环境因子对“东方7号”海带配子体发育的影响.pdf

渔业研究，（）：收稿日期：基金项目：国家藻类产业技术体系（）；山东省重点研发计划重大科技创新工程项目（）；山东省农业良种工程项目（）；山东省渔业软科学研究课题（）；国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项（）作者简介：李 霞（），女，工程师，硕士，研究方向为大型海藻种质资源保存及遗传育种。：通信作者：陈书秀（），女，硕士，研究方向为海洋藻类生理生化。：李 霞，陈书秀，王伟伟，等 环境因子对“东方 号”海带配子体发育的影响 渔业研究，（）：环境因子对“东方 号”海带配子体发育的影响李 霞，陈书秀，王伟伟，孙 娟，李晓捷（山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东省海藻与海参技术创新中心，山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东 烟台）摘要：以“东方 号”海带（）雌、雄配子体为材料，分别在不同温度、光照周期和营养盐（氮）浓度条件下培养，观察配子体发育过程，探究配子体卵囊形成、排卵及幼孢子体形成的最适环境条件。结果显示：不同温度、光照周期及氮（）浓度对配子体发育进程及发育率有显著的影响。在其他培养条件相同的情况下，和 下配子体的发育率（）显著高于其他温度组；在 条件下，配子体均处于营养生长阶段，未见发育。下配子体的发育率（）显著高于其他光照周期组，其次为 组，但该条件下的幼孢子体长度显著低于其他光照周期组。当 浓度为 和 时，配子体最终发育率均达 以上，其中孢子体约占，显著高于其他组。本研究为“东方 号”海带配子体人工育苗提供理论依据和数据支持。关键词：海带；配子体；发育；温度；光照周期；氮浓度中图分类号：文献标识码：文章编号：（）海带配子体无性繁殖系育苗是一种利用海带配子体将育种和育苗结合起来的新苗种生产方法。这种育苗方法较传统的孢子体育苗方法有以下优点：）工艺简单，育苗前的配子体培育可在一定规模的器皿中进行，减少了传统育苗需要海上养殖和选择种海带环节。）配子体育苗避免了大量种菜混合繁殖，减少对品种纯度的影响，能够长期保持品种的优良性状，可在较大程度上解决目前海带品种退化、混杂问题。）配子体在室内人工条件下培养，可随时根据生产需要进行采苗、育苗，而不受季节的严格限制，同时也避免了种海带养殖中生长发育时常受到不利因素干扰而影响育苗生产的问题。利用大量的雌、雄配子体进行种苗生产，需解决两个关键的问题：）配子体克隆的丰富培养问题。即需要找出配子体合适的生长条件，使其具有较高的生长速率，获得足够量的克隆以满足种苗生产的需要；）配子体发育调控问题。即选择恰当的时机，摸清关键的诱导因素，使配子体从营养生长状态转为发育状态，诱导孢子体的发生。海带配子体与其他生物一样，其生长发育与环境条件有密切的关系。温度、光照、营养盐、溶解气体、接种密度等环境因子直接影响着配子体的生长发育。迄今关于适宜配子体生长和大规模培养的主要条件和技术参数在相关文献中已有报道，但目前的研究工作还远不能阐明渔业研究第 卷使克隆从营养生长状态转为发育状态所需的诱导因子和恰当的诱导时机。这是目前制约海带配子体克隆技术在生产中应用的两大问题，也是未来研究的重点和方向。本研究以“东方 号”海带（）配子体为材料，在不同光照周期、温度、氮磷营养盐浓度下，观察雌配子体卵囊形成、排卵及幼孢子体形成过程，探究“东方 号”海带配子体发育的适宜环境条件，旨在为“东方 号”海带配子体人工育苗提供理论依据和数据支持。材料与方法 实验材料以本实验室保存的生长状态良好的海带“东方 号”雌、雄配子体克隆系为实验材料。“东方 号”是全国水产原种和良种审定委员会审定的海带新品种，品种登记号为 ，该品种是以宽薄型海带种群和韩国海带地理种群的杂交子代为亲本群体，以藻体宽度等适宜加工性状为选育指标，采用群体选育技术，经连续 代选育而成。在相同栽培条件下，与普通海带品种相比较，其收获期长，叶片宽度提高 以上，淡干产量提高 以上，适宜在中国辽宁和山东沿海栽培。实验方法 配子体的培养取适量的海带雌、雄配子体分别用小型循环泵打碎，目筛绢过滤，取滤液在显微镜下观察，细胞段长度为 左右。