资源描述
植物染色体组型分析
一、实验目的
1. 学习并掌握根尖解决、染色、压片及制片观测的方法。
2. 观测有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。
3.观测分析植物细胞有丝分裂中期染色体的长短、臂比和随体等形态特性；学习染色体组型分析的方法。
二、实验原理
植物根尖的分生细胞的有丝分裂，天天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，通过染色和压片，再置放在显微镜下观测，可以看到大量处在有丝分裂各时期的细胞和染色体。
各种生物染色体的形态、结构和数目都是相对稳定的。每一细胞内特定的染色体组成叫染色体组型。
染色体组型分析就是研究一个物种细胞核内染色体的数目及各种染色体的形态特性，如对染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体有无等观测，从而描述和阐明该生物的染色体组成，为细胞遗传学、分类学和进化遗传学等研究提供实验依据。
染色体组型分析大都采用植物根尖等分生组织的有丝分裂中期细胞，染色体制片规定分裂相为染色体分散，互不重叠，能清楚显示着丝点位置。然后通过显微摄影，测量放大照片上的每个染色体的长度和其它形态特性，依次配对排列，编号，并对各对染色体的形态特性作出描述。
三、实验材料
1.材料：洋葱（Aillumcepa）的鳞茎，黑麦，蚕豆（Viciafaba）的种子，
2.用品：载玻片，盖玻片，50ml烧杯，温度计，恒温水浴锅，试剂瓶，镊子，解剖针，吸水纸，剪刀，绘图，纸胶水等。
3.药品：Carnoy固定液，70％酒精，酸酒精，0.002M8-羟基喹啉，饱和对二氯苯水溶液，秋水仙素，1mol/HCl，石碳酸品红染色液。
四、方法与环节
（一）植物有丝分裂
1、材料解决
先将种子用0.1～0.2%升汞（HgCl2）消毒10分钟，清水洗净后，置于23-25℃下发根至0.5cm，再移入0.05-0.1%秋水仙素溶液，根尖朝下且浸在药液中，25℃下培养直至根尖膨大。将洋葱，或黑麦，或蚕豆发根，待根长到1.5-2.0cm左右时备用；
在分裂高峰期前3h，用0.002M8-羟基喹啉，或对二氯苯饱和水溶液，或0.02％秋水仙素溶液中，预解决3—4h；或放入冰箱(0—4℃)中预解决24h。
前解决的作用，重要是阻碍纺锤丝的形成，使染色体缩短，改变细胞质的粘度，在压片时，有助于染色体的分散。
2、材料固定
通过前解决的根尖，再放到Carnoy液中固定24h以内。固定材料可以转入70％酒精中，在4℃冰箱中保存，保存时间最佳不超过二个月。
固定的目的在于将细胞迅速杀死，使细胞结构尽也许保持本来的状态。
3、材料解离
方法：从固定液中取出根尖，用蒸馏水漂洗，再放到：
①1mol/LHCl中，在60℃水浴中恒温解离8—10min；
②用95％的酒精∶浓盐酸＝1∶1的溶液解决8—10min；
倒去解离液，再加入固定液5ml，软化5min，然后倒去固定液，用蒸馏水反复冲洗使材料呈白色微透明。
4、制压、镜检
切取根尖分生组织放在清洁的载玻片，剥取分生组织，滴加1-2滴苯酚品红染液，染色8～12 min后加上盖玻片，覆以吸水纸压片，45%醋酸粉色、镜检。
（二）核型分析
1、测量：依次测量放大照片各染色体长臂和短臂的长度（随体是否计入臂长须注明）。
根据测量、记录染色体形态测量数据计算：
绝对长度（μm）=放大的染色体长度÷放大倍数
染色体组总长度=该细胞单倍体所有染色体长度（涉及性染色体）之和
相对长度（%）=每个染色体长度÷染色体组总长度×100
臂比=长臂长度÷短臂长度
着丝粒指数=短臂÷该染色体长度×100
2、配对：根据测量数据，即染色体相对长度、臂率、着丝粒指数、次缢痕的有无及位置、随体的形状和大小等进行同源染色体的剪贴配对。
3、排列：
⑴染色体对从大到小依次排列；等长染色体对，短臂长的在前；具随体染色体、性染色体可单独排在最后。
⑵异源的染色体要分别排列（如小麦的A、B、D染色体组）
4、剪贴：把上述已经排列的同源染色体按先后顺序粘贴在绘图纸上。粘贴时，短臂向上、长臂向下，各染色体的着丝粒排在一条直线上。所得组型图。
5、分类： 臂比是反映着丝点在染色体上的位置。根据此可拟定染色体所属的形态类型。
