荧光分析和化学发光分析省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

荧光分析与化学发光分析冯振涛冯振涛1203180234第1页 6-1 概 述 在前两章中我们讨论了物质对电磁辐射吸收。吸收辐射能后，处于电子激发态分子在返回基态时以发射辐射方式释放这一部分能量，发射辐射波长能够同分子所吸收辐射波长相同，也可不相同，这一现象称为光致发光。最常见两种光致发光现象是荧光和磷光。这两种光致发光过程机理不一样(见6-2)，可经过试验观察激发分子寿命长短来加以区分。对于荧光，当激发光停顿照射后，发光过程几乎马上停顿(10-9 10-6)，而磷光则将连续一段时间(10-3 10s)。第2页 普通所谓荧光现象是指物质吸收紫外光后所发射出可见荧光，以及吸收波长较短可见光后所发射出波长较长可见光荧光。但实际上荧光现象并不限于这些情况。有些物质吸收了比紫外光波长短得多光后，发射出波长比所吸收光波长稍长光，这称为光荧光，并据此建立了光荧光分析法(相关此法详细讨论见第十四章)。另外，有些物质吸收了红外光后发射出波长稍长红外光，这称为红外光荧光。近年来，伴随红外探测器灵敏度不停提升，红外光荧光分析法已应用于许多有机物质结构分析。第3页 因为物质分子结构不一样，所吸收紫外光波长和发射荧光波长也有所不一样，利用这个特征能够对物质进行定性判定。同一个分子结构相同物质，用同一个波长紫外光照射激发，可发射特征波长荧光，其强度与物质量相关。据此，可利用一些物质被紫外光照射后所发射能反应出该物质特征荧光进行定性以及定量分析，这种分析称为荧光分析。第4页 化学发光分析是利用化学发光现象进行分析测定一类方法。与荧光分析一样，属于发光分析范围。化学发光与荧光分子发光相同，他大部分性质和荧光相同，不一样点在于荧光激发能来自外光源激发(照射)，而化学发光激发能则产生自化学反应，也即一些物质在进行化学反应时，因为吸收了反应时产生化学能，使分子或原子被激发，这种受激分子或原子返回基态时，以光辐射方式释放能量。其光辐射能量及光谱范围由化学反应物质所控制(处于可见光区)。每一个化学反应都有其特征化学发射光谱，其发光强度则与物质浓度相关，这是化学发光分析依据。第5页 另外还有其它类型发光:生物发光、热致发光、放射发光(放射性分解引发激发)、声致发光(声波激发)、点发光(电激发)、摩擦发光(机械能激发)等。其中生物发光在分析化学中得到主要应用，在生物发光中造成激发态化学反应是在生物体内进行。磷光现象也被用于分析目标，但应用范围有限。第6页6-2 荧光分析法1基本原理2荧光定性分析 3荧光定量分析4荧光计与荧光分光光度计第7页 1.荧光发生 处于基态分子吸收一定波长辐射能后。电子发生跃迁。此时由 原来能级跃迁至第一电子激发态或第二电子激发态中各个不一样振动 能级和各个不一样转动能级，如图6-1中(a)和(b)所表示。分子在吸收了 光而被激发至第一或更高电子激发态各个振动能级之后，通常急 剧降落至第一电子激发态最低 振动能级，在这一过程中他们和 同类分子或其它分子(比如溶剂分 子)碰撞而消耗了相当于这些能级 之间能量，因而不发射光(无辐 射跃迁，图6-1中c)。由第一电子 激发态最低振动能级继续往下 降落至基态各个不一样能级时，则以光形式发射，所发生光 即荧光(图6-1中d)。一些物质分子在被激发至较高能级并经过无 辐射跃迁降落至第一电子激发态最低振动能级之后，并不继续直接 降落至基态，而是经过另一次无辐射跃迁至一个中间亚稳能级 三重态(图6-1中e)。一、基本原理一、基本原理第8页 已知电子激发态自旋多重性为2S+1，S是自旋量子数代数和。大多数分子含有偶数电子，在基态时这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中。然而，依据保利不相容原理，在一个轨道上这两个电子自旋是相反，自旋量子数为+()和-()。