微生物与发酵工程实验讲义级.doc

实验一 微生物显微镜直接计数法血细胞计数板法 一、目的规定1明确血细胞计数板计数的原理。2掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。二、基本原理运用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将通过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1mm2），所以可以根据在显微镜下观测到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。血球计数板构造如图。 血细胞计数板构造 A.正面图；B.纵切面图（此处向下可用）计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格提成16个中方格，而每个中方格又提成25个小方格（图10-2）；另一种是一个大方格提成25个中方格，而每个中方格又提成16个小方格（图10-2）。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即1625=400小方格。每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为01mm，所以计数室的容积为01mm3（万分之一毫升）。在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数因1ml=1cm3=1000mm3，故1ml菌液中的总菌数= =50000AB（个）同理，假如是16个中方格的计数板则1ml菌液中的总菌数= =40000AB（个）三、器材1.菌种 酿酒酵母2.仪器或其他用品 血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。四、操作环节1菌悬液制备将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗吹干后才干进行计数。3加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边沿滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。4显微镜计数静止5分钟后，将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱要适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度规定每小格内约有510个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达成母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。5清洗血球计数板使用完毕后，将血细胞计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观测每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须反复洗涤至干净为止。五、实验报告1结果将结果记录于下表中。 A表达五个中方格中的总菌数； B表达菌液稀释倍数。各中格中菌数AB二室平均值菌数/ml12345第一室第二室2思考题根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差重要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？实验二 发酵菌种的自然选育一、实验目的1.学习从土壤中分离工业微生物菌株的方法2.学习无菌操作技术。二、实验原理从混杂的微生物群体中获得只具有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化，方法有许多种。1.倾注平板法。一方面把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在4050左右的营养琼脂培养基充足混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞通过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，反复上述环节数次，便可得到纯培养物。2.涂布平板法。一方面把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。3.平板划线法。最简朴的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。4.富集培养法。富集培养法的方法和原理非常简朴。当我们所要的微生物含量很低的时候，我们可以发明一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所发明的条件涉及选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，通过多次反复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。假如要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次反复移种便可以得到纯的寄生菌。