染色体形态类型：臂比（长臂/短臂） 形态类型。
1～1.7M中着丝粒染色体；1.71～3.0SM近中着丝粒染色体；3.01～7.0 ST近端着丝粒染色体；＞7.01T端着丝粒染色体；SAT随体染色体。
6、填表：将上述结果整理成“染色体形态测量数据表”
染色体
序号
绝对长度
（um）
相对长度
%
臂比
（长/短）
染色体
类型
1
17.5
23.9
1.26
M
2
15.5
21.1
1.21
M
3
14.24
18.9
1.59
M(SAT)
4
13.5
18.4
2.375
SM
5
13 17
7 7
0
M
总长度：73.75 um(单倍的染色体实际总长) 平均相对长度：20
7、综合描述
⑴计数体细胞染色体数目：记录细胞数≥30，85%具有恒定一致的数目；
⑵以分裂中期、高质量的体细胞染色体图像作为形态描述，以5个以上的细胞染色体，测其平均值。
⑶核不对称系数（Ask）＝长臂总长÷全组染色体总长×100%
⑷染色体的长短：按Kuo等的方法，以染色体相对长度系数（I.R.L）组成划分染色体的长短，即I.R.L≥1.26为长染色体（L）；1.01≤I.R.L≤1.25为中长染色体（M2）；0.76≤I.R.L≤1.00为中短染色体（M1）；I.R.L﹤0.76为短染色体（S）。2n=24=8L+2M2+10M1+4S。
相对长度系数（I.R.L）= 每条染色体的相对长度÷染色体的平均相对长度
⑸染色体组型分类：Stebbins(1971)核型分类表。
染色体长度比
臂比值＞2的染色体的比例
0.00
0.01-0.50
0.51-0.99
1.00
＜2 ：1
1A
2 A
3 A
4 A
2：1-4：1
1B
2 B
3 B
4 B
＞4：1
1C
2C
3C
4C
染色体长度比＝最长染色体长度÷最短染色体长度
染色体组型类型1A为最对称型，4C为最不对称型。
⑹染色体组型的公式：芍药 2n=2x=10=8M(2Sat)+2SM=6M+2SAT+2SM
⑺染色体组型模式图：根据各染色体的相对长度平均值绘制一坐标图。横轴上标明各染色体序号，每一染色体与其序号相相应，纵轴表达相对长度值(％)，零点绘在纵轴的中部，并与各染色体的着丝点相相应。此即为该细胞的染色体组型模式图。
六、实验报告
做出蚕豆的染色体组组图、染色体组型分析表、染色体组型模式图。
染色体形态测量数据表
染色体序号
项目
长臂长度
q
短臂长度
p
染色体全长
q+p
臂比q/p
染色体类型
1
实测值（mm）
M(SAT)
绝对长度（um）
相对长度（%）
2
实测值（mm）
绝对长度（um）
相对长度（%）
3
实测值（mm）
绝对长度（um）
相对长度（%）
n
总长度：73.75 um(单倍的染色体实际总长) 平均相对长度：20；测微尺：x mm→10um
姐妹染色单体色差方法
一、实验原理
在DNA复制过程中，核苷的类似物5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridine简称BrdUrd）或5-碘尿嘧啶核苷（5-Iodo-2′-deoxyuridine简称IdUrd）可以代替核苷酸掺入新合成的DNA链，并占有胸腺嘧啶（Thymidine，T）的位置。哺乳类细胞在具有适当浓度的BrdUrd的培养液中经历二个分裂周期之后，其中期染色体的两个单体的DNA双链在化学组成上就有了差别：即一条染色单体的两股DNA的T位完全由BrdUrd代替，而另一条染色单体的两股DNA中的一股含BrdUrd，另一股则不含 BrdUrd。这样的细胞通过制片和苯并咪唑荧光染料（Hoechst-33258）染色后，在荧光显微镜下可观测到两条姐妹染色单体显示强弱不同的荧光。两股DNA链都具有BrdUrd的单体荧光较强，其中只有一股有BrdUrd的单体荧光较弱。但由于荧光染料发出的荧光消失较快，只能立刻在荧光显微镜下照相而不能长期保存。1974年Korenberg和Freedlender改善了这一技术，单独用Giemsa染色即获得姐妹染色单体差别染色（sister-chromatiddifferentialstaining简称SCD）。