雌、雄配子体悬浊液按照相同的细胞密度以体积 的比例进行混合后，取一定量加入到铺满载玻片的培养皿中，附着 后，载玻片上的配子体浓度为显微镜 视野中 个细胞段，即每 约有 个配子体细胞。将附着后配子体分别放置在不同条件下进行培养，每 天更换培养液一次。培养条件设定以灭菌的天然海水为培养液，设置不同的温度、光照周期和营养盐浓度实验组。）温度组。设置、和 五个温度梯度，其他条件为 ，白光，光强 （），光照周期 。每个温度梯度组设置 个平行。）光照周期组。设置 、和 五个光周期，以连续光照（）作为对照组。其他条件为 ，温度 ，白光，光强 （）。每个光周期组设置 个平行。）营养盐组。设置 个营养盐（氮、磷）浓度梯度：浓度分别为、，分别以、表示。其他条件：均为 ，温度，白光，光强 （），光照周期。每个营养盐浓度梯度组设置 个平行。配子体发育指标的测定在显微镜下观察配子体的发育过程，每 天拍照 次，实验周期 。在海带配子体发育成幼孢子体的过程中，雌配子体卵囊形成、排卵和幼孢子体出现时的形态变化明显，易于观察和统计，因此选择发育率即卵囊形成率、排卵率和幼孢子体形成率占总细胞数的百分比作为衡量海带配子体发育的指标。每个培养皿随机观察 个 视野，分别统计卵囊形成、排卵、幼孢子体和总细胞数，发育率为卵囊形成数、排卵数和孢子体数之和占总细胞数的百分比。数据处理采用双因子方差分析检验不同环境因子和培养时间对配子体发育率的影响，采用相同培养条件和相同培养时间下进行单因子方差分析（），并采用 方法进行差异显著性分析，用 进行方差齐性检验，必要时进行数据转化。设 为差异显著，为差异极显著。所有统计分析均采用 软件完成，用 软件作图。结果与分析 不同温度对海带“东方 号”配子体发育的影响方差 分 析 结 果 显 示：不 同 温 度（第 期李 霞等：环环境境因因子子对对“东东方方 号号”海海带带配配子子体体发发育育的的影影响响）、培养时间（）及两者的相互作用（）对海带配子体发育均有显著的影响。图 为雌配子体在不同温度条件下的发育情况。结果表明，在 时，海带配子体仅营养生长；和 处理组第 天开始出现卵囊和排卵现象，和 处理组第 天才开始出现少量的卵囊和排卵现象。随着培养时间的增长，和 处理组第 天开始出现大量的幼孢子体，第 天发育率达到最大值 ，其中约 为多细胞幼孢子体，均显著高于 和 （图 和表）。不同光照周期对海带“东方 号”配子体发育的影响方差分析结果显示：不同光照周期（）、培养时间（）及两者的相互作用（）对海带配子体发育有显著的影响。图 为雌配子体在不同光照周期条件下的发育情况。结果表明，对照组（全光照）海带配子体均处于营养生长阶段；其他 个光照周期条件下，“东方 号”海带配子体均可进入生殖生长阶段，均出现了卵囊、排卵及幼孢子体。当光周期为 和 时，该处理第 天开始出现卵囊和排卵现象，且在 条件下，出现了幼孢子体，但随着培养时间的延长，总发育率未见明显增加，第 天发育率分别约为 和，显著低于 （表）。其他三组均延在第 天开始出现卵囊、排卵及幼孢子体，其中 条件下配子体发育进程及发育率显著高于 和 （表），但光照时间较长（、）的处理组幼孢子体生长速度显著快于光照时间较短的处理组（图）。图1不同温度对海带“东方7号”配子体发育的影响Fig.1Effect of different temperature on gametophyte development of S.japonicaDongfang No.7不同发育阶段细胞百分比/%Development of ontogenetic stages25221915120204060801002522191512252219151225221915122522191512020406080100图2不同温度下培养25 d后，海带“东方7号”配子体发育显微图片Fig.2Micrograph of gametophyte development of S.japonicaDongfang No.7at differenttemperature after 25 days of cultureedcba注：；。