DB11_T 987-2013_鲟鱼种质鉴定规范.pdf

ICS 65.150 B 50 备案号:38199-2013 DB11 北京市地方标准 DB11/T 9872013 鲟鱼种质鉴定规范 Rules of sturgeon germplasm identification 2013-06-21 发布 2013-10-01 实施 北京市质量技术监督局 发 布 DB11/T 9872013 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 学名与分类.1 4 生物学特征.1 5 生长与繁殖.2 6 遗传学特征.3 7 检测方法.5 8 检测规则.7 参考文献.8 DB11/T 9872013 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由北京市农业局提出。本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位：北京市水产科学研究所。本标准主要起草人：胡红霞、朱华、董颖、田照辉、王巍。DB11/T 9872013 1 鲟鱼种质鉴定规范 1 范围 本标准适用于西伯利亚鲟（Acipenser baerii）种质的检测和鉴定。本标准给出了西伯利亚鲟的学名与分类、主要生物学特征、生长与繁殖、遗传学特征及检测方法。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 17716 青鱼 GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分 抽样方法 3 学名与分类 3.1 学名 西伯利亚鲟（Acipenser baerii）3.2 分类地位 属鲟形目（Acipenseriformes）,鲟科（Acipenseridae）,鲟属(Acipenser)。4 生物学特征 4.1 外部形态 鱼体修长，呈纺锤形，横切呈五角形，向尾部延伸变细，吻长尖，口腹位，口裂较小，一字形。歪形尾，鳃盖骨愈合为一,鳃盖膜彼此不相连而与颊部相连。体裸露无鳞具五列骨板，1列背骨板，2两列侧骨板，2列腹骨板；第一背骨板不是最大的骨板,身体最高点不在第一骨板处；侧骨板通常与躯干部颜色相似；腹骨板与背骨板间具有许多星状薄骨板或微小颗粒，吻须4根，介于吻突与口裂之间，稍靠近口裂。鳃耙有结节，一般为3个。鱼体背部呈淡灰黑色或暗褐色，两侧较淡，腹部为白色。西伯利亚鲟的外部形态见图1。DB11/T 9872013 2 图1 西伯利亚鲟外部形态图（引自 FAO）4.2 可数性状 背鳍鳍式：D.3056。臀鳍鳍式：A.1733。背骨板数：1020。侧骨板数：3756，通常为4247。腹骨板数：716。第一鳃弓（左）外侧鳃耙数：2049，通常为2732。4.3 可量性状比例 西伯利亚鲟鱼种、成鱼和亲鱼的可量性状比例见表1。表1 西伯利亚鲟的可量性状比例（平均值标准差）项目 年龄 鱼种（8 月龄）成鱼（3 龄）亲鱼（10 龄）全长/体长a 1.310.04 1.250.06 1.280.04 体长/体高 6.650.64 6.150.04 5.530.51 体长/头长 3.690.25 3.790.34 4.090.28 头长/吻长 1.740.17 2.090.18 2.090.17 头长/眼径 22.131.97 23.526.72 23.704.21 头长/眼间距 3.590.48 3.170.39 3.290.30 头长/尾柄高 8.471.23 6.391.51 5.751.01 尾柄长/尾柄高 2.840.64 2.280.57 2.50.52 a采用从吻端到尾鳍基部的长度 5 生长与繁殖 5.1 生长 DB11/T 9872013 3 在人工养殖条件下,不同年龄组的西伯利亚鲟鱼体长和体重范围见表2。表2 西伯利亚鲟各年龄组体长和体重范围 年龄a 1 2 3 4 5 体长 cm 4050 5070 7085 90100 100120 体重 g 400600 15002000 30004000 50007000 70009000 a依据北方地区流水养殖模式，年龄以周年计 5.2 繁殖 性成熟年龄：自然条件下雌鱼为19龄20龄，雄鱼为17龄18龄；人工养殖条件下雌鱼为7龄以上，雄鱼为5龄以上。