血浆Septin9基因甲基化检测在结直肠癌诊治中的应用.docx

血浆Septin9基因甲基化检测在结直肠癌诊治中的应用

摘要：目的:引进血浆Septin9基因甲基化检测技术，提高本院结直肠镜的受检率，为本地区结直肠癌( colorectal cancer，CＲC)的早筛、早诊、早治、疗效判断和复发监测提供有力的实验室依据，有效提升本地区结直肠癌的综合防治水平。方法：分析2018年1月开展至今的1972例Septin9基因甲基化检测结果，对阳性结果随访并进行结直肠镜检查。结果：健康体检职工血浆Septin9基因甲基化阳性率为2.96%（12/405），消化科患者、中西医肿瘤科患者、感染科患者血浆Septin9基因甲基化阳性率分别为14.29%（17/119）14.84%（38/256）和15.68%（8/51），差别有显著性（P<0.05）。结论：血浆Septin9基因甲基化检测技术以其采样方便、患者依从性好，灵敏度和特异性均较高的技术优势提高我院结直肠镜受检率，我院自2018年1月引进入疆并在临床推广应用，填补疆内空白，为结直肠癌的早筛、早治、疗效判断、复发监测等提供辅助诊断依据。
关键词：结直肠癌； Septin9；基因；甲基化检测
结直肠癌是结直肠黏膜上皮恶性肿瘤，结直肠癌（CRC）的发病率位居我国乃至全球各类恶性肿瘤第三位，其发病率和死亡率有逐年上升趋势，有效的早期筛查、诊断、复发监测及尽早干预治疗是CRC防治的关键。早期诊断 CＲC 能显著改善预后，但 60% ～ 70% 的 CＲC患者诊断时已进展至晚期。粪便血试验(facal immunochemical tests，FIT) 、癌胚抗原 ( carcinoembryonic antigen，CEA )和肠镜是目前临床上最为常用的筛查手段，但FIT易受干扰因素影响，假阳性率高；CEA 特异性低，更适合疗效监测；肠镜检查侵入性强，患者接受率不高［1］。所以，寻找更好的检测标志物就显得尤为重要。最近研究发现CRC的发生、发展与基因的甲基化密切相关。Septin9基因与CRC发生密切相关，在癌组织中呈高度甲基化，是CRC发生发展过程中重要的分子标志物，研究发现，Septin9 基因甲基化存在于90%以上的 CＲC 癌组织中，且其Septin9基因甲基化程度远高于良性肿瘤和正常肠道组织，使得 Septin9 基因甲基化检测有望成为新的CＲC诊断指标［2］。结直肠癌的发生、发展是一个多因素影响、多基因参与并需经历多阶段演变的复杂过程，肠癌发展进程由增生、小腺瘤、大腺瘤、重度非典型增生、早期腺癌、晚期腺癌等阶段，大约需要5-10年的疾病发展期，临床症状出现时间晚，国民早期筛查意识差，无症状不检查，往往错过最佳治疗期。医界共识：早发现、早诊断、早治疗是防治癌症最有效的方式。目前结直肠癌体外筛查的方法有CEA、粪潜血和肠镜检查。CEA、粪潜血灵敏度较低，肠镜筛查虽然是临床筛查肠癌的金标准，但流程复杂、创伤大、风险高、左右结肠有差异、恐惧意识、人为误差，加之肠镜诊断的准确性和治疗的安全性很大程度上取决于肠道准备的质量等，使肠镜的受检率低于3%，不适合早期筛查。根据我院检测结果，总结如下：
1.资料与方法
1.1患者的一般资料：选自我院2018年1月至2021年9月检测的Septin9基因甲基化检测患者1972例，年龄从25岁至91岁，其中同期健康体检组405例。
1.2方法：根据患者科别进行分组统计阳性率，经过实验技术人员单盲检测，阳性结果进行随访并嘱其进行肠镜检查，通过比较分析Septin9基因甲基化检测和肠镜结果，探讨Septin9基因甲基化检测对结直肠癌的诊治价值。
2.标本采集与制备：
2.1标本采集：用K2EDTA抗凝10ml真空采血管（紫帽），抽取受检者空腹10ml静脉血，上下颠倒抗凝管5-8次，全血标本2-8℃保存，保存不超过4小时，不能冷冻全血标本。
2.2血浆制备流程见下：把装有10ml全血采血管对称放置于型号为DT5-2的离心机里（无刹车）。以1350±150g离心12分钟；从离心机中取出采血管，使用一次性移液管，将血浆转移到一个15ml离心管，再次将装有血浆的15ml离心管,1350±150g离心12分钟，从离心机中取出15ml离心管。使用1-5毫升加样枪，将3.5ml血浆转到一个新的15ml离心管[3]。
2.3标本保存：血浆标本直立冻存在-15至-25℃冰箱中，保证血浆冷冻在管底部，血浆标本不能反复冻融。
3检测方法：
3.1样本提取：
室温 溶 解 样 本 后 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 提 取。
1.
