浅论依达拉奉对幼鼠惊厥持续状态后海马XBP1-mRNA和caspase12表达及神经元凋亡的影响.docx

浅论依达拉奉对幼鼠惊厥持续状态后海马XBP1 mRNA和caspase12表达及神经元凋亡的影响【摘要】 目的:探讨依达拉奉对幼鼠惊厥持续状态后海马内质网应激关键标志分子X盒结合蛋白1mRNA、caspase-12的表达及神经元凋亡的影响。方法：将1921日龄SD大鼠随机分入惊厥持续状态组、依达拉奉组、生理盐水对照组；各组再按不同时间点分五个亚组。应用氯化锂-匹鲁卡品建立大鼠SC模型，用半定量逆转录-聚合酶链反应动态观察SC后海马XBP1、caspase-12 mRNA的表达情况。用免疫组织化学方法观察海马caspase-12蛋白表达情况。用TUNEL法观察神经元凋亡细胞数。结果：幼年大鼠海马中XBP1和caspase-12在SC组表达显着增强，与NS组比较差异有显着性；与SC组比较，ED组XBP1 mRNA表达显着升高，caspase-12 mRNA及蛋白表达显着降低；SC组在惊厥12 h后的各时间点海马CA1区TUNEL阳性细胞数均显着高于NS组，而ED组TUNEL阳性细胞数均较SC组显着下降。结论：依达拉奉有可能通过上调XBP1的表达与下调caspase-12的表达，并使神经元凋亡数目减少，从而发挥对神经元的保护作用。【关键词】 依达拉奉；惊厥持续状态；XBP1；caspase-12；神经元；凋亡 Abstract: Objective: To investigate the expression of the key marker of ERS X-box binding protein 1 mRNA，Caspase-12 and neuron apoptosis in the rat hippocampus after status convulsion ，and the effects to which when treated with Edaravone. Methods：120 Male Sprague-Dawleyrats aged 2530 days were randomly enrolled into the NS control group ，status convulsion groupand Edaravone group . Each group were divided into five sub-group at five different timeSC animal model was establishecl using lithium-pilocarpine. The expression levels of XBP1 and caspase-12 mRNA in the hippocampus were dynamically detetced by semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction . Caspase-12 protein was detect with immunohistochemistry method. The neuron apoptosis was observed with TdT-mediated dUTP nick end labeling . Results: The expression of XBP1 and caspase-12 increased markedly in SC group. The difference was statisticalw significance compared with NS control group . The expression of XBP1 mRNA in ED group were notably higer than that of SC group . The expression of caspase-12 mRNA and protein significantly decreasedcompared to the SC group. The TUNEL positive cells in hippocampus CA1 of SC group were more than that of NS group 12 h after the SC. After the intervention of edaravone，TUNEL positive cells showed a significant drop in SC group ，but still significantly higher than that of the NS group . Conclusion: Edaravone may serve as an effective agent for curing the brain damage after SC in vivo ；the mechanism of protecting the neuron may include upregulating the expression of XBP1，downregulating the expression of caspase-12 and reducing the number of apoptotic neurons. Key words: Edaravone；status epilepticus；XBP1；caspase-12；neuron；apoptosis 内质网作为细胞内蛋白质合成、修饰、转运以及细胞内Ca2浓度稳态调节器官，对内环境的改变比较敏感。缺血低氧、氧化应激等均可导致ER腔Ca2稳态的改变以及大量未折叠和错折叠蛋白的堆积，从而引起内质网应激1-3。已有研究发现，惊厥持续状态后，大鼠海马中ERS凋亡相关因子Caspase-12表达上调4-5。