-83.7 孟宪生，沙明，曹爱民.HPLC 测定莲须中槲皮素和山萘酚的含量J.中成药，2003，25(12):1004-1006.8 李彦博，孙静.HPLC 法测定莲须中木犀草素的含量 J.实用药物与临床，2011，14(6):488-489.药物检验与分析泮托拉唑钠倍半水合物原料药的细菌内毒素检查方法研究陈程，刘均均，范昭泽，余艳平*(武汉九州钰民医药科技有限公司，湖北武汉 430071)摘要:目的为保证泮托拉唑钠倍半水合物原料药的使用安全，建立其细菌内毒素的检查方法。方法按照 2020 年版 中国药典(四部)附录 1143 收录的细菌内毒素检查方法，采用市售的两种厂家生产的鲎试剂对检测方法进行探究，建立了半定量凝胶法检测方法，对泮托拉唑钠倍半水合物原料药进行细菌内毒素检查和干扰试验。结果样品稀释至浓度为 1 mgmL1及以下可消除样品对检查的干扰;配制 0.5 mgmL1泮托拉唑钠倍半水合物原料药溶液供试品，采用灵敏度()为 0.25 EUmL1的鲎试剂检测细菌内毒素限度，样品含量小于 0.5 EUmg1，符合限度要求。结论所建立的方法可用于泮托拉唑钠倍半水合物原料药细菌内毒素的检查。关键词:泮托拉唑钠倍半水合物原料药;细菌内毒素;检查方法;凝胶法中图分类号:927文献标识码:A文章编号:1006-3765(2023)-02-0033-04作者简介:陈程(1992 )，男，硕士，工程师，从事创新药及仿制药的研发工作。通讯作者:余艳平(1982 )，男，硕士，高级工程师，从事创新药及仿制药的研发工作。基金项目:武汉东湖国家自主创新示范区 2021 年度“3551 光谷人才计划”项目Study on Bacterial Endotoxin Test of Pantoprazole Sodium Hemihydrate33Strait Pharmaceutical Journal Vol.35 No.2 2023APICHEN Cheng，LIU Jun-jun，FAN Zhao-ze，YU Yan-ping*(Wuhan Jiuzhou Yumin Pharmacutical Technolo-gy Co.，Ltd，Wuhan 434300，China)ABSTACT:OBJECTIVETo establish an examination method for the determination of bacterial endotoxin to en-sure the safety of the usage of Pantoprazole sodium hemihydrate active pharmaceutical ingredient(API).METHODSIn accordance with the bacterial endotoxin examination method included in Appendix 1143 of ChinesePharmacopoeia(2020 Edition，Volume IV)，two commercially available limulus amebocyte lysate(LAL)reagentswere used to investigate the examination method and a semi-quantitative gel method was established for bacterial en-dotoxin examination and interference test of Pantoprazole sodium hemihydrate API.ESULTSThe interference ofsample on the test was eliminated by diluting the sample to a concentration of 1 mgmL1and below;the test articleof 0.5 mgmL1Pantoprazole sodium hemihydrate API solution was prepared，and the bacterial endotoxin limit wasdetected by LAL with a sensitivity()of 0.25 EUmL1，and the results revealed that the sample content was lessthan 0.5 EUmg1，which met the limit requirements.CONCLUSIONThe developed method can be used for theexamination of bacterial endotoxins in Pantoprazole sodium hemihydrate API.KEY WODS:Pantoprazole sodium hemihydrate API;Bacterial Endotoxin;Test Method;Agglutination泮托拉唑钠(Pantoprazole Sodium)属于第三代质子泵抑制剂，临床上用于治疗消化性溃疡、反流性食管炎等胃功能相关疾病。