：；渔业研究第 卷表 不同温度对海带“东方 号”配子体发育率的影响 温度 发育率 第 天 第 天 第 天 第 天 第 天 注：数据上标不同小写字母表示同列数据间差异显著，上标不同大写字母表示同行数据差异显著（）。表 同此。：，（）图3不同光照周期对海带“东方7号”配子体发育的影响Fig.3Effect of different photoperiod on gametophyte development of S.japonicaDongfang No.7252219151202040608010025221915122522191512252219151202040608010025221915122522191512表 不同光照周期对海带“东方 号”配子体发育率的影响 光照周期发育率 第 天 第 天 第 天 第 天 第 天 第 期李 霞等：环环境境因因子子对对“东东方方 号号”海海带带配配子子体体发发育育的的影影响响图4不同光照周期培养25 d后的海带“东方7号”配子体发育显微图片Fig.4Micrograph of gametophyte development of S.japonicaDongfang No.7under differentphotoperiod after 25 days of cultureedcbaf注：；。：；不同氮浓度对海带“东方 号”配子体发育的影响方差分析结果显示：不同氮浓度（）、培养时间（）及两者的相互作用（）对海带配子体发育有显著的影响。图 和图 为雌配子体在不同氮、磷浓度条件下的发育情况。结果表明除无氮组外，其他组均在第 天出现处于卵囊和排卵阶段的配子体细胞，随着有效 浓度的增加，处于发育阶段的细胞所占百分比随之增加。当 浓度 时，配子体发育率均低于。当 浓度为 和 时，配子体最终发育率均达 以上，其中孢子体约占，显著高于其他组（表）。图5不同氮、磷浓度条件下培养25 d后，配子体发育情况显微照片Fig.5Micrographs of gametophyte development after 25 days of incubation under different concentrations ofnitrogen and phosphorusBCAefd注：；。图 同此。：；渔业研究第 卷表 不同氮浓度对海带“东方 号”配子体发育率的影响 （）（）发育率 第 天 第 天 第 天 第 天 第 天 注：数据上标不同小写字母表示同列数据间差异显著，上标不同大写字母表示同行数据差异显著（）。：，（）020406080100252219151225221915122522191512020406080100252219151225221915122522191512图6不同氮浓度对海带配子体发育的影响Fig.6Effect of different nitrogen concentration on gametophyte development of S.japonicaDongfang No.7FEDCBA 讨论温度、营养盐、光质、光强和光周期等环境因子被认为是调控褐藻配子体生长发育的重要外因，且各种环境因子对海带配子体的生长发育的影响一般存在着交互作用，如皱海带（）配子体发育过程中，在光照适宜和营养盐充足的条件下，温度对配子体的发育影 第 期李 霞等：环环境境因因子子对对“东东方方 号号”海海带带配配子子体体发发育育的的影影响响响不显著。王潇等研究了环境因子对掌状海带（）有性生殖过程的影响，发现温度决定着海带配子体的营养生长和开始发育的时间。目前针对单一环境因子温度、光周期及营养盐等对海带配子体生长发育影响的研究较多。等证实，掌状海带配子体生长的最适温度为 ，而发育的最适温度为 。陈书秀等研究发现，笼目海带（）配子体 和 下均维持在营养生长状态；大部分配子体（）进入生殖生长状态；在、条件下仅有 配子体细胞进入生殖生长状态，且发育明显滞后于 组。王军等也发现，利尻海带（）的配子体成熟度在 条件下最高，在 条件下，配子 体 不 发 育。发 现，糖 海 带（）配子体生长的最适温度为 ，而发育的最适温度为。陈书秀等 研究了光照周期对笼目海带和多肋藻（）配子体发育的影响，结果表明在 光照强度条件下，较长的光照时间（、）有利于促进笼目海带配子体的生殖生长进程，促进卵囊的形成、受精卵的排放及孢子体的生长，而多肋藻配子体发育率在光照周期 时最高。