而X盒结合蛋白1作为ERS细胞保护信号途径中的关键分子，SC后表达情况及其与caspase-12间关系如何目前还没有相关研究报道。 依达拉奉作为一种新型氧自由基清除剂，在低氧缺血性脑病中对于神经元保护作用已得到证实6-7，其对于SC后XBP1及caspase-12的表达及神经元凋亡影响情况如何，国内外尚未见报道。本实验通过建立氯化锂-匹鲁卡品SC大鼠模型，观察依达拉奉对SC后海马XBP1、caspase-12 mRNA表达以及神经元凋亡情况的影响，初步探讨依达拉奉在SC幼鼠中可能的神经元保护作用机制。 1 材料和方法 材料实验动物：清洁级1921日龄健康雄性SD大鼠，体重5070 g。由中国科学院上海分院试验动物中心提供，实验动物先置温州医学院实验动物中心层流实验室饲养2 d，自由摄食、摄水，室内温度25 ，相对湿度70%，12/12 h昼夜照明变化。主要试剂：氯化锂、匹鲁卡品购于Aldrich Sigma公司；硫酸阿托品针购于浙江瑞新药业股份公司；依达拉奉注射液购于江苏先声药业公司。Trizol Reagent试剂为Invitrogen公司产品，RT-PCR试剂盒由Fermantas公司提供；引物及内参均由上海基康公司提供。琼脂糖购于上海晶美公司。TUNEL试剂盒购于Roche公司。实验动物的分组：将大鼠随机分入惊厥持续状态组、依达拉奉组、生理盐水对照组；每组40只，再随机均分为4 h、12 h、24 h、48 h、72 h五个亚组。每亚组8只。若因模型不成功、死亡造成各亚组样本量不足8只的，按随机原则补足。动物模型的制作与标本的制备 SC模型制作方法：按127 mg/kg剂量腹腔注射氯化锂，18 h后按1 mg/kg剂量腹腔注射硫酸阿托品，30 min后按100 mg/kg剂量腹腔注射匹鲁卡品。观察SC组大鼠出现惊厥发作的行为学表现。大鼠惊厥按Racine分级法分为0级：无任何发作迹象；级：凝视、咀嚼和须动；级：点头、湿狗样抖动或搔抓；级：前肢阵挛抽搐；级：伴后肢站立的全身强直性发作；级：伴有站立并摔倒的全身强直-阵挛性发作。惊厥发作达到以上，持续时间达30 min以上，惊厥缓解后状态良好的大鼠为合格SC大鼠模型。当惊厥发作达30 min时，给予10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射终止发作。依达拉奉组自惊厥前3 d起予以依达拉奉腹腔注射，每天1次，其他处理同SC组。生理盐水对照组用生理盐水代替匹鲁卡品，其他处理同SC组。 大鼠分别于惊厥发作停止后4 h、12 h、24 h、48 h、72 h，用10%水合氯醛依次麻醉后断头，剥离大脑。将其左半球在距额极2 mm和距尾极1 mm处各切一刀，取中间段置于4%多聚甲醛溶液中，于4 固定24 h，脱水、石蜡包埋后，用振荡切片机从视交叉处开始作冠状连续切片，片厚5m，用于免疫组化和TUNEL染色。右半球在去核糖核酸酶的环境下冰盘内钝性分离海马，称重后即置于无RNA酶的Ep管中，-80 液氮保存，用作RT-PCR标本。 RT-PCR检测caspase-12、XBP1 mRNA含量 总RNA的提取：取液氮保存的海马标本100200 mg，用Trizol试剂提取总RNA，采用紫外分光光度计测定总RNA含量后进行RT-PCR试验。cDNA的合成：计算出相当量总RNA的体积后，应用Fermentas逆转录试剂盒，按说明书操作步骤进行逆转录反应。PCR：XBP1以-actine作为内参照，caspase-12以GAPDH作为内参照。相应引物序列见表1。PCR体系包括cDNA 3l，10buffer l，MgCl2 l，dNTP l，ddH2O l，Taq酶 l，上下游引物各l；总反应体系为25l；PCR扩增条件：95 预变性5 min，94 变性30 s，退火30 s，72 延伸40 s，35个循环，最后经72 延长8 min终止反应。caspase-12、GAPDH退火温度58 ，XBP1和-actine退火温度50 。图像分析：取5l PCR产物在%琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶图像成像分析系统下扫描，用Gel-Pro Analyzer 32专业凝胶图像分析软件测定产物光密度值，用目的条带光密度值与内参条带光密度值之比表示组织目的基因mRNA的含量。免疫组化观察海马caspase-12蛋白表达 采用过氧化物酶标记的链霉卵白素法法检测海马中caspase-12蛋白表达。具体步骤参见说明书。阳性信号为棕黄色或棕褐色，每张切片随机选择5个高倍镜下视野，应用image-pro plus 图像分析软件测定阳性部位的平均光密度，以代表阳性部位的蛋白表达水平。TUNEL染色观察神经元凋亡 常规烤片、脱腊、脱水，胰蛋白酶K 400 g/ml室温15 min，3% H2O2室温10 min，封闭血清室温10 min，TUNEL反应液50 l37 孵育60 min，POD50l 37 孵育30 min，DAB显色 min，苏木素适度复染，常规水化、透明后，中性树脂封片。阴性对照组用试剂2代替TUNEL反应液。光镜下计阳性细胞数，每张切片选择阳性细胞最集中的5个高倍镜下视野，计算每个高倍视野的阳性细胞数，取平均值。统计学处理方法 多组样本均数比较采用单因素方差分析，均数的两两比较方差齐性者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnettt T3法。正态双变量相关分析采用Pearson积矩相关系数法。 2 结果 XBP1 mRNA在海马组织中的表达 SC组各时间点XBP1 mRNA含量较NS组表达明显升高，ED组各时间点XBP1 mRNA含量显着高于SC组。NS组各时间点XBP1 mRNA表达比较差异无显着性；SC组其表达在4 h即有升高，24 h达高峰，48 h开始下降；ED组其表达动态变化同SC组。