因为自旋成正确结果，大多数分子自旋量子数代数和S=0，此时这个分子所处电子能态称为单重态(singlet state)，即2S+1=1。假如分子中有一个未成正确电子，则S=，而2S+1=2，此种状态称为双重态(doublet state)。若分子中有两个未成正确电子，此时S=1,2S+1=3，这种状态称为三重态(triplet state)。第9页 在基态分子一个电子吸收光辐射而被激发过程中，通常它自选不变(S=0)，则激发态仍是单重态，如图6-2所表示。一些分子激发单重态经过无辐射跃迁，在体系间跨越过程中发生自选反转，造成两个电子自旋平行状态，也即是激发三重态(6-2)。第10页 这些分子在三重态稍事逗留后，在发射辐射而下降至单重态各振动能级，所发射光即为磷光(图6-1中f)。因自三重态降落至单重态时所给出能量比由单重第一电子激发态最低振动能级直接降落至单重基态时所给出能量小，所以磷光波长比荧光波长长。如将温度降低，则由三重态降落至单重态时间将大为延迟，在很低温度下，这些分子有可能被“冻结”在三重态上。一些分子在跃迁至三重态后，经过热激活作用可 以再回到第一电子激发态 各个振动能级，然后再由第 一电子激发态最低振动能 级降落至基态而发射出荧光，这种荧光就被称为迟滞荧光 (图6-1中g和f)。第11页 假如把蒽乙醇溶液装入试管，并放在液氮中，并用紫外光照射，停顿照射后，还能见到蒽溶液辐射出橙色光，而光强度随时间延长而逐步变弱，最终消失为止。这种即使停顿用光激励，还能继续发光现象，就是蒽磷光。图6-3表明了蒽吸收了波长366nm光，生成最低激发单重态S1，S1辐射荧光到基态，同时激发单重态S1体系间跨越到三重态T1，T1辐射磷光回到基态。第12页 2.荧光激发光谱和荧光发射光谱 荧光发射光谱简称荧光光谱，它表示该荧光物质所发射荧光中各种不一样波长组分相对强度，是以荧光强度对荧光波长所绘制曲线。假如把某物质荧光光谱与他吸收光谱进行比较，可发觉这两种光谱之间存在着亲密“镜像对称”关系。荧光光谱好像是吸收光谱照在镜子中像，但又比吸收光谱缺乏了一些短波 长吸收峰。图6-4表示蒽乙醇 溶液荧光光谱和吸收光谱。第13页 3.化合物荧光和化学结构关系 产生荧光必须具备两个条件。首先，物质分子必须含有能吸收紫外或可见光生色基团；其次该物质应含有一定荧光效率。分子中能发射荧光基团，称为荧光基团。荧光基团一定是生色基团，但生色基团未必一定是荧光基团。这是因为它荧光效率不高，而将所吸收能量消耗于与溶剂分子或其它溶质分子之间相互碰撞，所以不能发射荧光。荧光效率(F)又称为荧光量子产率，是荧光物质吸光后所发射荧光量子数与所吸收激发光量子数比值，即 F=另外，一个物质吸收光能力及量子产率又与物质所处环境紧密相关，因为环境条件(如溶剂、pH、温度等)经常是物质量子产率高低，甚至能否产生荧光主要原因。发射量子数吸收量子数第14页 荧光通常发生于含有刚性平面结构电子共轭体系分子中，伴随电子共轭度和分子平面度增大，荧光效率也将增大，它们荧光光谱也将移向长波方向。任何有利于提升电子共轭度结构改变，都将提升荧光效率，使荧光波长向长波长方向移动。绝大部分荧光(磷光)物质都是环状化合物(芳香环或杂环)，芳香环越多，荧光效率越高，荧光光谱也移向长波长方向(表6-1)。但环状结构并不是发生荧光绝对条件，如吡啶()、呋喃()、噻吩()和吡咯()是非荧光或弱荧光物质。但取代上苯基后，因为共轭体系增大，荧光效率将大为增加。比如苯并呋喃()、吲哚硫茚荧光和笨相近。第15页 在芳香化合物芳环上进行不一样基团取代，对该化合物荧光强度和荧光光谱都将产生影响。通常有以下一些规律：(1)给电子基团常使荧光增强，因为它们使最低激发单重态与基态之间跃迁几率增大。作用尤其显著基团是-NH2和-OH。(2)同电子体系相互作用小取代基如 -SO3H、-NH3 和烷基等，对荧光影响小。(3)吸电子基团如-COOH、-NO2、-N=N-及卤素会减弱甚至破坏荧光。