泮托拉唑钠原料药有四种结晶水合物:半水合物、单水合物、倍半水合物和二水合物。在仿制药一致性评价研究开始之前，市售国产注射用泮托拉唑钠制剂的原料药均为泮托拉唑钠单水合物，在我国仿制药一致性评价研究推进的过程中，对注射用泮托拉唑钠原研参比制剂(商品名:潘妥洛克)分析研究时发现参比制剂使用的原料药为泮托拉唑钠倍半水合物(Pantoprazole sodium hemihydrate)1。由于前期国内泮托拉唑钠倍半水合物原料药的市场空白，缺少对本品细菌内毒素研究报道，本文对该原料药的细菌内毒素检测方法进行补充研究，为该原料药的质量控制提供参考。中国药典 2020 版二部收录的注射用泮托拉唑钠制剂的内毒素限值为每 1 mg 药品中含内毒素的量应小于 1.2 EU，原研参比制剂的内毒素限值也为 1.2 EUmg1 3。考虑制剂生产过程会增加细菌内毒素污染的风险，为了最大程度保证制剂生产的质量，本研究对泮托拉唑钠倍半水合物原料药的细菌内毒素限度提出了更高的要求，制定限度为 0.5 EUmg1，低于制剂限度的一半以下。1试剂与仪器1.1试剂湛江安度斯生物有限公司，鲎试剂(规格:0.1mL/支，批号:1911071，灵敏度:0.25 EUmL1);福州新北生化工业有限公司，鲎试剂(规格:0.1 mL/支，批号:20030812，灵敏度:0.25 EUmL1)。细菌内毒素检查用水(批号:1906250，湛江安度斯生物有限公司，以下简称 BET 水)。细菌内毒素工作标准品(批号:150601-201886，中国食品药品检定研究院)。泮托拉唑钠倍半水合物(锦州九泰药业有限责任公司，批号:190101)。1.2仪器恒温水浴锅(型号:BHW-IV)，电热鼓风干燥箱(型号:GS101-1EB)，涡旋混合器。试验所用的玻璃器具放入重铬酸钾洗液中充分浸泡，然后取出用自来水将残留洗液彻底洗净，再用纯化水反复冲洗 3 次以上，放入电热鼓风干燥箱将烘箱调至 250，待烘箱温度升至设定温度后开始计时，干烤 30 min 以上。2研究方法2.1鲎试剂灵敏度复核试验方法取细菌内毒素工作标准品一支复溶，用 BET 水倍比稀释，配制成 0.5、0.25、0.125、0.0625 EUmL1四种浓度的细菌内毒素标准品溶液，配制过程中需混合均匀。使用湛江安度斯生物有限公司和福州新北生化工业有限公司两个厂家生产的鲎试剂(标示灵敏度=0.25 EUmL1)进行灵敏度复核试验，四组细菌内毒素标准品溶液分别进行 4 个平行试验。阴性对照为 BET 水，进行2 个平行试验。取两个厂家的鲎试剂数支，用 100 L BET 水复溶，然后分别加入 100 L 各浓度的细菌内毒素标准品溶液和 BET 水，用 37 1 水浴保温(60 2)min。2.2干扰预试验方法称取泮托拉唑钠倍半水合物适量，加BET 水溶解配制成 2、1、0.5、0.25、0.125 mgmL1五个浓度的溶液。取细菌内毒素标准品一支，复溶后用 BET 水稀释成1 EUmL1的溶液，取该溶液分别加入等体积的五种浓度泮托拉唑钠倍半水合物溶液，制成含细菌内毒素工作标准品浓度为 0.5 EUmL1的 1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mgmL1的供试品阳性对照管(PPC);供试品对照管(NPC)为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mgmL1的泮托拉唑钠倍半水合物溶液;阳性对照管(PC)为用检查用水稀释成的 0.5 EUmL1的细菌内毒素工作标准品溶液;阴性对照管(NC)为检查用水。取两个厂家的鲎试剂数支，用 100 L BET 水复溶，然后分别加入 100 L 上述各组供溶液，每组进行 2 个平行实验，置 37 1 水浴保温(60 2)min。43海峡药学2023 年第 35 卷 第 2 期2.3正式干扰试验方法取细菌内毒素工作标准品一支，用BET 水将其复溶稀释成浓度为 1、0.5、0.25、0.125 EUmL1的四种溶液，每个浓度设置 4 组平行试验。取泮托拉唑钠倍半水合物适量，加 BET 水溶解配制成 1 mgmL1的溶液，并分别与上述四种浓度的细菌内毒素标准品溶液等体积混合，制成含 0.5、0.25、0.125、0.0625 EUmL1细菌内毒素标准品和含 0.5 mgmL1泮托拉唑钠倍半水合物溶液的混合溶液，每个浓度设置 4 组平行试验。