5.厌氧法。在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以运用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，运用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。本实验欲筛选的菌土壤中含量也许很低，所以先进行富集培养以增大其浓度，然后用选择培养基平板进行分离筛选。三、实验材料和用品1.器材高压蒸汽灭菌锅，恒温干热灭菌箱，超净工作台，电子天平，电炉，量筒，玻棒，三角瓶，培养皿，称量纸，药勺，记号笔，牙签，接种环，涂棒，PH试纸，移液枪，EP管，枪头2.药品蛋白胨，牛肉膏，氯化钠，琼脂，无菌水3.材料土壤样品四、操作环节1.采样采用土壤样品（在不同地点采集的样品）。2.培养基的制备制备营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，加水至1000ml，调PH7.27.4。高压灭菌，131，20min.3.倒平板：按无菌操作规定，取融化并冷却至不烫手的固体培养基（50左右），迅速倒入培养皿中约20ml，平放于桌面上，待凝后即为平板。4.微生物的分离称取5g土样，放入装有45ml无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为10-1的土壤稀释液。取0.9ml无菌水4支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。取10-1的土壤稀释液，振荡后静止2min，用一支1ml无菌枪头吸取0.1ml上层悬液（10-1）加人盛有0.9ml无菌水的EP管中充足混匀，然后用无菌枪头从此EP管中吸取0.1ml加入另一盛有0.9ml无菌水的EP管中，混合均匀，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同稀释度的土壤稀释液。在稀释过程中，因从高浓度到低浓度，每稀释一次应更换一支枪头。涂布：将上述培养基平板分别写上10-4、10-5、和10-6、10-7三种稀释度，然后用无菌枪头分别在10-5、10-6、10-7三管稀释液中各吸取0.2ml，对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置510min，使菌液吸附进培养基。从低浓度到高浓度，可以用同一支枪头或涂棒。培养：将涂好的平板倒置于32温箱中培养23d。若杂菌干扰不严重，可适当延长平板的培养时间，以便挑取生长速度较慢的菌株。挑菌落：培养后长出的单个菌落，根据菌落形态特性，挑取有代表性的单菌落（尽量挑取不同类型的菌落），在相应培养基的平板上划线，待菌落长出后，检查其特性是否一致，若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。纯化后的菌株应及时转接到斜面培养基上保存。（三）分离菌株的斜面保存1.取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面中。2.接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后再新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从底部开始，一直划至上部。注意划线要轻，不可把培养基划破。3.接种后30恒温培养48h，取出保存于4。五、实验报告1.记录实验结果描述实验过程及结果。2.思考题：菌种选育的方法有哪些？举例简述其中一种选育方法环节？实验三 发酵菌株的初筛一、实验目的1.从已分离到的细菌中筛选出能产生生理活性物质的菌株。2.学习蛋白酶、淀粉酶和纤维素产生菌的筛选方法。二、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域具有广泛的用途。淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。蛋白酶也是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。根据三氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周边不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根据透明圈在小还能判断产酶活力。本实验以淀粉酶和蛋白酶产生菌的筛选为例，介绍发酵菌种的初步筛选方法。三、实验材料和用品1.器材高压蒸汽灭菌锅，恒温干热灭菌箱，超净工作台，电子天平，电炉，量筒，玻棒，三角瓶，培养皿，称量纸，药勺，记号笔，牙签，接种环，PH试纸，移液枪，EP管，枪头，酒精灯2.药品碘、碘化钾、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、可溶性淀粉、琼脂、葡萄糖、脱脂牛奶、NaOH、浓HCl3.材料实验一分离到的微生物菌株、Xcc野生型菌株四、实验环节1.配制筛选培养基：淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，可溶性淀粉0.2%，琼脂2%，调PH7.07.2。蛋白酶产生菌筛选培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，脱脂奶粉1%，琼脂2%，调PH7.07.2。