2. 裂解：3.5ｍＬ血浆样本、 阳性对照品和阴性对照品中分别加 入3.5ｍＬ裂解吸附液，涡旋混匀后放置10ｍｉｎ；
3. ＤＮＡ结合： 依次将磁珠和无水乙醇添加到１５ｍＬ离心管中， 置于旋转混匀器上中速旋转45 min；
4. ＤＮＡ 洗涤： 用洗液Ａ洗涤后祛除残余液体；
5. 洗脱：加入洗脱液重悬磁珠， 并将全部洗脱液移至新离心管中[3]。
3.2亚硫酸盐转化步骤：
⑴ 在含有DNA 洗脱液的离心管中加入亚硫酸盐溶液和保护液， 涡旋混匀反应液，80 ℃ 恒温孵育45min；
⑵ 结合：在离心管中依次加入洗液Ａ和磁珠，涡旋混匀,1000ｒ／min， 孵育45min；⑶洗涤：分别用洗液Ａ和洗液Ｂ洗涤并去残余液体；(4)干燥和洗脱：室温静置10min待沉淀干燥后加入60μＬ 洗脱液，涡旋混匀重悬磁珠。1000ｒ／min 孵育10min，置于DynamagＴＭ－２磁性架６min， 将洗脱液（ 约60μ）转移至新的离心管中[3]。
3.3 基因扩增:
将30μlPCR预反应液加至96孔培养板。 加30μＬ的BisDNA至ＰＣＲ 板对应的孔中，5000ｒ／min离心５ｓ（ｒ＝14ｃｍ）， 置于扩增仪对应样品槽中， 按对应的顺序设置待测样本。
扩增程序：94℃ ２０min；62℃ ５ｓ；55.5 ℃ 35ｓ； 93 ℃ 30ｓ；40 ℃ ５ｓ；93 ℃30ｓ→62 ℃ ５ｓ， 45个周期（ 55.5 ℃采集FAM和HEX荧光）。
3.4结果判断：
⑴Septin9甲基化检测阳性：CT≤ 41.1， ACTB的CT≤32.1；
⑵ Septin9甲基化检测阴性：无CT值或CT＞41.0， ACTB的CT≤ 32.1；
⑶ 检测结果应同时达到上述要求，且扩增曲线无异常， 否则实验无效。在内参基因ACTB结果正常的情况下，Ct 值≤41.0时结果判为阳性，Ct值＞41.0或无 Ct值时结果判为阴性。每次实验均设阳性和阴性对照，阳性和阴性对照均由试剂盒提供，处理方法及流程与受检者相同[3]。
4.结果：
健康体检职工血浆Septin9基因甲基化阳性率为2.96%（12/405），消化科患者、中西医肿瘤科患者、感染科患者血浆Septin9基因甲基化阳性率分别为14.29%（17/119）14.84%（38/256）和15.68%（8/51），差别有显著性（P<0.05）。
5.结论：
Septin9基因甲基化检测为目前FDA批准的一个大肠癌血液筛查项目，首次进入国家临床诊治权威指南，用于大肠癌早期筛查，是一种无创、无痛、采样方便的非侵入性基因检测技术，患者依从性高，检测灵敏度76.63%，特异性95.93%[4]。大肠癌的发病机制涉及多基因、多途径，其中包括：甲基化、微卫星不稳定、染色体不稳定等，目前只有甲基化是最成熟、最稳定、检测方法能够应用在临床上，甲基化的Septin9基因被公认为是结直肠癌早期发生发展中特异性的分子标记物。我院自2018年1月引进该技术并在结直肠癌早期筛查及高风险患者推广应用，还可用于诊治、疗效监测和术后复发评估，有效提升我区结直肠癌的综合防治水平，项目契合民生健康迫切需求，节约医疗资源，填补疆内空白。目前检测1972例，阳性154例。对阳性患者进行随访并建议做肠镜进一步检查，提升我院结直肠镜的受检率，随访时给患者做健康宣教，调整合理的膳食结构，适量体育运动等，为患者做健康指导，是一项非常好的、易被患者接受的实验室检查项目。Septin9基因编码的Septin9蛋白在细胞代谢中发挥着重要的生理作用，能够调节细胞生长，防止细胞分裂过快或无控制的分裂增殖，具有相应的抑癌作用。