远隔缺血预处理分离液对人肾小管上皮细胞缺氧性损伤的保护作用.pdf

基金项目：国家自然科学基金（）通讯作者：裴汉军【技术与方法】远隔缺血预处理分离液对人肾小管上皮细胞缺氧性损伤的保护作用戴文俊，裴汉军（内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 ）摘要 目的：研究远隔缺血预处理（）分离液对人肾小管上皮细胞（）缺氧 复氧（）损伤的影响及机制。方法：将 细胞分为时间对照组、处理组、自噬干预组。时间对照组细胞在正常条件下培养，组细胞使用 分离液预处理，自噬干预组细胞在 处理基础上，加入自噬抑制剂 甲基腺嘌呤（，），后三组细胞使用三气培养箱进行 构建损伤模型。模型成功后使用光学显微镜观察各组细胞状态，应用 观察 蛋白、蛋白的表达水平。结果：镜下示 分离液可明显减轻 对 细胞的损伤，加入自噬抑制剂，分离液对 细胞 损伤的保护作用被阻断。结果显示，分离液可使 细胞线粒体中的自噬特异性蛋白 、表达水平增高。结果显示，与 组比，组 及 的 表达量明显升高；加入自噬抑制剂，细胞线粒体中的自噬特异性蛋白 、表达降低，及 的 表达量同时也明显降低。结论：分离液对 细胞 后损伤具有保护作用，作用机制可能与线粒体自噬相关。关键词 远隔缺血预处理分离液；人肾小管上皮细胞；缺氧 复氧；线粒体自噬 ：，（，）：（）（）（）：，（），：年第 卷第 期 ，；，：，；急性肾损伤（，）表现为短时间内肾功能迅速下降，通常以血肌酐绝对水平上升 ，或超过基线值的 倍为标准，是临床上发病率和死亡率都很高的常见危重症，且随着病程的进展，可逐渐发展为慢性肾脏病 ，严重影响患者愈后。远隔缺血预处理（，）是指通过多次规律性、短暂性地对远离靶器官的肢体远端进行缺血处理，由此来使靶器官更加耐受缺血再灌注等所带来的损伤，从而发挥多种器官保护作用 。因其操作方便、对患者伤害小而在临床中广泛应用。但是，有关 防治 的机制目前尚未完全阐明。目前认为，发病机制复杂，涉及多种病理过程，如活性氧（，）的释放、趋化分子和多种细胞因子参与的炎症反应等 。这些病理过程诱导肾小管上皮细胞等出现损伤、肿胀和功能障碍，进一步加重了细胞的缺血缺氧，最终出现细胞凋亡和死亡，导致 的发生。如今，的发病率居高不下，心脏介入术后 发病率可高达 ，而在危重症病房中，其发生率更是高达 ，现 已成为影响人类健康的重大威胁。如何避免急性肾损伤的发生和减少其损伤程度，一直是众人研究的焦点。近年来有研究发现，的大多数病理过程与线粒体功能障碍相关 ，因此线粒体自噬作为能够选择性清除受损的线粒体从而保护健康线粒体功能的特殊类型自噬 ，可能成为新的治疗思路。本研究通过体外细胞实验来探讨 对 的保护作用及对自噬的调节作用。材料与方法 材料（）细胞：人肾小管上皮细胞（）（）。（）试剂：细胞专用培养基（）；胰蛋白酶 （美国 公司，）；蛋白定量试剂盒（上 海 赛 默 飞 世 尔 科 技 有 限 公 司，）；蛋白抗体（上海优宁维生物科技股份有限公司，）、蛋白抗体（美国 公司，）；（中国碧云天生物科技有限公司，）。（）仪器：电泳仪，美国 公司，。实验方法 细胞培养将 细胞置于 专用培养基（含 、青霉素和链霉素）中，在恒温饱和湿度培养箱中培养，培养箱条件设置为，和 空气。鼠血浆分离液的提取及保存采用腹腔注射戊巴比妥钠（）的方法给予大鼠麻醉，待麻醉成功后，使用充气袖带对大鼠后肢根部进行阻断血流。对充气袖带进行持续充气，至大鼠后肢的皮肤出现发绀，表示股动脉已经被阻断，阻断 后释放袖带压力，复灌注 后，再次重复以上动作，如此个循环，后经心脏取血，置入真空肝素化采血管中，使用 离心机 离心 提取血浆，分装入肝素化 管中 冻存，使用时使用 离心机 离心 ，取上清液按 培养基稀释。年第 卷第 期 模型建立采用物理性 模式建立细胞损伤模型。