罗非鱼在冰藏中鲜度变化的研究.doc

成绩实验课题：罗非鱼在冰藏中鲜度变化的研究班 级：姓 名： 学 号： 指导老师： 摘要：本实验通过对新鲜罗非鱼以及冰藏罗非鱼进行感官鉴别初步加以比较其鱼肉鲜度，并进一步通过鱼肉鲜度变化的三个生化评估指标盐溶性蛋白、挥发性盐基氨（VBN）以及三甲胺(TMA-N)的检测来定性分析罗非鱼在冰藏中鲜度的变化。结果显示：新鲜罗非鱼与冰藏罗非鱼的盐溶性蛋白、挥发性盐基氨以及三甲胺的含量上有着明显的差异，并且罗非鱼鱼肉的鲜度与这三项物质含量有着密切联系。关键词：罗非鱼，鲜度，感官鉴别，盐溶性蛋白，挥发性盐基氨，三甲胺前 言罗非鱼(Tilapia，学名：Oreochromis mossambicus)，原产非洲，属热带性鱼类，第一个全球性的水产养殖品种1。罗非鱼因其肉质鲜美、细嫩，无细刺，含富蛋白质、不饱和脂肪酸等，深受人们爱慕，素有白肉三文鱼、21 世纪之鱼之称2，近年已成为养殖、加工、出口的热点之一。然而罗非鱼自身水分活度高和营养丰富导致极易腐败变质，在贮藏一段时间后，鲜度会下降，营养素流失，随着会产生一些有害人体健康的物质。贮藏时间太长，甚至会发出臭腥味3。如何辨别鱼类鲜度的变化问题一直受到人们的关注。人们一般通过感官鉴别鱼类的新鲜度，但这种鉴别要十分有经验的渔民才可鉴别准确。此外，由于鱼鲜度的变化通常归因于细菌的分解作用, 因此也可以广泛采用细菌的代谢产物三甲胺和总挥发性盐基氮一等作为评估鱼体鲜度的生化指标物质4。目前，用于鱼类鲜度测定的方法有：细菌学测定法，物理学测定法，PH测定法，K值测定法等。本文将结合测定鱼类鲜度的感官鉴别，盐溶性蛋白的测定，挥发性盐基氮的测定和三甲胺的测定等方法，研究冰藏罗非鱼的鲜度变化,探讨盐溶性蛋白，挥发性盐基氮，三甲胺的含量与罗非鱼鲜度变化的关系。1 实验原料与仪器11 实验材料与试剂1.1.1 盐溶性蛋白的测定1.1.1.1 新鲜罗非鱼及冰藏罗非鱼（约4天）1.1.1.2 高离子磷酸缓冲液（0.5M KCl-0.01M NaH2PO4-0.03M Na2HPO4）1.1.1.3 低离子磷酸缓冲液(0.025M NaH2PO4-0.025M Na2HPO4)1.1.1.4 15%三氯醋酸（TCA）1.1.1.5 1N NaOH1.1.1.6 双缩脲试剂：混合1.50gCuSO4.5H2O和6.00g酒石酸钾钠，加入500ml蒸馏水，置于烧杯中搅拌，搅拌时加入300ml10%NaOH，转移入1升的容量瓶，定容至1升，转移入塑料瓶保存。1.1.2 挥发性盐基氨的测定1.1.2.1 0.01N硫酸标准溶液或盐酸标准溶液。1.1.2.2 0.2%甲基红指示剂（60%乙醇溶液）。1.1.2.3 0.1%次甲基蓝指示剂（水溶液）。1.1.2.4 20%三氯醋酸溶液。1.1.2.5 40%碳酸钾溶液（碱式）。1.1.2.6 2%硼酸溶液。1.1.2.7 硼酸吸取剂。取2%硼酸溶液100毫升，加0.5毫升0.2%甲基红指示剂和0.5毫升0.1%次甲基蓝指示剂。用时现配。1.1.2.8 水溶胶。称取阿拉伯胶10克于玻璃研钵中，加水15毫升、甘油5毫升、无水碳酸钾5克，边加边研匀，倒入分液漏斗中，放置过夜，分出下层无泡胶，注入平皿的包有纱布脱脂棉垫上。