见表2、图1。caspase-12 mRNA在海马组织中的表达 SC组caspase-12 mRNA表达在1248 h时间点显着高于NS组，ED组caspase-12 mRNA表达在24 h、48 h较SC组显着降低。NS组各时间点caspase-12 mRNA表达比较差异无显着性；SC组其表达在12 h开始显着升高，24 h达峰值，48 h开始下降；ED组其在各时间点间表达比较差异无显着性。见表3、图2。caspase-12蛋白在海马CA1区的表达 SC组caspase-12 蛋白表达在1272 h时显着高于NS组，ED组caspase-12 蛋白表达在24 h、72 h时较SC组显着降低。NS 组各时间点海马CA1区caspase-12 蛋白OD值比较差异无显着性；SC组其表达于惊厥后12 h显着增加，24 h达高峰，48 h开始缓慢下降；ED组其表达动态变化同SC组。见表4、图3。海马CA1区TUNEL结果 SC组TUNEL阳性细胞数在惊厥12 h后各时间点均显着高于NS组，ED组TUNEL阳性细胞数在1248 h时各亚组较SC组显着下降。NS组海马CA1区可见少量TUNEL阳性细胞，各组间阳性细胞数比较差异无显着性；SC组其在12 h显着增加，48 h达高峰，72 h轻度下降。ED组其动态变化趋势同SC组。见表5、图4。相关性分析 海马XBP1mRNA含量与caspase12 mRNA表达负相关；海马caspase-12蛋白与TUNEL细胞凋亡数正相关。 3 讨论 内质网膜通过其三个关键跨膜蛋白双链RNA 激活蛋白激酶样内质网激酶、活化转录因子6和抑制物阻抗性酯酶1将外界刺激信号传入胞浆和胞核，以此启动ERS。PERK主要通过广泛抑制蛋白合成来减少非折叠蛋白在内质网的沉积和聚集，同时ATF6转位至高尔基体后经第1位、第2位蛋白酶切割活化，胞浆中活化的ATF6和IRE1-的核糖核酸内切酶活性剪切掉XBP-1U mRNA一段含有26个核苷酸的内含子，使其活化为XBP-1S。活化的转录因子ATF6和XBP1与胞核内质网应激相关元件的结合，上调效应蛋白BIP/GRP78和内质网降解相关组分的基因转录，以帮助正确折叠、修饰与转运或降解ER内堆积的蛋白质，以此来改善细胞生理状态。而严重、长时间的ERS会启动内质网特异性凋亡分子如CHOP/GADD153的表达及caspase12活化从而引起细胞凋亡，以清除受损的细胞。Yoshida等有研究在第2位蛋白酶缺失的细胞中转染XBP1转录系统后，在用ERS诱导剂衣霉素或毒胡萝卜素处理后细胞未见凋亡，而没有转染XBP1转录系统的细胞凋亡率为%。Thuerauf等10报道体外培养心肌细胞低氧暴露16 h后XBP1及GRP78表达上调，当用编码XBP1显性负相腺病毒重组体感染心肌细胞后，GRP78表达下调，同时细胞凋亡数目增加，这说明XBP1作为细胞保护性信号的关键分子影响着细胞转归。Nakagawa等11在实验中发现caspase-12基因敲除细胞对衣霉素诱导的ERS反应性凋亡耐受性明显较野生株提高，由此推测caspase-12是ERS诱导凋亡的关键分子。本试验研究发现SC后4 h时XBP1 mRNA表达即开始显着上调，24 h达高峰，说明SC早期即触发了幼年大鼠海马神经元ERS；但此时间段海马CA1区TUNEL阳性细胞数尚无显着性升高，提示此阶段海马神经元ER功能尚未出现障碍，说明XBP1可能在SC早期即开始发挥适应性细胞保护作用。此外，本试验中caspase-12 mRNA在SC后12 h时开始明显上调，24 h达高峰，48 h开始缓慢下降，且与XBP1 mRNA表达负相关；而caspase-12蛋白则于惊厥后24 h达高峰，72 h显着下降，与海马CA1区神经元凋亡数则呈显着正相关，故推测caspase-12可能参与诱导了SC后神经元凋亡。 依达拉奉脂溶性高，易到达脑组织，是一种有效的脑神经保护剂，在中枢神经系统疾病如缺血低氧性脑病中的临床疗效已得到明确证实6-7。其机制包括清除氧自由基、抑制脂质过氧化和调控凋亡相关基因的表达而发挥对神经元的保护作用12。有动物实验发现SC后海马脂质过氧化物、亚硝酸盐的含量明显升高，还原型谷胱甘肽浓度降低13，SOD活性下降14，丙二醛含量增加15，说明SC后存在氧化应激。而本实验研究表明SC后ERS相关分子XBP1和caspase12表达上调，提示SC后出现了内质网应激。Malhotra等16有报告氧化应激与内质网应激两者间关系密切，并认为氧化还原状态的改变及ROS的产生直接或间接影响ER内环境的稳态及蛋白折叠功能。本实验发现依达拉奉干预后XBP1 mRNA表达上调更明显，caspase-12 mRNA及蛋白在24 h、48 h高峰期表达则显着降低，同时细胞凋亡数目与SC对应时间点相比明显减少，这提示依达拉奉可能通过上调XBP1的表达及下调caspase-12表达缓解ERS，从而减轻细胞凋亡。但SC后氧化应激与ERS之间的整合机制有待于进一步的实验研究。 【参考文献】 1 Ito D. Ischemic brain and endoplasmic reticulum stressJ.Nippon Rinsho,2006,64(Suppl 7):127-131. Oida Y,Shimazawa M,Imaizumi K,et al. Involvement of en-doplasmic reticulum stress in the neuronal death induced bytransient forebrain ischemia in gerbilJ. Neurocience,2008,151(1):111-119. Malhotra JD,Kaufman RJ. Endoplasmic reticulum stressand oxidative stress：a vicious cycle or a double-edged swordJ. Antioxid Redox Signal,2007,9(12):2277-2293. Yamamoto A, Murphy N, Schindler CK, et al. Endoplasmicreticulum stress and apoptosis signaling in human temprorallobe epilepsyJ.J Neuropathol Exp Neurol,2006,65(3):217-225. Huang ZL, Xiao B, Hu ZP, et al. Expression of GADD153 inthe hippocampus of status epilepticus model ratsJ.