将长势良好的模型组细胞置于三气培养箱中培养 ，培养箱条件设置为，、，随后打开箱门，将培养箱条件设置为，和 空气，关闭箱门复氧培养。实验分组实验分为时间对照组、组、处理组、自噬干预组。（）时间对照组（，）：取对数生长期 细胞，用 专用培养基（含 、青霉素和链霉素），在恒温饱和湿度培养箱中培养 ，培养箱条件设置为，和 空气；（）缺氧 复氧组（，）：取对数生长期 细胞，使用 专用培养基，在三气培养箱中恒温饱和湿度培养 ，培养箱条件设置为 ，、，随后打开箱门，将培养箱条件设置为，和 空气，关闭箱门复氧培养；（）远隔缺血预处理组（，）：取对数生长期 细胞，将 分离液稀释后预处理 细胞，后余同 组；（）自噬干预组（）：取对数生长期 细胞，在 处理的基础上，加入 （工作浓度，）培养 细胞，后余同 组。用光学显微镜观察各组 细胞将造模成功的各组细胞置于倒置显微镜下，使用 倍镜头观察细胞，以了解各组 细胞造模后的状态。法检测 、蛋白表达水平取 细胞，提取线粒体蛋白，应用 法测蛋白浓度，采用 检测 细胞线粒体中自噬特异性蛋白 和 的表达水平。分析各组细胞 、的 表达取 细胞，提取总 ，逆转录生成 ，设计引物并由上海生物工程公司合成（见表 ），以 为参照基因，采用 法分析各组细胞 、的 表达水平。表 引物成分表引物引物序列（）长度（）统计学处理采用 统计软件进行统计学分析，各项检测结果均以（）表示，蛋白检测结果多组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用 检验，以 为差异有统计学意义。结果 对 细胞 损伤的保护作用使用光学显微镜对 组细胞进行形态学观察。对照组 细胞形态正常，呈“鹅卵石”样排列，细胞膜完整，细胞核清晰；相较于对照组细胞，组 细胞肿胀变性，边界不清，细胞核模糊，死亡细胞明显升高；相较于 组细胞，组 细胞形态相对正常，细胞膜完整，细胞核清晰，死亡细胞较少；相较于 组细胞，自噬干预组 细胞肿胀变性明显，细胞核模糊，死亡细胞增多。实验结果表明，分离液对 细胞 损伤具有保护作用，而 可以阻断这种保护作用。见图 。图 对 细胞 损伤的保护作用 年第 卷第 期 对 细胞 损伤保护的作用机制 法检测 、蛋白表达水平为进一步分析 分离液对 细胞的保护作用机制，应用 对 细胞线粒体自噬特异性蛋白 及 的表达进行检测，以 为内参。结果显示：组对比 组，组细胞线粒体中的 及 表达量明显更高（，）；组对比 组，组细胞线粒体中的 及 蛋白表达量明显降低（，）。表明 分离液可通过上调 细胞 损伤中的线粒体自噬，从而发挥保护作用。见图 。图 对 及 表达水平的影响注：检测小鼠肾小管上皮细胞线粒体中 及 的表达。自噬蛋白 的相对表达量，组对比 组，组细胞线粒体中的 表达量明显更高，组对比 组，组细胞线粒体中的 蛋白表达量明显降低，；蛋白的相对表达量，组对比 组，组细胞线粒体中的 表达量明显更高，组对比 组，组细胞线粒体中的 蛋白表达量明显降低，法检测 、表达水平应用 技术对各组 细胞 及 的 表达进行检测。结果显示，组对比 组，组细胞中的 及 的 表达量明显升高（）；组对比 组，组细胞中的 及 的 表达量明显降低（）。见图 。图 分离液对 及 表达水平的影响注：的相对表达量，组对比 组，组细胞中的 的 表达量明显升高，组对比 组，组细胞中的 的 表达量明显降低，；的相对表达量，组对比 组，组细胞中的 的 表达量明显升高，组对比 组，组细胞中的 的 表达量明显降低，讨论肾脏是人体血供极其丰富的器官，其特点为高通血量和高耗氧量，对缺血 再灌注十分敏感。有研究显示，急性肾损伤发病率和死亡率都比较高的主要原因就是肾缺血 再灌注损伤 。远隔缺血预处理（）可通过对远离靶器官的肢体远端多次短暂性、规律性的缺血处理，使靶器官（如心脏、脑、肾脏、肺脏、肝脏等）对缺血 再灌注等损伤的耐受能力得到有效的增强，从而保护多种器官免受缺血 再灌注损伤 。