加盖保存备用（也可用凡士林来代替）1.1.3 三甲胺的测定1.1.3.1 新鲜罗非鱼及冰藏罗非鱼（约4天）1.1.3.2 0.01N硫酸标准溶液或盐酸标准溶液。1.1.3.3 0.2%甲基红指示剂（60%乙醇溶液）。1.1.3.4 0.1%次甲基蓝指示剂（水溶液）。1.1.3.5 20%三氯醋酸溶液。1.1.3.6 40%碳酸钾溶液。1.1.3.7 2%硼酸溶液。1.1.3.8 硼酸吸取剂：取2%硼酸溶液100毫升，加0.5毫升0.2%甲基红指示剂和0.5毫升0.1%次甲基蓝指示剂。用时现配。1.1.3.9 水溶胶。称取阿拉伯胶10克于玻璃研钵中，加水15毫升、甘油5毫升、无水碳酸钾5克，边加边研匀，倒入分液漏斗中，放置过夜，分出下层无泡胶，注入平皿的包有纱布脱脂棉垫上。加盖保存备用（也可用凡士林来代替）1.1.3.10 甲醛溶液：取40%甲醛溶液，加入碳酸镁粉末，振摇后过滤。12 实验仪器1.2.1 盐溶性蛋白的测定天平（1台）、100ml烧杯（8个）、研钵（2个）、高速离心机（共2台），离心管（50ml，每组8根），100ml容量瓶（2个）、25ml容量瓶（4个）、752紫外分光光度计（共2台），移液管（1ml、2ml、5ml各2根），100ml量筒（1个）、滤纸（2包/班）、漏斗（2个），10ml试管（10根）。1.2.2 挥发性盐基氨的测定康威皿（4个，附磨砂厚玻璃盖）。内外室总直径100毫米。内室直径44毫米，深度15毫米，壁厚3毫米。外室直径20毫米，深度20毫米，壁厚5毫米。微量滴定管：最小分度为0.01毫升。研钵、烧杯等同上。1.2.3 三甲胺的测定康威皿（4个，附磨砂厚玻璃盖）。内外室总直径100毫米。内室直径44毫米，深度15毫米，壁厚3毫米。外室直径20毫米，深度20毫米，壁厚5毫米。微量滴定管：最小分度为0.01毫升。研钵、烧杯等同上。2 实验方法21 鱼肉感官品质的检测按表1所示标准检测冰藏罗非鱼的鲜度，并与新鲜鱼进行对比。表1. 冰鲜鱼类鲜度的感官鉴别指标项目新鲜较新鲜不新鲜眼球眼球饱满，角膜透明清亮，有弹性眼角膜起褶，稍变浑浊，有时由于内溢血发红眼球塌陷，角膜浑浊，虹膜合眼腔被血红色素浸红鳃部鳃色鲜红，粘液透明，无异味，（淡水鱼可带土腥味）腮色变暗呈淡红、深红或紫红，粘液带有发酸气味或稍有腥味腮色呈褐色，灰白色有混浊的粘液，带有酸臭，腥臭或陈腐味肌肉坚实有弹性，手指压后凹陷立即消失，无异味，肌肉切面有光泽稍松软，手指压后凹陷不能立即消失，稍有腥酸味，肌肉切面无光泽松软，手指压后凹陷不易消失，有霉味和酸臭味，肌肉易与骨骼分离体表有透明粘液，鳞片有光泽，贴附鱼体紧密，不易脱落（鲳、大黄鱼、小黄鱼除外）粘液多不透明，并有酸味，鳞片光泽较差易于脱落鳞片暗淡无光泽，易于脱落，表面粘液污秽，并有腐败味腹部正常不膨胀，肛门凹陷膨胀不明显，肛门稍突出膨胀或变软，表面发暗色或淡绿色斑点，肛门突出22 盐溶性蛋白的测定221 样品解决称取鱼肉样品两份（每份1g）于研钵中捣碎，转入100ml烧杯中（用高离子磷酸缓冲液和低离子磷酸缓冲液），分别加入30ml高离子磷酸缓冲液和低离子磷酸缓冲液（涉及前面加入的溶液量）进行抽提。前者抽提3小时，后者抽提1小时。然后在5000rpm离心10分钟。