来自一个染色体的两条单体之间同源片断的互换称为姐妹染色单体互换（sister-chromalidexchange，简称SCE）。这种互换是完全的，对称的。由于姐妹染色单体染色上的明显差异，假如姐妹染色单体间在某些部位发生互换，则在互换处可见有一界线明显、颜色深浅对称的互换片段，故SCE易于计数，即使在一定距离内发生多次互换，也可被检测出来。
目前认为SCE反映了DNA的损伤，可以使用SCE作为哺乳类动物突变形成的指标。由于SCE分析方法比观测染色体畸变更简便、迅速、敏感，并表现出很好的剂量效应关系，因此，目前已将此法列为检测诱变剂或致癌物的常规指标之一。
二、实验试剂
1. RPMI1640，肝素，植物凝血素（PHA），秋水仙素，青、链霉素，姬姆萨染液等。
2. 小牛血清：最佳通过透析解决。将小牛血清装入透析袋中，用线扎紧封口，小心检查，切勿有漏孔。然后将透析袋放在盛有双重蒸馏水的玻璃器皿中，每隔1—2小时换一次水，搁置在4℃冰箱中，24小时后赛氏滤器灭菌过滤。
3. 3.5% NaHCO3溶液：称3.5克NaHCO3，用100毫升双蒸水溶解，10磅15分钟高压灭菌，调节pH用。
4. BrdUrd 溶液：用无菌青霉素瓶，在普通条件下用分析天平称取BrdUrd2毫克，然后在无菌室内加入灭菌生理盐水4毫升，母液的浓度为0.5毫克/毫升。用黑布避光，置冰箱中保存。最佳现配现用。
5. 1 mol/LNaH2PO4，pH8.0的溶液；称取120克NaH2PO4，加入1 000毫升双蒸水，用NaOH粉末调pH至8.0即可。
6. 2×SSC溶液（0.3 mol/L氯化钠，0.03 mol/L枸橼酸钠，称取NaCl 17.54克，枸橼酸钠8.82克，各用蒸馏水1 000毫升溶解，使用时两溶液等量混合。
7. pH为6.8 的mol/L/15磷酸缓冲液：
甲液：取KH2PO49.08克，溶于1000毫升蒸馏水中。
乙液：取Na2HPO2·2H2O11.88克或Na2HPO4·12H2O23.87克，溶于1 000毫升蒸馏水中，将50.8毫升的甲液与49.2毫升乙液混合，即得pH为6.8的mol/L/15磷酸缓冲液。
三、实验设备
1. 2毫升和1毫升灭菌注射器
2. 吸管，移液管，离心管
3. 量筒，烧杯
4. 无菌青霉素瓶，试剂瓶，培养瓶
5. 酒精灯
6. 载玻片
7. 天平
8. 紫外灯（15 W）
9. 离心机
10. 恒温培养箱
11. 显微镜
四、实验材料
人的外周血。
五、实验环节
1. 在无菌条件下，用20毫升的青霉素瓶分装5毫升培养液，其中RPMI1640占80%；小牛血清占15-20%；PHA 0.2毫升；青霉素 100单位/毫升；链霉素100微克/毫升。最后用3.5% NaHCO3调节pH至7.2-7.4。
2. 每5毫升的培养液中加入BrdUrd0.1毫升，最终浓度为10微克/毫升。
3. 每瓶培养液中加入0.3毫升静脉血，轻轻摇匀，用黑布避光，立即置37℃温箱中培养。
4. 培养72小时左右，加入秋水仙素0.4-0.8微克/毫升，继续培养4小时。
5. 按常规收集细胞，用0.075 mol/LKCl或蒸馏水低渗20分钟，用甲醇：冰醋酸3：1配制的固定液固定两次，每次15分钟，用气干法制片，一天以后将染色体制片放入70-80℃烤箱中烘烤1-2小时，或放在37℃温箱中存放备用。
6. 染色体标本的差别染色方法有两种：
（1） 碱的热溶液解决：将染色体标本浸在88℃的 1 mol/LNaH2PO4（pH为8.0）的溶液中，解决20分钟，取出后立即用蒸馏水冲洗，用常规Giemsa染色5分钟，再用蒸馏水冲洗，干燥，观测。
（2） 紫外灯照射诱发：染色体标本在37℃条件下搁置24小时后取出，放在45—48℃的水浴锅上，覆盖一层2×SSC溶液（0.3 mol/LNaCl，0.03 mol/L枸橼酸钠），15 W紫外灯照射20-30分钟，灯管与载玻片之间距离为6厘米（照光期间防止2×SSC溶液干涸）。照射完毕，用蒸馏水冲去2×SSC，用3%Giemsa（pH6.8磷酸缓冲液稀释）染色5—10分钟，水洗，气干后镜检。
7. 在普通光学显微镜下观测，可见姊妹染色单体呈现鲜明的深浅不同的颜色。
六、注意事项