阴性对照使用 BET 水，设置两组平行，置(37 1)水浴保温(60 2)min。2.4泮托拉唑钠倍半水合物的检测方法取锦州九泰药业有限责任公司生产的泮托拉唑钠倍半水合物原料药适量，加BET 水溶解配制成 0.5 mgmL1的供试品溶液。取细菌内毒素标准工作品加入适量供试品溶液中，配制成 0.5 EUmL1的细菌内毒素样品阳性对照溶液。阴性对照为 BET 水，0.5 EUmL1的细菌内毒素工作标准品溶液作为阳性对照。用 100 L BET 水溶解灵敏度为 0.25 EUmL1的鲎试剂，加入 100 L 上述供试溶液，每组设置 2 个平行试验。反应体系置于(37 1)水浴保温(60 2)min。3试验结果3.1鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂是从海洋动物鲎的血液中分离收集变形细胞，提取细胞的裂解上清溶解物制作成的冻干试剂，生产时灵敏度标定、运输保存等因素均会对其灵敏度造成影响4。企业在建立新的细菌内毒素检测方法以及鲎试剂定期管理时，均需要对鲎试剂进行灵敏度的复核检测。检测结果见表 1。当细菌内毒素标准品溶液浓度在 0.25EUmL1及以上的浓度时，两种厂家的鲎试剂均呈现阳性凝集反应，表示两种厂家该批次的鲎试剂标示灵敏度均符合要求。表 1两种厂家鲎试剂的灵敏度复核检测鲎试剂厂家及批号灵敏度(EUmL1)细菌内毒素标准品溶液浓度(EUmL1)0.50.250.1250.0625阴性对照湛江安度斯生物有限公司(1911071)0.25+福州新北生化工业有限公司(20030812)0.25+注:+代表细菌内毒素与供试品混合反应后体系呈现凝固状态，标记为阳性;-代表细菌内毒素与供试品混合反应后体系未凝固，标记为阴性。不同数量的+、-代表测试的每组设置的平行试验数量。3.2干扰试验预试验目前市售鲎试剂灵敏度 一般在0.03 0.5 EUmL1之间，本品细菌内毒素限值 L=0.5 EUmg1，根据最小有效稀释浓度 C=/L 计算，则使用不同灵敏度鲎试剂检测本品细菌内毒素的样品最小有效浓度为0.06 1 mgmL1。据有关文献报道，不同企业生产的注射用泮托拉唑钠制剂的最大不干扰浓度变化较大，在 0.13 2mgmL1之间5-9。综合考虑，确定该原料药预干扰试验的最大不干扰浓度从 1 mgmL1开始探索，检测结果见表 2。表 2泮托拉唑钠倍半水合物干扰预试验鲎试剂厂家及批号供试品供试品稀释浓度(mgmL1)10.50.250.1250.0625PCNC湛江安度斯生物有限公司(1911071)NPC +PPC+福州新北生化工业有限公司(20030812)NPC +PPC+注:+代表细菌内毒素与供试品混合反应后体系呈现凝固状态，标记为阳性;-代表细菌内毒素与供试品混合反应后体系未凝固，标记为阴性。PPC 溶液中泮托拉唑钠倍半水合物浓度在 1 mgmL1及以下时，反应体系中两个厂家的鲎试剂与细菌内毒素标准品的反应均未受到干扰，反应体系均呈现阳性凝固结果。本研究采用的鲎试剂灵敏度为 0.25 EUmL1，泮托拉唑钠倍半水合物细菌内毒素的拟订限值为 0.5 EUmg1，按照中国药典收录的最小有效稀释浓度公式计算，用于细菌内毒素检查的本品最小有效稀释浓度为 0.5 mgmL1，同时考虑到浓度越高的泮托拉唑钠倍半水合物溶液对鲎试剂灵敏度的影响风险越大10，故确定泮托拉唑钠倍半水合物的正式干扰试验浓度为 0.5 mgmL1。3.3正式干扰试验泮托拉唑钠倍半水合物原料药的拟订限值为 0.5 EUmg1，使用灵敏度 为 0.25 EUmL1的两个厂家的鲎试剂进行正式干扰试验，结果见表 3。表 3泮托拉唑钠倍半水合物正式干扰试验鲎试剂厂家及批号检测样品细菌内毒素工作标准品浓度(EUmL1)0.50.250.1250.0625阴性对照湛江安度斯生物有限公司(1911071)供试品+BET 水+福州新北生化工业有限公司(20030812)供试品+BET 水+注:+代表细菌内毒素与供试品混合反应后体系呈现凝固状态，标记为阳性;-代表细菌内毒素与供试品混合反应后体系未凝固，标记为阴性。不同数量的+、-代表测试的每组设置的平行试验数量。53Strait Pharmaceutical Journal Vol.35 No.2 2023BET 水组的检测结果表明，当反应体系中的细菌内毒素浓度不低于 时，两个厂家的鲎试剂呈现阳性凝集反应;当反应体系中细菌内毒素浓度不低于 0.5 时，两个厂家的鲎试剂均呈现阳性凝集反应。由此可知，使用灵敏度为 0.25 EUmL1的鲎试剂检测泮托拉唑钠倍半水合物原料药细菌内毒素限度时，当样品浓度稀释为 0.5 mgmL1时，样品对检查无干扰影响。