繁殖周期：野生状态下为2年以上；人工养殖条件下为1年以上。怀卵量占体重的10%30%。6 遗传学特征 6.1 细胞遗传学特征 采用流式细胞仪测定西伯利亚鲟鱼细胞中DNA含量为N=8.980.115 pg。6.2 生化遗传学特征 西伯利亚鲟肝脏酯酶（EST）同工酶有6条酶带，电泳图及酶带电泳模式图见图2。1为电泳图谱，2为模式图 图2 西伯利亚鲟肝脏酯酶电泳图谱及模式图 6.3 分子遗传学标记 6.3.1 西伯利亚鲟特异性 RAPD 遗传图谱的建立及特征标记 RAPD引物（CCGCCCAAAC）PCR扩增的结果如图3所示。DB11/T 9872013 4 图3 RAPD 引物的扩增产物 1 为西伯利亚鲟池，2、3 为西伯利亚鲟个体，4 为 marker 6.3.2 西伯利亚鲟微卫星 DNA 分子标记的建立 采用14对微卫星引物进行基因型鉴定，西伯利亚鲟在这14对引物的等位基因长度范围见表3。基因型数据分析结果见图4。表3 14 个微卫星引物序列及其在西伯利亚鲟的等位基因长度范围 位点名称 引物序列 (5-3)等位基因长度范围(bp)Atr-1101 F:TATCCCCTCCACTGGAAAT R:GTTAAACATCCCTGCCTTCA 143203 Atr-105 F:CGATTTGATTGGCTCTTGTA R:TGCAAATAAATTGGAGCTGA 157173 Atr-107 F:GGCAGGATTACATCTCCTGA R:TTACTAACTGCTAGATAATACCTCTCT 188242 Atr-109 F:ACCCGAGCTGTCACATTACT R:AAAATAACGCGAATTCCTGA 162300 Atr-114 F:GCAATTCGTGTTATGTTCATTT R:TGCATTCAGAGAATAACCGA 201251 Atr-117 F:TGCATGACACAGGACTTACC R:TGCCTCTCAATAGCAACATC 191259 Abr 39 F:ACCCGCAATTATTAGGAC R:CAGGACAAACTCAGACCC 178276 Abr 40 F:TCACGCAGTCTCACAAGG R:TTCAATGGCAAACAGCAC 384418 Abr 41 F:ACACTATCCCGCCACAAT R:CCACTGAAGCCATCATCT 322410 Afu19 F:CATCTTAGCCGTCTGTGGTAC R:CAGGTCCCTAATACAATGGC 120139 Afu22 F:TCCACAATCCTGAATAATGAC R:GCACCATCTAATACGAAATTG 140242 Afu39 F:TTCTGAAGTTCACACATTG R:ATGGAGCATATTGGAAGG 119140 Afu54 F:CTCTAGTCTTTGTTGATTACAG R:CAAAGGACTTGAAACTAGG 149221 Afu68 F:TTATTGCATGGTGTAGCTAAAC R:AGCCCAACACAGACAATATC 128250 DB11/T 9872013 5 图4 微卫星标记基因型数据分析结果图 7 检测方法 7.1 繁殖力检测 按照GB 17716的生物测定方法。7.2 细胞遗传学特征测定 7.2.1 采鲟鱼尾动脉血 0.5ml，加入肝素处理过的 1.5mL 小指管中，低速（1000rpm）离心 3 min，弃上清。用 0.8%的生理盐水洗涤三次后，在管中加满 70%的冷乙醇固定过夜，注意固定时使细胞充分散开。7.2.2 取细胞悬液浓度调整到 106cell/ml 样品 1ml，用 RNA 酶 10 g/ml20g/ml 37水浴消化0.5h；碘化丙碇 50g/ml 4染色 30min。7.2.3 将处理过的样品用细绢布过滤后，加入适量的同样处理的鸡血红细胞，上流式细胞仪测定荧光强度，计算西伯利亚鲟鱼与鸡血细胞（N=2.8pg）荧光强度之比，即可得到鲟鱼的 DNA 含量。