高压灭菌，其中脱脂奶粉要配成母液，低压灭菌，倒培养基时加入。2.淀粉酶产生菌的初筛倒平板：按无菌操作规定，取融化并冷却至不烫手的淀粉酶产生菌筛选培养基（50左右），迅速倒入培养皿中约20ml，平放于桌面上，待凝后即为平板。将分离纯化的菌株直接点种于培养基平板上（每皿可点9个点），其中中间以Xcc野生型菌株做为正对照。长出菌落后，在平板上滴加卢哥碘液，以铺满平皿为度，假如菌落周边有透明圈出现，说明淀粉被水解，该菌能产生淀粉酶，透明圈与菌落直径之比越大，说明产淀粉酶活力越强。记录实验结果3.蛋白酶产生菌的初筛方法基本同上，所用的是蛋白酶产生菌筛选培养基，培养后在平板上会产生无色透明圈，说明该菌可以产生蛋白酶。4.分离到的菌株的按实验一所示方法斜面保存五、实验报告1.记录实验结果菌株（透明圈直径）123456789对照淀粉酶蛋白酶2.思考题：在选择平板上分离获得淀粉酶和蛋白酶产生菌的比例如何？试结合采样地点进行分析。实验四 紫外线的诱变育种 一、实验目的1.学习观测紫外线对初筛菌种的诱变效应；2.学习物理因素诱变育种的方法。二、实验原理紫外线对微生物有诱变作用，重要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。三、实验材料和用品1.器材：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），离心机，培养皿，移液器，移液器枪头2.药品及试剂：葡萄糖，胰蛋白胨，酵母粉，无菌水3.菌种：野油菜黄单胞菌野生型菌株四、实验环节1.菌悬液的制备（1）取野油菜黄单胞菌野生型菌株菌体接种于NYGB液体培养基（每升蛋白胨5.0 g，酵母提取粉3 g，甘油20 g）内，过夜振荡培养（220rpm,28 ）；（2）将上述菌液离心（10000r/min，离心1分钟），弃去上清液，将菌体用无菌水洗涤2次，最后制成菌悬液，注意无菌操作。（3）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。2.平板制作。将具有2葡萄糖的NYGA培养基（每升蛋白胨5.0 g，酵母提取粉3 g，葡萄糖20 g）融化后，冷至55左右时倒平板，凝固后待用。3.紫外线解决（1）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。（2）取直径6cm的无菌培养皿2套，分别加入上述菌悬液5ml。（3）将盛有菌悬液的2平皿打开置于紫外线灯下分别照射1分钟及3分钟。（4）将上述经诱变解决的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6。（5）取10-4、10-5、10-6三个稀释度的菌悬液涂平板，每个稀释度涂平板2个，每个平板加稀释菌液0.1ml，用无菌涂布器涂匀。以同样操作，取未经紫外线解决的菌稀释液涂平板作对照。（6）将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置28培养箱培养48小时，注意每个培养皿的背面要标明解决时间和稀释度。（7）将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线解决1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。（8）观测诱变效应。将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周边将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较。五实验报告1结果将实验结果填入下表。稀释倍数平均菌落解决时间 （数/皿）诱变剂 10-410-510-6存活率%致死率%紫外线（UV）0 min（对照）1 min3 min结果解决透明圈和菌落直径大小（）及其HC比值123456透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值解决1min解决3min对照2思考题 （1）用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充足振荡？（2）经紫外线解决后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？实验五 乳酸菌的分离与鉴定（一）实验五 乳酸菌的分离与鉴定（二）一、实验目的：了解乳酸菌的菌落特性及细胞形态；学习乳酸菌的分离及鉴定原理。二、实验原理：许多种类的微生物（重要是细菌）在厌氧条件下分解已糖产生乳酸的作用称为乳酸发酵。能运用可发酵糖产生乳酸的细菌通称为乳酸细菌。乳酸细菌多是兼性厌氧菌，在厌氧条件下通过EMP途径，发酵已糖进行乳酸发酵。常见的乳酸细菌有链球菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属和明串珠菌属等。酸奶是一种常见的乳酸饮料，它是以牛奶为重要原料，加入一定量的糖类，接入一定量乳酸菌，通过发酵后而制成的饮料。三、实验材料和用品：1.器材：恒温培养箱，超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，三角瓶，电子天平，PH试纸，EP管，微量移液器2.药品：溴甲酚绿，脱脂奶粉，酵母膏，琼脂，BCG牛乳培养基，乳酸菌培养基3.