3.4泮托拉唑钠倍半水合物的细菌内毒素检测 取锦州九泰药业有限责任公司生产的泮托拉唑钠倍半水合物原料药进行检测，检测结果见表 4。本批次泮托拉唑钠倍半水合物原料药的细菌内毒素符合拟定的限度要求:每 1 mg 样品中细菌内毒素含量少于 0.5 EU。表 4 泮托拉唑钠倍半水合物原料药细菌内毒素检测结果鲎试剂批号灵敏度供试品(190101)样品阳性对照阴性对照阳性对照19110710.25 EUmL1+注:+代表细菌内毒素与供试品混合反应后体系呈现凝固状态，标记为阳性;-代表细菌内毒素与供试品混合反应后体系未凝固，标记为阴性。4结论泮托拉唑钠倍半水合物原料药 pH 为 9 11 之间，属于强碱性药物，鲎试剂的反应最适 pH 范围为6.5 7.5 之间，反应体系中样品浓度过高会干扰反应，使结果呈现假阴性11。本文严格按照 中国药典 四部收录的细菌内毒素检查凝胶法要求，对泮托拉唑钠倍半水合物的细菌内毒素限度检查方法展开研究。为证明该方法的统一性，本研究考察了不同厂家生产的鲎试剂检测结果，结果表明两种鲎试剂均适用于本检测方法。研究泮托拉唑钠倍半水合物对鲎试剂的干扰试验影响，当样品稀释至 1 mgmL1及以下时，可消除样品对细菌内毒素检测的干扰，并建立了本品检测方法:稀释泮托拉唑钠倍半水合物原料药样品至 0.5 mgmL1，使用灵敏度为0.25 EUmL1的鲎试剂检测细菌内毒素限度为 0.5 EUmg1的泮托拉唑钠倍半水合物原料药样品，检测不受干扰。细菌内毒素检测的干扰受到多方面的因素影响，当选择其它灵敏度的鲎试剂或调整细菌内毒素限度值时均需要重新建立新方法并进行验证，可参考本研究的干扰试验结果，在最小有效稀释浓度至 1 mgmL1之间进行确定样品正式干扰试验的浓度。本文对泮托拉唑钠倍半水合物原料药的细菌内毒素限度提出了较严格的要求，检测结果表明该原料药的细菌内毒素含量符合既定要求。该结果可能与原料药的生产工艺有关，干燥结晶前反应体系中加入了高浓度的氢氧化钠溶液12，该步骤可能在一定程度上去除产品中的细菌内毒素。由此可推测，在相同的生产条件下，选择泮托拉唑钠倍半水合物原料药能够更大程度降低制剂成品中细菌内毒素限度。参考文献1 陈蓓，张立波，李宏，等.新型左旋泮托拉唑钠水合物晶型结构及稳定性研究 J.浙江大学学报(医学版)，2017，46(02):153-159.2 1143 细菌内毒素检查法.中国药典(四部)S.北京:中国医药科技出版社，2020，178-181.3 注射用泮托拉唑钠.中国药典(二部)S.北京:中国医药科技出版社，2020，706.4 王莉，高华，蔡彤，等.鲎试剂的研究及应用进展 J.药物分析杂志，2007(06):938-942.5 周卫涛，李峰，李莉.建立注射用泮托拉唑钠细菌内毒素检查方法 J.世界最新医学信息文摘，2017，17(62):188，198.6 黄洋，赵志龙.注射用泮托拉唑钠细菌内毒素检查方法的建立J.中国现代药物应用，2014，8(07):12-14.7 唐素华.注射用泮托拉唑钠的细菌内毒素检查 J.齐鲁药事，2010，29(10):601-603.8 郑旭，吴芳，闫凌霄，等.注射用泮托拉唑钠细菌内毒素的检查法J.药学与临床研究，2008，(05):410-412.9 白林，王晓蕾，杨帆.注射用泮托拉唑钠细菌内毒素检查法的研究 J.解放军药学学报，2008，(05):457-458.10 何进，高军，陈金旺.凝胶法细菌内毒素检查的干扰因素及消除J.中国药师，2010，13(02):284-287.11 范能全，彭兰.细菌内毒素的检查及干扰因素的排除 J.中国药师，2007，(09):915-916.12 邱珲，杨庆云，童元峰，等.泮托拉唑钠单水合物与倍半水合物的晶型与稳定性差异研究J.中国新药杂志，2015，24(08):869-874.作者简介:杨华，男(1982 )。学历:硕士。职称:高级工程师。从事药品研发工作。基金项目:湖南省自然科学基金项目，编号:2022JJ80002电位滴定法测定碘海醇注射液中氨丁三醇含量杨华1，2，熊映红2，王西凤2，李俊璋2(1.湖南汉森制药股份有限公司，湖南益阳 413000;2.湖南汉森医药研究有限公司，湖南长沙 410000)摘要:目的建立检测碘海醇注射液中氨丁三醇含量的电位滴定法。方法采用电位滴定法，以稀盐酸为溶剂，用氢氧化钠滴定液滴定，以两次突跃点消耗氢氧化钠滴定液的容积差值计算氨丁三醇含量。结果氨丁三醇在0.6 1.8 mgmL1的浓度范围内与滴定液消耗体积呈良好线性关系(r=0.9998);平均回收率为 102.8%，SD 为 1.4%。结论本方法简单、灵敏、准确，可用于碘海醇注射液中氨丁三醇的含量检测。63海峡药学2023 年第 35 卷 第 2 期