1. 在本方法的基础上，如将培养基组成、培养液的酸碱度、培养温度或培养时间等因素略加变动，可合用于其他一些哺乳动物、鸟类或两栖类动物淋巴细胞的培养，用以观测它们的姊妹染色单体色差。例如中华大蟾蜍淋巴细胞培养时，所用的培养基组成除RPMI1640外，还补充一定量的水解乳蛋白，培养基的pH为7.0-7.2，培养温度为26℃。
2. BrdUrd溶液最佳现配现用，一次使用不完，必须有黑布避光，4℃冰箱保存。
3. BrdUrd在培养开始时加入，或在培养后的24小时加入均可。
4. 用紫外灯照射诱发姊妹染色单体互换时，如紫外灯功率大，W数高，照射的时间就相应地减少。
遗传多样性的分子检测(DNA指纹技术)
【实验原理】
u “DNA指纹”是指运用DNA差异来进行与传统指纹分析相似的身份辨认。DNA指纹是以DNA的多态性为基础，而卫星DNA的发现则是其最重要的奠基石。
u 卫星DNA是由一短序列（即反复单位或核心序列）多次反复而成，因此也有人称其为可变数目串联反复序列（variable numbers of tandem reprat，VNTR）,在人类基因组中存在多种由不同反复单位组成的卫星DNA，反复单位的碱基序列在不同个体中具有高度的保守性，而卫星DNA的多态性则来源于反复单位的反复次数不同，并形成了众多的等位基因。例如，人类1号染色体上的VNTR D1S80，核心序列由16个核苷酸组成，拷贝数在14～41个之间，已知有29种不同的等位基因。
DNA指纹图谱的基本特点：
u 多位点性：基因组中某些位点的小卫星反复单位具有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。
u 高变异性：DNA指纹图谱反映的是多个位点上的等位基因的特性，具有很高的变异性。发现两个无血缘关系个体具有相同DNA指纹图谱的概率仅为5×10-19，因此，除了同卵双胞胎，几乎不也许有两个人的DNA指纹图谱完全相同。
u 稳定的遗传性：DNA指纹图谱中的谱带可以稳定遗传，杂合带遵守孟德尔遗传规律。子代DNA指纹图谱中产生与双亲都不同的新带的概率（基因突变）仅在0.001～0.004之间。DNA指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的DNA作出的DNA指纹图谱是一致的。
【材料】
人类口腔细胞。
【仪器与试剂】
1． 仪器
微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，漩涡振荡器，PCR仪，电泳仪，电泳槽，透射式紫外分析仪（或凝胶成像仪）。
枪头，1.5mL，0.2 mL离心管，棉签，使用前均需121℃高温灭菌
2．试剂
NaCl，琼脂糖，溴化乙锭，Na2-EDTA，SDS，Tris，Proteinase K，冰醋酸，溴酚蓝，二甲苯腈蓝，蔗糖，甘油，DNA相对分子质量标记，Chelex 100树脂（Bio-Rad），PCR pre-mix。
3．溶液配制
（1）5% Chelex树脂
Chelex 100(Bio-Rad) 0.5g
50mmol/L Tris-HCl 10mL
用4mol/L NaOH调pH至11，室温可保存3个月，使用前充足混匀。
（2）2.0％琼脂糖凝胶
称2.0g琼脂糖放入250ml三角烧瓶，加 入1×TAE溶液100mL微波炉加热溶解，冷却至60℃左右加入1μg/mL溴化乙锭（EB），缓慢混匀后倒胶板。
（3）溴化乙锭（EB）
用无菌水配制5mg/mL储藏液，工作浓度1μg/mL。
注意；溴化乙锭为诱变剂，有致癌作用。配制、稀释和染色时必须戴手套。
（4）0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Na2-EDTA 18.61g
NaOH 2g
蒸馏水定容至100mL，室温保存。
（5）10×TAE电泳缓冲液
Tris 48.4g
冰醋酸 11.42mL
0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20mL
蒸馏水定容至1000mL，室温保存。
（6）10%SDS
SDS 10g用无菌水溶解后（可加热），定容至100mL，室温保存。
（7）蛋白酶K溶液
20mg/mL蛋白酶K水溶液 5mL
10%SDS 1mL
无菌水 94mL
冰箱冷藏。