(4)重原子或杂原子引入到电子体系中常会减弱荧光，所以苯胺和苯酚荧光较苯强20倍，而硝基苯、苯甲酸和碘代苯则是非荧光或弱荧光物质。表6-2表明取代基对苯荧光影响。+第16页 含有刚性平面结构分子有利于荧光产生。这能够比较荧光素和酚酞结构来说明:又如芴和联苯在类似测量条件下荧光效率分别为1.0和0.2。这是因为芴上亚甲基增强了分子刚性缘故。有些有机分子本身不会发荧光，但与金属形成络合物后，因为增强了他刚性并大大降低了分子内振动作用，因而产生荧光。第17页 前文已述，因为物质分子结构不一样，所吸收紫外波长和发射荧光波长含有特征性，所以依据荧光物质激发光谱和发射光谱可判别化合物。最直接荧光定性分析方法是将待分析荧光发射光谱与预期化合物荧光发射光谱相比较。这种方法比较简便并常能取得很好效果。图6-5(a)(b)是从一个城市河流底泥试样中以荧光法判定苯并()芘实例。二、荧光定性分析二、荧光定性分析 图6-5 苯并()芘和苯并()芘荧光激发光谱及发射光谱第18页 对于一些复杂样品来说，光谱判定有时会发生困难。能够采取标准加入方法。即在试样中添加拟存在组分，若此组分存在，则在添加该组分纯物质加入后，该物质特征峰将加强。同时扫描荧光法可使光谱简化和窄化，是原来相互重合光谱分辨开来，从而提升了荧光法选择。同时扫描法通常在固定时进行，此时使激发单色器和发射单色器波长差(=Em-En)保持固定地同时进行扫描，所得谱图称为同时光谱，所测得荧光信号为同时信号。第19页 图6-7 菲、蒽、苝光谱图图6-8 萘、菲、蒽、苝、并四苯混合物常规荧光光谱及混合物同时光谱图图6-9 工厂区大气样品萃取物中强致癌物苯并()芘及其共存物荧光光谱和同时光谱第20页 1.荧光强度与浓度关系 荧光发光是因为物质在吸光之后发射出波长较长荧光，所以溶液荧光强度与该溶液吸光程度以及溶液中荧光物质荧光效率相关。溶液被入射光(I0)激发后，能够在溶液各个方向观察到荧光强度(F)。但因为激发光源能量一部分被透过，所以，在透射光方向观察荧光是不宜。普通是在与激发光源垂直方向观察。依据比耳定律，透过光百分比为 式中：I0为入射光(激发光)强度；I为透过光强度；C为浓度，b为液层厚度；为摩尔吸光系数。对应地被吸收部分是 将上式重新排列，可得被吸收光量为 I0-I=I0(1-10 )(6-3)三、三、荧光定量分析荧光定量分析II0-=10-b C-b C 1-=1-10I0I-b C(6-2)(6-1)第21页 总荧光强度(F)同试样吸收激发光光量子数目和荧光量子效率(F)成正比 F=F(I0-I)=I0 F(1-10 )(6-4)将上式括弧中指数项展开可得 F=I0 F (6-5)对于很稀溶液，投射到试样溶液上被吸收激发光不到2 时，也就是b C=A0.05时，括弧内第二项以后能够忽略不计，则上式可简化为 F=2.3 F b C I0 (6-6)对于一定荧光物质，当分析条件及仪器使用条件确定后，上式中F、b、I0 均为常数，当被测荧光物质浓度C很小时(b C 0.05)，式(6-6)可写作 F=kC (6-7)即荧光强度与荧光物质浓度呈线性关系。但当b C 增大时，从式(6-5)能够看出浓度与荧光强度之间呈非线性关系，若b C 很大时，式(6-5)成为 F=I0 F (6-8)此时荧光强度与浓度无关。所以在荧光分析中，荧光强度和浓度线性关系仅限于很稀试液。-b C-b C2.3 b C-(-2.3 b C)2!(-2.3 b C)3!23第22页 2.影响荧光强度原因 (1)激发光照射影响 对于轻易分解荧光物质测定，应经过试验确定能准确读取荧光强度方法。(2)温度影响 通常荧光物质溶液伴随温度降低而荧光强度增大。普通温度升高1，荧光强度约下降1。(3)溶剂影响 普通来说，荧光强度伴随溶剂极性增大而增强。(4)溶液pH影响 当荧光物质为弱酸或弱碱时，溶液pH值改变对荧光强度将有很大影响。