材料：新鲜酸奶四、实验环节：1 乳酸菌的分离（1）BCG牛乳培养基的配制BCG牛乳培养基的制备比例见下（100mL）：A溶液：脱脂乳粉 20g 水 100mL 1.6%溴甲酚绿（BCG）乙醇 0.2mL B溶液：酵母膏 2g 水 100mL 琼脂 4g其中A溶液80灭菌20min，B溶液调pH6.8，121湿热灭菌15min，无菌混合倒平板。（2）梯度稀释（无菌操作）用量程为200L的移液器从市售新鲜酸乳中吸取0.1ml酸乳加入盛有0.9ml无菌水的EP管中充足混匀。然后换枪头从此试管中吸取0.1ml加入另一盛有0.9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3,10-4, 10-5,10-6不同稀释度的酸乳稀释液。（3）涂布平板将释倍数分别为10-4、10-5、10-6的样品溶液涂布到BCG牛乳培养基上，37.5培养48h。选取圆形稍扁平的黄色菌落及其周边培养基变为黄色者初步定位乳酸菌。2乳酸菌的鉴别与传代培养（1） 脱脂乳试管的制备直接选用脱脂乳粉与5%蔗糖水为1:10比例配制，装量为试管的1/3，115灭菌15min备用。（2）乳酸菌的鉴别选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，37.5培养箱中培养824h，观测若其中牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色呈阳性的细菌为乳酸菌。可将其连续传代4-6次，最终选择出在36h能凝固的牛乳管，作为菌种保存待用。五、注意事项1.采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特性的黄色菌落，结合镜检观测，有利高效分离筛选乳酸菌。2.牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间，防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。六、实验报告1.实验结果将所分离到细菌的菌落特性、革兰氏染色、细胞特性、脱脂乳试管中的牛乳出现凝固时间、有无气泡、酸碱性等特性记录下来。2.思考题发酵酸乳为什么能引起凝乳？实验六 固态发酵实验米曲霉的培养一、实验目的通过三角瓶固态培养米曲霉，使学生掌握固态培养微生物原理和技术，学会对微生物工艺条件进行初步的实验设计二、实验原理固态培养微生物，是我国传统发酵工业的特色之一，具有悠久的历史，在白酒、黄酒、酱油、酱类等领域中广泛应用。固态培养微生物，重要用于霉菌的培养，是细菌和酵母菌也可采用此法。其重要优点是节能，无废水污染，单位体积的生产效率较高。实验室固态培养重要采用三角瓶培养。固态培养方法重要有散曲法和块曲法，酱油米曲霉培养属散曲法。本实验采用的米曲霉属曲霉菌，菌落初为白色，黄色，继而变为黄褐色或淡绿褐色，反面无色。三、实验设备和材料器材：试管、纱布、牛皮纸、250ml三角瓶、高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床原料和试剂：马铃薯、葡萄糖、琼脂、豆饼粉、麸皮、面粉菌种：实验室保存的米曲酶菌种四、实验环节米曲霉的培养：本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段。三角瓶培养物在工厂常作为一级种子。（一）米曲霉试管斜面菌种的制作1.PDA培养基：先将马铃薯洗涤、去皮、切碎，称取200g和500ml蒸馏水混合后煮开，然后缓缓煮1小时，单层纱布过滤后滤液与其他成分（葡萄糖20g，琼脂15-20g）混合并加水至1000ml，自然PH。制好培养基，灌装入试管中，塞好棉塞，包扎好牛皮纸，在121高压蒸汽灭菌15分钟。摆成斜面，经培养检查灭菌彻底，即可接种培养。2.用无菌操作法将砂管菌种中的含孢子砂土铲取少量放入经灭菌的装有23ml的无菌水试管中，摇匀制成菌种悬液，再将菌种悬液用接种环涂抹在斜面培养基上。3.将接种后的斜面放置在恒温箱内培养，30度培养3d，查无杂菌，黄绿色孢子旺盛则可作为菌种，再转接几次，使菌种充足活化，二是菌种量在试管培养的过程中有所扩大。（二）孢子悬液制备用无菌水洗下出发菌株的斜面孢子，置摇床上150rpm/min振荡分散30min，经四层无菌纸过滤，制成孢子浓度约为106个/ml的单孢子悬浮液。（三）三角瓶菌种培养1按豆饼粉20g，麸皮60g，面粉20g，水6570ml的配方混合均匀，分装入250ml的三角瓶中，每瓶20g，混匀，并用四层纱布盖在瓶口，上面再用牛皮纸包扎好。将包扎好的三角瓶放入灭菌锅中，121高压蒸汽灭菌30min，灭菌后趁热摇松备用。2在超净台内，将35ml米曲霉孢子悬浮液接入三角瓶中，并摇匀。3接种的三角瓶，置于恒温箱中30度培养1820h后，见白色菌丝生长，将欲结块，摇瓶一次，充足摇散。继续培养6h，菌丝大量生长又结成饼，再摇瓶一次，并将瓶横放培养，约经3天培养基颗粒表面充满黄绿色孢子，即立即使用，或放入冰箱中，4度下可保藏10d。（四）种曲质量检查1观测种曲的颜色，鲜黄绿色为最佳，淡黄色为培养过嫩，黄褐色为过老。有白色、黑色等异色显示有其他霉菌污染。孢子产量少，意味曲菌生长繁殖不良，多则是温度控制不合理。2种曲应有曲香，如有酸气或氨味表达细菌污染严重。3取少量种曲放入50ml无菌水中，2530度培养23d，产生恶臭，表达种曲严重不纯，不能采用。五、实验报告 1.记录实验结果描述米曲霉种曲的颜色、种曲应有曲香以及种曲的生长情况等。2.思考题：根据状态分类，培养基有哪些？