取上清液，加入5ml 15%三氯醋酸（TCA）使蛋白质沉淀，静置2小时后再以5000rpm离心5分钟。除去上清液取沉淀，用5ml1N NaOH 溶解沉淀，再分别以高低盐磷酸缓冲液定容至25ml，然后用双缩脲法测定蛋白质含量*。222 测定取1毫升蛋白质溶液，加入4毫升双缩脲试剂，放置半小时后测定光密度（波长 540nm）。在标准曲线上查出蛋白质含量。运用以下计算公式求出盐溶性蛋白含量(其中蛋白质浓度标准曲线采用Y=0.0584X+0.06，Y为O.D值，X为蛋白质浓度，单位为mg/mL)：盐溶性蛋白含量(mg/g)=A-B(蛋白质浓度标准曲线采用Y=0.0584X+0.06) (Y高-0.06)A= 25ml 样品重0.0584 (Y低-0.06)B= 25ml 样品重0.0584 Y-测得的吸光度（Y高、Y低分别为高盐和低盐溶液中的吸光度）；X-蛋白质浓度，mg/ml；A-高盐溶液中蛋白质含量，mg/g鱼肉；B-低盐溶液中蛋白质含量，mg/g鱼肉；23 挥发性盐基氮的测定称取罗非鱼背脊肉10g，放入研钵中捣匀，用少量蒸馏水将其转入100ml容量瓶中，加入20ml20%三氯醋酸，加水至刻度使成10%的浸出液，混匀，静止30分钟，待蛋白质沉淀后，用干燥滤纸滤入干燥的烧杯中，滤液备测。在康威皿外室磨口上涂以水溶胶（或凡士林），内室加入2%硼酸吸取剂2毫升，再于外室的一边准确加入2ml样品浸出液，盖上玻璃盖（缺口处不盖紧），然后通过玻璃盖上的缺口在外室的另一侧加入2ml40%碳酸钾溶液，立即盖紧玻璃盖，轻轻转动，使外室液体混匀。置于37恒温箱内保温2小时，取出，冷至室温，用0.01N硫酸或盐酸标准溶液滴定内室的硼酸吸取剂，使至蓝紫色即为终点。同时做一空白实验。计算公式为： (V1-V2)N14100挥发性盐基氮（mg/100g样品）= W 式中：V1：滴定样品消耗标准酸溶液体积，mL；V2：滴定空白消耗标准酸溶液体积，mL；W：用于滴定期样品液所含样品重量，g；N：标准酸溶液规定浓度，0.01N；14：每克当量氮的克数；24 三甲胺的测定样品提取液制备同挥发性盐基氮的样品制备。吸取样品提取液2毫升于康威皿外室，加入0.5毫升的甲醛溶液，皿的内室加0.5毫升2%硼酸吸取液，混匀样品提取液和甲醛溶液，皿口涂上水溶胶（或凡士林），在皿外室加入1毫升40%碳酸钾溶液，迅速盖好皿盖，轻轻左右倾斜，使碳酸钾溶液和样品提取液混匀，于37的保温箱中保温3小时，取出康威皿，放冷至室温，打开盖子，用0.01N的盐酸标准溶液滴定内室硼酸吸取液至蓝紫色即为终点。同时做一空白实验。计算： （V1-V2）N14100三甲胺（TMA-N）毫克/100克样品= W 式中：V1：滴定样品消耗标准盐酸溶液体积（毫升）V2：滴定空白消耗标准盐酸溶液体积（毫升）N：盐酸标准溶液的规定浓度。14：每克当量氮的克数。W：滴定样品液所含样品重量（克）。3实验结果与分析31 冰藏鱼肉和新鲜鱼肉感官对比实验结果如表2所示：表2 冰藏罗非鱼的感官评估项目结果眼球眼球塌陷，角膜混浊，虹膜合眼腔被血红色素浸红腮部鳃色显褐色，有混浊的粘液，带有少许酸臭，腥臭和陈腐味肌肉松软，手指压后凹陷不易消失，有少许霉味和酸臭味，肌肉易于骨骼分离体表鳞片暗淡无光泽，易于脱落，表面粘液污秽，并有少许臭味腹部膨胀不明显，肛门稍突出由表2可知，罗非鱼眼球塌陷，腮部褐色，体表分泌粘液, 肌肉已经僵硬，并且鱼肉组织变软, 失去固有弹性，随着之发出少许恶臭。