（8）无菌水：蒸馏水或去离子水，高温灭菌。
（9）1mol/L Tris-HCl(pH8.0)
将12.1g Tris溶解在80mL蒸馏水中，加盐酸调节pH至8.0，加蒸馏水定容至100mL。
4．引物
Primer1：5’-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3’
Primer2：5’-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3’
【实验环节】
1．收集DNA样本
（1）先漱口，然后用灭菌的牙签充足擦刮口腔内壁，将该牙签放入 1.5mL装有1mL无菌水的小离心管中，使粘附在牙签表面的口腔细胞悬浮其中（以能看到悬浮物为好）。震荡10s，10000 r/min离心1min。
（2）从离心管中吸出970μL无菌水，注意不要吸到沉淀。
（3）向离心管中加入200μL 5% Chelex 100，震荡10s混匀。
（4）加入2μL蛋白酶K，混匀，56℃保温5min。
（5）剧烈震荡10s,沸水浴8min。
（6）10000r/min离心3min，离心管中溶液提成上下两层：下层为Chelex100和细胞碎片的沉淀，上层溶液含DNA分子，可以直接用作PCR模板。
此DNA样本可在4℃或-20℃保存，必要时可在使用前再次加热并离心，使管内物质分层。
2．PCR扩增D1S80等位基因
（1）每个人用记号笔在0.2mL PCR管上做好标记。
（2）准备冰盒，开始反映前尽量使PCR管保持在冰上。
（3）依次加入下列成分，配制25μL体系的PCR反映溶液：
PCR pre-mix 12.5μL
引物1 1μL
引物2 1μL
口腔细胞DNA样本 10μL
加无菌水至总体积25uL。
（4）轻弹管壁，混匀溶液。
（5）离心10s，使管壁上的液滴落下。
（6）按下列程序开始PCR反映：
94℃，1min
$
94℃，15s
68℃，15s
72℃，15 s
30个循环
$
72℃，10min
$
4℃暂时放置，直至开始电泳
3．PCR扩增产物鉴定与D1S80等位基因分析
（1）用1×TAE电泳缓冲液配制2.0%琼脂糖电泳凝胶。
（2）60V预电泳1～2min。
（3）在凝胶上选一孔加入6µL的DNA相对分子质量标记（DNA100bp Ladder）。
（4）每位同学将各自的20µLD1S80 PCR扩增产物加入指定凝胶样孔，注意不要有气泡进入。
（5）60V电泳40min-50min。
（6）取出凝胶用清水漂洗。
（7）用紫外分析仪观测凝胶，记录每个个体的DNA条带数目及其位置。
【结果与分析】
本次实验所选择的方法是D1S80指纹图谱分析的常用方法。人群中D1S80座位的杂合率约为86％。从理论上讲，也许存在435种不同的等位基因组合。运用D1S80座位两侧序列设计的引物（Kasai et al，1990），通过PCR反映，很容易拟定特定个体的D1S80等位基因构成，纯合体只有一条DNA带，而杂合体有两条不同的DNA带。
1． 将小组的电泳结果拍照，并把照片贴在实验报告上，对照片进行必要的说明，例如，相对分子质量的标记各片段的大小（bp）。
（见附图）
2． 根据电泳结果，填写D1S80等位基因分析结果（表7-1）：
D1S80 DNA指纹特性
学生姓名
大小/bp
长度（反复数）
杂合/ 纯合
小组成员A
460
19.688
杂合
小组成员A
380
14.688
杂合
小组成员D
590
27.812
杂合
小组成员D
480
20.938
杂合
表7-1 结果登记表
注：由于反复数为l的DIS80 PCR 产物长161bp，所以，反复数每增长一个，序列增长长度16 bp。据此可以催算：
反复数=1+（PCR产物大小－161）/16
3．在班级中调查有无同学D1S80指纹图谱完全相同或部分相同。自行查找有关人群中D1S80各等位基因频率的资料，计算两个没有亲缘关系的个体，其D1S80指纹图谱完全相同或部分相同的概率。
从各小组的电泳紫外图谱看，有一些同学的DNA指纹图谱看起来有些相似，但鉴于本次实验误差大，难以拟定其指纹图谱是相同的。理论上也许存在435种不同的等位基因组合。那么D1S80指纹图谱完全相同的概率应为1/(435*435)=1/189221.