张鑫等研究了不同光照周期对羊栖菜（）有性繁殖过程的影响，结果表明长光照周期可以明显促进卵子的排放，延长卵子的存活时间，提高卵子的受精效率，有利于合子的发育与生长。有关氮、磷对海带配子体生长发育的研究均发现适宜的氮磷营养盐有利于配子体生长发育的整个过程，鞠青等认为 会降低海带配子体的形成。本研究根据生产上常用海带品种（系）的配子体发育条件，对“东方 号”海带配子体发育所需温度、光照周期和营养盐浓度进一步优化，通过单因素试验，了解单因素的影响状况，了解其作用显著的范围。根据温度、光周期及营养盐浓度对配子体发育影响的显著性呈依次递进的关系，首先采用单一因子实验得出了最适温度条件，在 时，海带配子体仅营养生长。和 处理组第 天开始出现卵囊和排卵现象，和 处理组第 天才开始出现少量的卵囊和排卵现象。随着培养时间的延长，和 处理组第 天开始出现大量的幼孢子体，第 天发育率达到最大值约 ，其中约 为多细胞幼孢子体，均显著高于 和 。由此可以看出，是“东方 号”海带配子体发育的最适温度范围，再结合育苗车间的海水等环境条件，低温更有利于抑制硅藻等的生长，因此选择 作为光照周期及营养盐浓度实验的温度条件。光照 周 期 实 验 结 果 表 明，在 和时，海带配子体第 天开始出现卵囊和排卵现象，且条件下，出现了幼孢子体，但随着培养时间的延长，总发育率未见明显增加，第 天发育率分别约为 和，显著低于。其他三组均在第 天开始出现卵囊、排卵及幼孢子体，其中 条件下配子体发育进程及发育率显著高于 和 。由此可以看出，在温度 条件下，海带配子体最适发育光周期为 。以此为发育条件进行氮磷浓度实验，结果表明添加适量的氮磷是海带配子体生殖生长的必需条件，除无氮组外，其他组均在第 天出现处于卵囊和排卵阶段的配子体细胞，随着有效 浓度的增加，处于发育阶段的细胞所占百分比随之增加。当 浓度 时，配子体发育率均低于。当 浓度为 、时，配子体最终发育率均达 以上，其中孢子体约占，显著高于其他组。综上所述，采用 、光照周期、和 作为发育条件，可促进“东方 号”海带配子体同步发育，加快发育进程，提高配子体最终发育率，从而提高配子体利用率，减少了育苗所需时间，降低了生产育苗成本，为“东方 号”海带的推广利用提供理论基础。本研究结论也为海带育苗生产过程中进一步降低氮、磷浓度提供了可靠的理论依据。参考文献：孙娟，李霞，赵楠，等 不同培养与操作条件对海带配子体培养效果的影响 福建水产，（）：李晓捷，王国文，张全胜，等温度对“”渔业研究第 卷海带配子体克隆生长的影响 水产科技情报，（）：杨迎霞，罗世菊，解建祖，等 光照强度对海带配子体克隆生长的影响 水产科技情报，（）：陈书秀，李晓捷，李霞，等不同 和培养方式对海带配子体生长发育的影响 水产学杂志，（）：陈书秀，李霞，赵楠，等 温度对笼目海带配子体生长发育的影响 水产科学，（）：陈书秀，孙娟，李霞，等 盐度对笼目海带配子体生长发育的影响 水产科技情报，（）：张喜昌，赵宁宁，刘剑波，等 海带配子体预发育适宜光照强度、密度和发育程度研究 渔业研究，（）：隋晓伟，任伟，闫文华，等 光质对海带配子体生长发育影响的研究 海洋科学，（）：李晓捷，崔翠菊 海带“东方 号”中国水产，（）：，（），（）：王潇，刘福利，梁洲瑞，等环境因子对掌状海带有性生殖过程的影响 海洋湖沼通报，（）：，（），（）：王军，张泽宇，张晓东温度与照度对利尻海带配子体及幼孢子体的影响 中国水产，（）：，（）：陈书秀，孙娟，李霞，等光照强度和光照周期对笼目海带配子体发育的影响 渔业研究，（）：陈书秀，史良，赵楠，等不同光照强度和光照周期对多肋藻配子体发育的影响 水产养殖，（）：张鑫，邹定辉，徐智广，等 不同光照周期对羊栖菜有性繁殖过程的影响 水产科学，（）：王宗诚，方宗熙 无机氮和磷对海带配子体生长发育的影响 山东海洋学院学报，（）：，（）：鞠青，王悠，刘素，等 不同氮、磷配比人工海水对海带胚孢子早期发育的影响 应用生态学报，（）：第 期李 霞等：环环境境因因子子对对“东东方方 号号”海海带带配配子子体体发发育育的的影影响响 ，（，）：，（），（），：；