由此可以判断该冰藏的罗非鱼已经不新鲜了。32冰藏鱼肉和新鲜鱼肉盐溶性蛋白含量的对比实验结果如图1所示：14.1421.94 由图1可知，实验测得的新鲜罗非鱼鱼肉的盐溶性蛋白含量比冰藏罗非鱼鱼肉多，这与理论上，盐溶性蛋白含量随鲜度的下降而减少这一结论相相符。3.3冰藏鱼肉与新鲜鱼肉挥发性盐基氮含量的对比实验结果如图2所示：11.827.72由图2可知，新鲜鱼肉的挥发性盐基氮含量比冰藏鱼肉少，这与理论上，随着鱼肉鲜度的下降，其挥发性盐基氮的含量增长这一结论相一致。3.4冰藏鱼肉与新鲜鱼肉三甲胺含量的对比实验结果如图3所示：6.262.81由图3可知，冰藏鱼肉的三甲胺含量是新鲜鱼肉的2倍多。所以可以看出罗非鱼鱼肉的三甲胺含量会随着鲜度的下降而增长。4 实验结论与讨论4.1感官变化观测中可知，该罗非鱼眼球逐渐塌陷，角膜浑浊，鳃色的颜色深，发出少许酸臭味，肌肉僵硬，失去弹性并且腹部膨胀。鱼眼球下部有结缔组织支撑,鱼死后鱼体内会发生自溶作用，由于鱼体内酶的作用, 使蛋白质逐渐分解,导致结缔组织就逐渐变软而失去支撑力，鱼眼球下陷5。鱼眼球内还具有粘蛋白, 因自溶作用而变混浊。鱼鳃由许多微丝组成, 内含血红蛋白。新鲜鱼鳃结构完整, 颜色鲜红当血红蛋白开始分解, 鳃色转变成深褐色或灰白色。鳃上复盖的粘液, 也具有蛋白质, 新鲜时润滑透明, 变质后便混浊并使鳃丝粘结。鱼鳞附着在组织细胞上, 当单体组织变质, 组织细胞受破坏, 鱼鳞极易剥落, 呈现残蚀不完整状态。鱼死后，由于体内细菌的发酵作用以及脂肪的氧化作用而产生酸臭味。鱼类肌肉由肌隔阂分开的肌节重叠而成,其肌节是由肌原纤维为主的肌纤维所构成。鱼肉肌纤维的长度从几毫米到十几毫米,直径5060,比哺乳动物的短而粗,这使得鱼肉具有固有的柔软性。然而,鱼类死后肌原纤维的结构变化甚微,I 带几乎不发生断裂。导致肌原纤维脆弱化和断裂的重要因素是机械性破坏,这种脆弱化与鱼死后的质地软化密切相关5。因此新鲜鱼肌肉组织含水分而膨胀, 富有弹性, 一旦组织分解, 水分外溢,组织便软塌而弹性变差, 严重的甚至没有弹性, 按之下陷。鱼类经常饱食, 死后腹中内食物易发酵而膨胀, 手感弹性也极差6。因此可以初步判断该鱼是不新鲜的。42盐溶性蛋白，挥发性盐基氮，三甲胺的含量实验结果表白：罗非鱼新鲜鱼肉的盐溶性蛋白比冰藏鱼肉多，对于挥发性盐基氮的含量和三甲胺含量却都是冰藏鱼肉比新鲜鱼肉多。鱼肉鲜度变化的三个生化评估指标盐溶性蛋白、挥发性盐基氨（VBN）以及三甲胺(TMA-N)的检测数据均与理论相符。盐溶性蛋白的含量是反映鱼肉或鱼糜新鲜度的常用指标，蛋白质空间构象的维系依靠分子内的二硫键、氢键、疏水键、盐键及静电互相作用等次级键，而这些键的分布与蛋白质周边水分子状态有关。冻结和冻藏过程中产生大型的冰结晶，破坏了结合水和蛋白质之间的结合状态，同时冰晶体之间的挤压作用使部分化学键遭到破坏，部分化学键获得新建，这些化学键的断裂与重建使蛋白质分子的空间结构歪斜甚至破坏，引起蛋白质变性7，盐溶性蛋白的含量下降。实验结果表白罗非鱼通过冰藏后盐溶性蛋白的含量有明显的下降。