7.3 生化遗传学特征测定 7.3.1 试验材料 西伯利亚鲟30尾以上。7.3.2 样品制备 剪断鱼的尾动脉，放血。随后解剖，迅速摘取肝组织0.5g左右，置于0生理盐水中，用生理盐水洗去组织血污。然后称重，放入玻璃匀浆器中，按1:5（g/ml）的比例加入0.1M pH7.0的冰冷磷酸缓冲液中进行冰浴匀浆。匀浆后在4冰箱放置1小时，4条件下，12000rpm离心30min，吸取上清液，分装于0.5ml离心管中，-80低温冰箱中保存，供同工酶电泳分析用。7.3.3 电泳分析 7.3.3.1 电泳分离条件：电泳缓冲液 0.2M tris-Gly pH8.3，分离胶为 10%，浓缩胶为 4%，小型双垂直电泳槽电泳电压 100V，电泳时间为 9h10h，之后改为电压 60V，电泳时间为 6h7h。7.3.3.2 加样及电泳：每槽加样 7l，与等体积的溴酚蓝蔗糖液混匀后加样，在 4冰箱中进行电泳。7.3.3.3 染色：将-萘酚 0.1g 和-萘酚 0.1g 溶解于 10ml 丙酮中，加 0.2M 磷酸缓冲液至 100ml，加固蓝 0.1g 配成染色液。凝胶板在 37与染色液，保温 30min50min，即可呈现棕红色同工酶区带，用蒸馏水冲洗 3 次后，7%醋酸固定。7.4 分子遗传学标记方法 表示西伯利亚鲟品种池 表示非西伯利亚鲟样品 DB11/T 9872013 6 7.4.1 试验材料 从西伯利亚鲟群体中分别随机抽取同龄鱼30尾以上，进行尾椎静脉采血，ACD抗凝，去除血浆后-20保存。或剪取西伯利亚鲟鳍条约0.5g，置于75%酒精中常温保存。7.4.2 基因组 DNA 的制备 利用常规苯酚/氯仿法抽提个体基因组DNA，利用紫外分光光度法确定DNA浓度，将个体基因组DNA液稀释至浓度10ng/l；从每个个体基因组的DNA稀释液中取出10l集于一管中，制成品种的池DNA。7.4.3 PCR 扩增反应 扩增反应总体积为25l，其中包括摸板DNA30 ng、10PCR缓冲液（含Mg2+）2.5l、dNTPS（2.5mM each）2l、Taq酶（5u/l）0.3l、引物1pM（RAPD法和微卫星DNA法分别使用各自的引物）。RAPD法反应程序为：95预变性5min，94 45s、36 45s、72 90s，45cycles,72延伸5min。微卫星DNA法反应程序为：94变性45s、退火45s（各引物退火温度详见表4）、72延伸45s，40 cycles,72再延伸5min。扩增反应结束后，取5l产物与1l上样缓冲液混合点样，在含溴化乙锭的1.4%琼脂糖凝胶中电泳1h2h，电压80v，紫外灯下观察结果并拍照记录。表4 14 个微卫星位点重复序列结构和退火温度 位点名称 重复序列结构 退火温度()Atr-1101(TATC)10 55 Atr-105(GATA)15 50 Atr-107(TAGA)17 57 Atr-109(GA)5(TAGA)20 55 Atr-114(TAGA)23 60 Atr-117(GATA)8 55 Abr 39(TATC)18 58 Abr 40(TCTA)6(TAGA)12 61 Abr 41(TCTA)17 65 Afu19(TTG)5 53 Afu22(TAAA)5(GAA)19 52 Afu39(CAA)14 55 Afu54(GATA)2(GACA)2 55 Afu68(GATA)21 55 7.4.4 结果分析 7.4.4.1 RAPD 法结果分析 向PCR产物中加入上样缓冲液，94解链5min，迅速置于冰中冷却至室温，4保存备用。使用95%酒精把长板擦洗一遍，待酒精挥发后涂1.5mL亲和溶液；再使用95%酒精把短板也擦洗一遍，待酒精挥发后涂200L剥离溶液。取6%变性聚丙烯酰胺溶液80mL，加入60L四甲基乙二胺，180L的10%过硫酸铵（现用现配），充分混匀后灌入两块玻璃之间。用鲨鱼齿梳子的背面沿两玻璃板缝隙水平插入DB11/T 9872013 7 胶中约5mm6mm。等约1.5h待凝胶聚合后，拔出梳子，用自来水将玻璃板表面冲洗干净，擦干后装在电泳槽上。向电泳槽的上下缓冲液槽中加入0.5TBE缓冲液，使缓冲液没过短板。