等 发现 可增加患者尿中 （高迁移率族蛋白 ），从而降低心脏术后急性肾损伤的风险（）。等 对 例接受介入治疗的患者随机分组，发现 组显著降低了造影剂给药后 的 （）和 （）水平，表明 治疗减少了造影剂肾病（）的发生。本实验使用人肾小管上皮细胞进行细胞水平的研究，旨在通过对 细胞进行 损伤造模，来模拟人体内肾脏缺血 再灌注损伤，使用 分离液预处理细胞，来模拟人体 对肾脏的作用。根据前期预实验的实验结果，发现 细胞的 损伤是一种动态损伤，以缺氧 复氧 损伤最为严重，所以模型选取缺氧 复氧 为检测时间点。造模成功后，镜下显示 组细胞相较于对照组细胞损伤严重，细胞肿胀变性、死亡较多；而在 年第 卷第 期 前给予 分离液预处理 细胞，镜下可见细胞受损较轻微，细胞形态大致正常。说明 分离液对 细胞 损伤具有保护作用。目前，对于 肾保护的内在机制尚不明确。以往的研究已经证明线粒体损伤和功能障碍对 的发展和肾脏修复异常至关重要。等人 通过研究发现，在 血清肌酐升高之前，肾小管细胞的线粒体功能便已经发生损伤。等人 使用消耗 的方法对体外培养的人肾小管细胞诱导损伤和使用缺血的方式诱导小鼠发生 ，通过研究发现，在肾小管细胞发生凋亡之前，线粒体便已经出现损伤。另外，还有多项研究表明线粒体自噬对肾功能有保护作用 。由此可见线粒体自噬是有效预防和治疗 的策略。为验证 分离液通过上调线粒体自噬水平来减少 细胞 后线粒体损伤，实验提取 细胞中的线粒体蛋白，采用 法检测线粒体蛋白中自噬特异性蛋白 和 表达水平，同时采用 技术检测 和 的 表达水平，以此达到基因和蛋白表达的双重验证。和 是检测自噬最常用的两种蛋白，有两种形式，和 ，当自噬发生时，转化成为 ，所以 水平是检测自噬水平的主要标志。结果显示 分离液预处理 细胞，线粒体蛋白 以及 表达水平均增强，结果也支持这一趋势，提示 可以上调线粒体自噬水平；为了进一步确定线粒体自噬在 肾保护中的重要性，在 预处理 细胞时，同时给予自噬抑制剂 ，重复以上实验，结果显示，细胞 以及 表达水平均明显降低，结果也表现出了同样的趋势，表明线粒体自噬水平下降。由此可以得出结论，分离液对 细胞 后损伤的保护作用，是通过线粒体自噬来实现的，分离液可上调线粒体自噬，如果抑制线粒体自噬（处理细胞）则可抑制 的保护作用。综上，线粒体自噬作为清除和修复损伤线粒体的机制，在急性肾损伤时被激活，发挥肾保护作用。因此，通过 增加线粒体自噬功能是预防和治疗 的一个有希望的治疗策略。进一步研究线粒体自噬的内在调控机制，将会成为急性肾损伤治疗的新靶点和新希望。参考文献 崔茜，裴汉军远隔缺血预处理防治急性肾损伤的机制研究 包头医学院学报，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：郭炜彤远隔缺血预处理对健康成年人脑血流自动调节功能的影响及机制研究 长春：吉林大学，（）：，（）：，年第 卷第 期 （），：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂）（上接第 页），（）：，：，（）：，（）：王黎，梁娉娉，张凤，等社区 型糖尿病患者血糖自我管理水平调查及并发糖尿病周围神经病变的影响因素分析 现代生物医学进展，（）：朱昱亭，胡培，陈俊，等糖尿病周围神经病变的相关因素分析 神经损伤与功能重建，（）：蔡洁，董继宏，汪昕糖尿病周围神经病变发病机制的研究进展 中国临床医学，（）：，（）：陆丽荣，戴霞，陈青云，等联合抗阻有氧运动对糖尿病前期人群代谢指标的影响 广西医科大学学报，（）：陈万睿，陈婧太极拳和健身气功八段锦对中老年血脂及生活质量的影响 中国老年学杂志，（）：（收稿日期：）年第 卷第 期