所以，随着鱼肉鲜度的下降，其盐溶性蛋白的含量下降，实验结果与理论情况相吻合。挥发性盐基氮是判断鱼类鲜度的重要化学指标之一。涉及鱼肉在酶和微生物作用下分解产生的氨、甲胺、二甲胺和三甲胺等, 这些胺类具有挥发性8。研究表白：罗非鱼的冰藏期低于5天时, 肌肉中的挥发性盐基氮含量均在10.5mg%以下, 而后趋于缓慢增长状态, 即使冰藏期达成17天, 其挥发性盐基氮含量仍维待在16mg%的水平, 仅当冰藏期超过17天后, 肌肉中挥发性盐基氮含量明显上升9。所以，随着鱼肉鲜度的下降，其挥发性盐基氮含量会上升，实验结果与理论解释一致。三甲胺是鱼腥臭的重要来源,它是氧化三甲胺(TMA-O)的还原产物. 氧化三甲胺广泛分布于水产品中,会在微生物和酶的作用下降解生成三甲胺和二甲胺,随着鲜度下降,三甲胺的体积分数会越来越高 ,它可以转化为致癌的N-亚硝基胺基化合物,因此,三甲胺是衡量肉品新鲜限度的重要指标。三甲胺含量越多，表白该肉类越不新鲜10。从实验数据中也验证了这一结论， 冰藏鱼肉的三甲胺含量比新鲜鱼肉要多。所以，实验结果基本表白，相比之下，冰藏鱼肉更不新鲜。参 考 文 献1 张李，曾庆孝，朱志伟,等.罗非鱼与四种海水鱼鱼糜比较J.现代食品科技, 2023,25（2）:1224-1226.2 巩育军,郭先霞,李瑞伟,等.罗非鱼营养成分研究进展J.中国食物与营养, 2023(11):50-52.3 王志杰.鱼的鲜度及其鉴定方法D.河北渔业,1982，（4）.4 黄国能，张钟兴.鲢鱼与罗非鱼在冰藏过程中鲜度的变化与K值和RI值（IMP相对比较值）相关性的研究J.食品科学，1987，（2）.5李学鹏，中国对虾冷藏过程中品质评价及新鲜度指示蛋白研究D，浙江：浙江工商大学，2023.6 孙新华.鱼鲜度鉴别法J.内陆水产，1994，（10）.7 胡耀辉，郑微微，李琢伟，刘俊梅.海藻糖对防止鲤鱼鱼糜蛋白质冷冻变性的研究J.食品科学，2023，（32）：128-129.8 周爱梅, 曾庆孝, 刘欣, 孙远明.冷冻鱼糜蛋白在冰藏中的物理化学变化及其影响因素J.食品科学，2023，24（03）.9 郭大钧，奚印慈.测定鱼类鲜度指标之一挥发性盐基氮J.中国水产，1983，（10）.10 秦辉，夏文水.顶空气相色谱法测定河蟹中三甲胺的含量J.食品工业科技，2023，（05）.附表：原始数据原始数据 表1 测定盐溶性蛋白时称取4种样品的质量名称冰藏的用于高离子缓冲液抽提的鱼肉冰藏的用于低离子缓冲液抽提的鱼肉新鲜的用于高离子缓冲液抽提的鱼肉新鲜的用于低离子缓冲液抽提的鱼肉质量/g1.061.031.041.01 表2 测定盐溶性蛋白时4种样品的光密度(空白值为0.00nm)名称冰藏的用于高离子缓冲液抽提的鱼肉冰藏的用于低离子缓冲液抽提的鱼肉新鲜的用于高离子缓冲液抽提的鱼肉新鲜的用于低离子缓冲液抽提的鱼肉光密度/nm0.1300.0940.1370.083表3 测定挥发性盐基氮时称取2种样品的质量名称冰藏鱼肉新鲜鱼肉质量/g10.079.98表4 测挥发性盐基氮时滴定消耗0.01N硫酸的体积（空白值为0.08ml）名称冰藏鱼肉新鲜鱼肉用量/ml0.250.19表5 测三甲胺时滴定消耗0.01N硫酸的体积（空白值为0.09ml）名称冰藏鱼肉新鲜鱼肉用量/ml0.180.13