因此检测患者血浆中Septin9基因甲基化水平是CRC早期筛查和诊断的理想方式。外周血Septin9是首个被美国FDA批准的用于CRC筛查的血液D N A 甲基化标志物。在我国，国家食品药品监督管理总局（CFDA）已批准Septin9用于临床CRC的早期检测，并被国内指南所推荐[1]。异常高甲基化通常发生在基因启动子区CpG岛处 ，Septin9会抑制Septin9基因正常表达，使其抑癌功能丧失，并最终导致细胞分裂和癌变。肿瘤细胞凋亡和坏死后，其DNA被释放入外周血，从而在外周血中可检测到异常甲基化的Septin9基因DNA。Septin9试验敏感性主要取决于外周血 Septin9水平，而外周血Septin9主要来源于肿瘤细胞的释放。不同分期的肿瘤，其肿瘤大小，浸润程度，分化程度均各不相同，因此其外周血Septin9水平也有显著差异。外周血Septin9阳性率与CRC临床分期有关，临床分期越晚，Septin9阳性率越高。组织分级越高，分化程度越低，Septin9阳性率越高。且外周血Septin9水平与肿瘤最大直径呈线性关系，而与肿瘤部位无关[4]。Septin9基因具有评估CRC手术疗效和预测预后的价值。术前Septin9基因阳性的CRC患者，术后Septin9水平降低，甚至转为阴性。术后高水平Septin9则预示CRC患者复发和死亡风险高，因此术后Septin9状态能直接提示CRC患者是否存在隐匿性肿瘤细胞，监测Septin9水平可预测CRC手术预后和监测术后复发，可作为检测肿瘤进展和治疗效果的标记物。
Septin9基因检测结直肠腺瘤和息肉的敏感性及影响因素： Septin9对腺瘤和息肉的阳性检出率低于15%，我院结肠息肉、腺瘤阳性率为14.13（26/184）%，与文献报道一致，这可能与从腺瘤发展为CRC的过程中，甲基化是慢慢扩展的，结直肠腺瘤中基因甲基化水平低于C R C有关。但也有研究证明，Septin9对重度不典型增生的息肉和直径＞1 cm腺瘤的检测价值远优于直径＜1 cm腺瘤和息肉，Septin9基因检测对进展期腺瘤，尤其是含有绒毛成分和异型增生的腺瘤的检出率高，这说明外周血Septin9基因水平的检测不仅可用于CRC的筛查，亦可作为CRC癌前病变的筛查。Septin9在CRC的筛查和早期诊断上具有较高敏感性和特异性，适合于易感人的筛查；对CRC的分期、分级评价、治疗效果、复发监测和预后预测方面潜能巨大；但研究人群、实验设计、计算方法、试剂盒选择、年龄、其他疾病和种族差异均可影响Septin9检测结果，对无症状人群和腺瘤、息肉的筛查方面，Septin9的效力有待于进一步提高。在权衡敏感性和特异性基础上Septin9 联合其他标记物如CEA、粪潜血检测可提高诊断率，具有良好的应用前景。
6.参考文献：
[1]中华医学会消化内镜学分会,中国抗癌协会肿瘤内镜学专业委员会.中国早期结直肠癌筛查及内镜诊治指南.
[2]郭婉，汪钰翔，丁先锋.Septin9基因及甲基化检测在结直肠癌中的研究进展，临床检验杂志[J]．2018,36（2）:133-134.
[3] Septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法)说明书.
[4]赵媛，陈四明，蒋益兰，等．Septin-9 基因甲基化检测对结直肠癌
诊断价值的 meta 分析［J］．中国医师杂志，2020，22( 6) : 852-856．

-全文完-