【讨论】
从图电泳图可以看出，只有A、D两小组成员的条带清楚明显。小组成员E的PCR产物聚集在加样孔中没有迁移，也许是由于其产物不存导致的；其他成员均没有条带或很浅，也许是由于收集的DNA样本过少，未能PCR出足够的扩增产物。
【思考题】
用PCR、RFLP、RAPD方法产生DNA指纹图谱各有哪些利弊？
答：RFLP分析对样品纯度规定较高，样品用量大，环节繁琐、工作量大、成本较高；RADP图谱中某些弱带反复性较差，并且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反映条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；
Y染色体基因标记的遗传学分析
细菌16s rRNA基因进化分析
ABO血型的遗传学分析
A BO 血型是发现最早、应用最广泛的人类血型,
ABO 血型物质广泛地分布在人体组织和体液中。1990
年, Yamamoto 等[ 1] 报道了ABO 系统的糖基转移酶基
因碱基序列分析结果, 提出了应用PCR 扩增和等位基
因特异性限制酶消化检测ABO 基因型的方法。随后
Lee 等[ 2] 、Crouse 等[ 3] 、Ladd 等[ 4] 、Akane 等[ 5] 、Herrin
等[ 6] 相继报道了ABO 基因型测定方法。通过比较, 我
们选择Herrin 方法, 采用2 对引物复合扩增ABO 糖
基转移酶基因中的2 个区段, 限制酶Kpn Ⅰ和Alu Ⅰ
同时消化扩增产物, PAGE 和银染, 获得ABO 系统的
6 种基因型图谱。对125 例汉族无关个体ABO 基因型
进行调查, 基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡, 现
报告如下。
1 材料与方法
1. 1 样本 从武汉市同济医院血库随机收集125 例
健康成人EDTA 抗凝血, 经血清学方法测定, 其中A
型43 例、B 型32 例、O 型41 例和AB 型9 例。全血样
用细胞裂解/ 蛋白酶K法提取DNA , - 30℃保存备用。
1. 2 引物由Bio-Tech 公司合成, 引物序列为: 引物
1: 5′-
CACCGTGGAAGGAT GTCCTC-3′;
引物2: 5′-
AAT GT CCACAGT CACT CGCC-3′;
引物3: 5′-
GTGGAGAT
CCT GACTCCGCT G-3′;
引物4: 5′-CACCGACCCCCCGAAGAA-
3′。
1. 3 PCR 扩增 反映体积25l , 其中含1. 5mmol/ L
MgCl2 , 1 × 缓冲液, 200mo l/ L dNTP, 200g BSA,
1. 25U T aq DNA 聚合酶, 引物1、2 各125pmol/ L, 引
物3、4 各62. 5pmol / L, 模板DNA 8l。扩增热循环参
数: 95℃ 2 分钟; 95℃ 30 秒, 60℃ 10 秒, 72℃ 45 秒,
共30 个循环; 72℃延伸10 分钟。
1. 4 酶切消化 扩增产物中直接加入Kpn Ⅰ 和
AluⅠ各2. 5U , 置37℃孵化30 分钟。
1. 5 垂直PAGE 分离和银染 电泳用T 6% , C5% 聚
丙烯酰胺凝胶( po lyacr ylamide g el , PA G) 内含尿素
4mo l/ L、0 . 5×T BE , 电泳条件恒压550 伏, 40 分钟。设
置pBR322/ MspⅠ分子量标准作对照。银染按余纯应
等[ 7] 方法。
1. 6 记录学分析 125 例血样分型并记录基因型, 对
基因型频率分布作2 检查。
2 结果
2. 1 6 种基因型谱带清楚分型明确。6 种基因型的复
合扩增产物均由200( 199) bp 和159bp 两条带组成。
但经酶切消化后共出现4 种特异型片段长度: 片段1
为200( 199) bp、片段2 为171bp、片段3 为159bp、片
段4 为118bp。6 种基因型鉴定: 片段1+ 3 为A A 型,
片段1+ 2+ 3 为AO 型, 片段1+ 3+ 4 为AB 型, 片段
1+ 4 为BB 型, 片段1+ 2+ 3+ 4 为BO 型, 片段2+ 3
为OO 型( 图1) 。
2. 2 武汉地区125 例汉族无关个体基因型分布及基
因频率见表1。
3 讨论