对于金属离子与有机试剂形成络合物，溶液pH值改变还会影响到络合物组成，从而影响到它们荧光性质。(5)各种发散光影响 主要是散射光和拉曼光。降低方法:从仪器上考虑；从溶剂考虑。(6)荧光熄灭 荧光物质和溶剂或其它溶质分子相互碰撞或电子转移等作用引发。卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等都是显著地荧光熄灭剂。(7)荧光自灭 荧光物质浓度大于1gL时，常发生荧光自灭现象。由上述可见，最适宜测定条件如pH、溶剂、试剂浓度、温度以及荧光强度最大时所需时间等都需要试验来确定。第23页 3.定量分析方法 (1)标准曲线法 荧光分析普通多采取标准曲线(工作曲线)法，尤其在测定大批样品例行测定时更是如此。(2)直接比较法 取已知量纯荧光物质配制一标准溶液，使其浓度在线性范围内，测定荧光强度(Fs)。然后在一样条件下测定试样溶液荧光强度(Fx)。由标准溶液浓度(Cs)和两个溶液荧光强度，求试样中荧光物质含量(Cx)。在空白溶液荧光强度若未能使仪器读数调至0，则必须从Fs及Fx值中扣除空白溶液荧光强度(F0)，然后进行计算。依据式(6-6)可得 Fs-F0=2.3 F b I0 Cs Fx-F0=2.3 F b I0 Cx 因为对于同一荧光物质，F及 相同，且b 一定，故 (3)荧光熄灭法 利用荧光熄灭现象可对一些物质进行定量测定。(4)同时扫描荧光法 同时荧光信号强度与欲测荧光物质浓度(浓度很稀时)呈线性关系。不过，同时荧光法存在浓度效应。欲克服，只需将溶液适当稀释即可。F F=2.3 2.3 F F b Cb C I I0 0 (6-6)Fs-F0 CsFx-F0 Cx=Cx=Cs (6-9)Fx-F0Fs-F0第24页 测定荧光强度仪器有目测荧光计、光电荧光计和荧光分光光度计等。它们主要由光源、滤光片、或单色器、样品池及检测器等部件组成。惯用荧光计是由滤光片、硒光电池及微电流计装配成光电荧光计，如图6-12。在测定微量荧光物质含量时，使用滤光片光电荧光计可得到满意结果。但如前所述，各种不一样荧光物质含有不一样荧光光谱和荧光激发光谱，为了研究某种荧光物质特征，或在建立荧光分析方法时选择适当荧光波长，常需测绘荧光发射光谱和荧光激发光谱。此时需要使用荧光分光光度计。其结构原理图如图6-13。图6-14为其仪器结构示意图。在该仪器所做光谱上，最高峰波长就是物质在最大激发波长下所产生最强荧光波长。荧光物质最大激发波长和所产生最强荧光波长是判定物质依据，也是定量测定时最灵敏条件。荧光强度测量常采取同任意选定标准进行比较。在日常分析中广泛采取标准是奎宁硫酸盐硫酸溶液。另外，依据目标不一样，可选择不一样宽度狭缝以得到很好结果。其选择普通标准见表6-4.四、荧光计与荧光分光光度计第25页 分子发光法灵敏度在很多情况下要比分子吸收法高很多，它是最灵敏分析方法之一，所以更适合于低浓度物质分析。已知在分光光度法中不但测量透过试样光强(I)，还要测量入射光强度(I0)，同浓度相关参数吸光度(A)是这两个信号(光强)比对数(A=lg)。在测量低浓度溶液时，检测器必须能同时区分这两个较大信号微小差异，所以在低吸光度时测量准确度快速降低。而在分子发光法中荧光强度(F)(磷光强度)直接同荧光(磷光)物质浓度成正比。分子发光法灵敏度通常要比对应分光光度法灵敏度提升24个数量级。分子发光法选择性普通也优于光吸收法，因为很多分子在紫外及可见光区都有吸收，但其中仅有一部分能再发射荧光或磷光，所以分子发光法固有干扰少。所以，荧光法在环境监测上有主要应用和进展。6-3 荧光分析在环境监测中应用I0I第26页 一、空气中SO2测定 空气中SO2对波长190230nm紫外光吸收最强，SO2 吸收紫外光后被激发至激发态。SO2+hv1 SO2 当激发态SO2 回到基态时，发射荧光波长为330nm。SO2 SO2+hv2 发射光强度和SO2浓度成正比。二、饮用水和熟食中硒测定 三、苯并()芘测定 第27页