1800V恒压预电泳20min。预电泳之后，在每个加样孔中加入5L解链后样品，1800V恒压电泳1.5h2.5h。电泳结束后，小心分离两块玻璃板，将粘有凝胶的长板浸入染色液中，染色5 min15min，用蒸馏水漂洗30s，浸入在显影液中显影至带型清晰，再用蒸馏水漂洗5min。晾干长板后，拍照纪录结果。7.4.4.2 微卫星 DNA 法结果分析 使用普通微卫星引物进行PCR扩增时，基因型判读同上述RAPD法。使用荧光微卫星引物进行PCR扩增时，直接使用基因分析仪进行基因型判读。使用软件STRUCTURE 2.3对基因型数据进行综合分析。8 检测规则 8.1 检测分类 检测分为鉴定检测和质量一致性检测。8.2 检测项目 鉴定检测项目包括外部形态特征、可量性状、可数性状。质量一致性检测项目包括细胞遗传学特征、生化遗传学特征、分子遗传学特征。8.3 取样 样品鱼的抽样按GB/T 18654.2规定执行。8.3.1 组批 以同龄期的西伯利亚鲟为同一批。8.4 判定规定 各项检测指标在标准范围内则判定为西伯利亚鲟。DB11/T 9872013 8 参 考 文 献 1 Ludwig A.Identification of Acipenseriformes species in trade J.Journal of Applied Ichthyology,2008,24:2-19.2 陈细华.鲟形目鱼类生物学与资源现状M.北京：海洋出版社,2007:附录 4.3 CITES.Identification Guide-Sturgeons and Paddlefish.Minister of Supply and Services,Canada.2001.4 孟庆闻,苏锦详,缪学祖.鱼类分类学M.北京：中国农业出版社,1995.5 Billard R,Guillaume L.Biology and conservation of sturgeon and paddlefishJ.Reviews in Fish Biology and Fisheries,2001,10:355-392.6 Gisbert E,Ruban G I.Ontogenetic behavior of Siberian sturgeon,Acipenser baerii:A synthesis between laboratory tests and field dataJ.Environmental Biology of Fishes,2003,67:311-319.7 Holcik J.The freshwater fishes of Europe.V1:PartII.General introduction to fishes Acipenseriforms.AULA-Verlag Wiesbaden,1989.8 Ruban G I.The Siberian sturgeon,Acipenser Baerii Baerii,population Status in the Ob RiverJ.The Sturgeon Quarterly,1996,4(1/2):8-9.9 Ruban G I.Species structure,contemporary distribution and status of Siberian sturgeon,Acipenser baerii.Sturgeon Biodiversity and ConservationM.Dordrecht:Kluwer Academic Publishers,1997:221-230.10Vasilev V P,Sokolov L I,Serebryakova E V.Karyotype of the Siberian sturgeon Acipenser baerii Brandt from the Lena River and some questions of the acipenserid karyotypic evolutionJ.Vopr Ichthyol,1980,23:814-822._