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2006,86(11):777-778. Otomo E. Effect of a novel free radical scavenger,edaravone(MC-186),on acute brain infarction. randomized,placebo-controlled,double-blind study at multicentersJ. Cerebrovasc Dis,2003,15(3):222-229. Noor JI, Ieda T, Mishima K, et al. Short-term administra-tion of a new free radical scavenger，edaravone,is moreeffective than its long-term administration for the treat-ment of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathyJ.Stroke,2005,36(11):L2468-2474. Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endo-plasmic reticulum stressJ. Cell Death Differ,2004,11(4):381-389. Yoshida H, Nadanaka S, Sato R, et al. XBP1 is critical toprotect cells from endoplasmic reticulum stress：evidencefrom site-2 protease-deficient Chinese Hamaster Ovary CellsJ. Cell Structure And Function,2006,31(2):117-125. 10Thuerauf DJ, Marcinko M, Gude N, et al. Activation of theunfolded protein response in infarcted mouse heart and hy-poxic cultured cardiac myocytesJ. Circ Res, 2006,99(3):275-282.11Nakagawa T, Zhu H, Morishima N, et al. Caspase-12 medi-ates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotox-icity by amyloid-betaJ. Nature,2000,403(6765):98-103.12Yoshida H, Yanai H,Namiki Y,et al. Neuroprotective ef-fects of edaravone:a novel free radical scavenger in cere-brovascular injuryJ. CNS Drug Rev,2006,12(1):9-20.13Freitas RM, Vasconcelos SM, Souza FC, et al. Oxidativestress in the hippocampus after pilocarpine-induced statusepilepticus in Wistar ratsJ. FEBS J,2005,272(6):1307-1312.14Bellissimo MI, Amado D, Abdalla DS, et al. Superoxidedismutase, glutathione peroxidase activities and the hydro-peroxide concentration are modified in the hippocampus ofepileptic ratsJ. Epilepsy Res,2001,46(2):121-128.15Dal-Pizzol F, Klamt F, Vianna MM, et al. Lipid peroxidationin hippocampus early and late after status epilepticus in- duced by pilocarpine or kainic acid in Wistar ratsJ. NeurosciLett, 2000, 291(3):179-182.16Malhotra JD, Kaufman RJ. Endoplasmic reticulum stressand oxidative stress: a vicous cycle or a double-edged swordJ.Antioxid Redox Signal,2007,9(12):2277-2293.