Yamamato 等[ 1, 8] 从不同ABO 型别的结肠癌患者
的细胞株SW948、SW48、COLO205 和SW1417 中提
取poly( A ) -RNA, 与 g t10 构建4 个cDNA 文库。经
过筛选、测序后发现A 基因和B 基因之间有7 个单碱
基替换: A294G、C523G、C654T、G700A 、C793A、
G800C 和G927A。而O 基因在靠近N 端出现258G 单
碱基缺失, 形成移码变异, 编码出无糖基转移酶活性的
蛋白质。其后作者又研究了14 例具不同ABO 型个体
的血样和细胞株, 拟定A、B 基因之间的3 个单碱基替
换以及O 基因258G 缺失形成的等位基因特异性限制
酶辨认位点。
我们选择的2 个特异性限制酶辨认点为G700A
和258G 缺失。引物1 和2 扩增片段200( 199) bp, 包含
258 位碱基。A 、B 基因扩增片段200bp, O 基因扩增片
段199bp, 因O 基因258G 缺失构成Kpn Ⅰ辨认点, 酶
切后为171bp 和28bp, 故171bp 片段出现则说明有O
基因。引物3 和4 扩增片段159bp, 包含700 位碱基,
A、O 基因均为700G, 仅B 基由于700A, 构成Alu Ⅰ
辨认点, 酶切后产生118bp 和41bp, 所以118bp 片段
出现说明有B 基因( 图2、表2) 。我们选择方法的特点
是在同一反映管里复合扩增2 条特异性片段, 扩增产
物同时用2 种限制酶消化, 操作比较简朴, 且能节约模
板DNA 量。125 例血样基因型检测与血清学检测结果
所有吻合, 证实本法分型稳定, 反复性良好。电泳分离
改用PAGE, 经银染显示结果, 提高了检测灵敏度, 分
型结果可长期保存。
125 例汉族无关个体ABO 基因型分布见表1。基
因频率分布符合Hardy-Weinber g 平衡( P > 0. 50) 。
A、B 和O 基因型频率分别为0. 244、0. 176 和0. 580,
与湖北地区血清学分型36 932 例的调查结果相吻合
( P > 0. 05) [ 9 ] 。
基因型测定可以鉴别BB 和BO 型, AA 和AO
型, 因此法医学个体辨认能力应高于血清学检测, 依本
次调查结果计算, Dp 值为0. 7536, 略高于常规血型测
定。基因型分型检测材料是基因组DNA, 法医学个体
辨认应用范围广泛, 如ABO 非分泌型的体液斑痕, 提
取其中体细胞DNA, 则可鉴定其ABO 基因型。复合
PCR-RFLP 技术为法医学ABO 型鉴定提供一新的方
法。分型测定中, 限制酶液宜新鲜配制, 低温保存备用。
研究中我们发现反复冻融可使限制酶活性下降, 使酶
消化不完全, OO 型出现未消化完的199bp 片段而误
判为A O 型; BB 型出现159bp 被误判为AB 型。因此
在实际应用时建议设立已知O 型和BB 型血样作对
照, 可避免因酶活性下降导致的误判。另一方面, 限制酶工
作液应低温保存, 使用时间不超过1 周为好。
人类若干体表性状的遗传分析
人工诱发多倍体植物
一、实验目的
1、掌握人工诱导多倍体的原理，及其在遗传育种中的意义。
2、掌握用秋水仙素诱发多倍体的方法。
3．观测植物多倍体的特点，鉴别植物染色体数目的变化及引起植物其他器官的变异情况。
二、实验原理：
秋水仙素溶液的重要作用是克制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体向两极的移动被阻止，而停留在分裂中期的分布，
这样细胞不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。若染色体加倍的细胞继续分裂，就形成多倍性的组织．由多倍性组织分化产生的性细胞，可通过有性繁殖方法把多倍体繁殖下去。假如将种子用秋水仙素浸渍，也可诱导多倍体植株产生。
三、实验材料
大蒜根尖（2n=16）
四、实验器具和药品
l．用品：
显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、镊子、刀片、滴管、吸水纸。
2．药品：
0.1％秋水仙素溶液、卡诺固定液、
1mol／L HCl
溶液、改良石炭酸品红溶液。
五、实验环节
1诱导：
先剪去大蒜的老根，然后置于盛满水的烧瓷盘中，等新长出的不定根长约1.5－2cm左右时，移到盛有0.1％秋水仙素中，直到根尖膨大为止。诱导后细胞为多倍体细胞；（根长2-3cm时，剪下根尖约1cm，用水洗净。吸干水，浸入0.02％的秋水仙素中，25℃解决24h。）
2固定：切下已膨大的根尖，水洗后用卡诺固定液固定12h；
3冲洗：用70%酒精冲洗三次，保存在70%酒精中备用；
4解离：取保存的根尖用1mol/L HCl 60℃解离8min；
5捣碎：将解离好的捣碎；
6染色：用改良石炭酸品红溶液染色10min；
7压片；
8镜检：显微镜下观测。
六、作业
绘制显微镜下观测的二倍体和四倍体的图像。
诱变物质的微核检测技术
1. 引言
微核是细胞在间期时，染色体发生断裂，在进入下一次分裂时，染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞，而在细胞浆中形成直径小于主核的、与主核分开的微小核，重要由外界损害因素（生物、物理、化学因素）对细胞的作用形成的。
19世纪末，Howell与Jolly分别在猫和大鼠外周血中发现一种小体，命名为Howell-Jolly小体，并且发现这种小体也存在于恶性贫血患者外周血中。这一小体便是今日被称之为微核的小体。
1959年，Evans等将蚕豆根端细胞暴露在电离辐射下，观测到辐射诱导微核形成效应，并据此间接推断微核来源于辐射诱导的染色体异常。这篇文献便是以微核发生率反映染色体异常来评价遗传毒性的第一篇报道。作者认为约60%染色体断片与微核形成直接相关。
1970，年Boiler和Sehmid以中国金黄地鼠为材料，观测了抗肿瘤药三亚胺给予后，骨髓与外周血细胞学的变化，并且提出用本来无核的外周血嗜多染红细胞中的微核发生率来作为微核实验的基本指标，并正式命名为微核算验。
70年代初，Matter和Schmid一方面用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑似有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。
此后至70年代中期，Sehmid以及Heddle研究小组的工作，全面奠定了微核算验的理论及应用基础。
近年来，由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出，平常生活中人类接触到的有潜在遗传毒性的物质越来越多，微核算验的重要性也就随之突显出来。
微核算验技术简朴易行且灵敏，目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药实验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面
2. 实验材料及方法
2.1 实验材料
2.1.1实验材料
大蒜。
2.1.2实验器具
显微镜一台，双筒体视显微镜一台；
解剖针两根，眼科镊，载玻片，盖玻片（20mm×20mm），滤纸条，解剖刀片。
2.1.3实验试剂
改良苯酚品红，1mol/LHCl，蒸馏水，卡诺氏固定液，75%酒精，奇力康漱口水（重要成分：金银花，杭白菊，薄荷，维生素E，葡萄糖酸氯已定等）。
2.2 实验方法
2.2.1 材料的获取
将大蒜（选取可生根成熟未经农药解决的大蒜）浸泡水中，于24发根至0.5~1cm（约24~36h），选择根长整齐一致大蒜随机分组。
2.2.2 解决各实验组
实验组：稀释倍数为10、100、500、1000和2023的漱口水溶液；
阳性对照组：0.05M NaN3溶液；
阴性对照组：蒸馏水；
将发根至0.5~1cm的大蒜随机分为7组，分别浸泡于上述溶液中，于24℃继续培养24h（一般植物生长周期17~18h）。
2.2.3 恢复培养
将材料移入蒸馏水中，于24℃恒温培养箱中继续培养24h。
2.2.4 材料的固定及保存
将各组大蒜根尖剪下，分别于卡诺氏固定液中室温固定24h。之后转入75%酒精中4℃保存
2.2.5 制片及观测
①根尖用1MHCl解决的10min，蒸馏水洗涤3次。
②切取近根尖分生区的伸长区组织，用改良苯酚品红染色10~15min。
③压片：加上盖玻片后，用铅笔轻敲使细胞分散，最后垂直压下去。
④镜检：先用低倍镜进行观测，找到好的视野后再转用高倍镜观测。每个根尖计数1000个细胞，记录含微核的细胞数，
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