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紫杉醇自乳化给药体系的构建研究

摘 要

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一种天然的抗癌原料药，是从红豆杉属植物短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离得到的单体双萜类化合物。它对多种人肿瘤细胞系如卵巢癌、乳癌、黑色素瘤等均有明显的细胞毒作用。由于其作用机理独特、抗癌活性显著，临床实验表白，紫杉醇也许成为治疗卵巢癌和乳癌的一线药物。
在临床应用中，紫杉醇较差的水溶性（<0.006mg/ml）导致其口服生物运用度很低，且存在急性过敏反映等问题。为此，我们尝试采用自乳化药物传递系统（SEDDS），使紫杉醇与油相、水相、表面活性剂、助表面活性剂形成O/W型微乳，解决其水溶性差的问题，同时减少毒性，提高药物的生物运用度。
本研究通过对油相、水、表面活性剂、助表面活性剂的选择和配比优化，成功地将紫杉醇包埋在乳液中，由伪三元相图得到相应的微乳区域，并结合自乳化速率及对紫杉醇的溶解性能来筛选处方。最终确立微乳的最优配方为：油酸正丁酯+聚氧乙烯蓖麻油+1，2丙二醇（3:7(2:1)），经去离子水稀释迅速形成稳定的微乳，粒径在30nm。实验条件为在37℃水浴中，温和搅拌。并在229nm,以甲醇：乙腈：水＝14：36：50为流动相，流速为1ml/min的条件下，用高效液相色谱法（HPLC）准确分析紫杉醇含量，为构建紫杉醇自乳化给药体系作了初步探索。

关键词：紫杉醇 自乳化 微乳 拟三元相图 高效液相色谱

Studies on the SEDDS of paclitaxel

ABSTRACT

Paclitaxel is a kind of natural anti-cancer drugs separated from the cortices of Taxus brevifolia. It is a monomer of di-terpene. It is active to many human cancer cell systems such as ovary cancer, breast cancer and so on. Because of its special anti-cancer mechanism and its obvious effect, Paclitaxel may become the preferred drug in curing the ovary and breast cancer in recent years.
To solve all kinds of troubles caused by the clinical using of paclitaxel, such as the hypersensitivity reactions and the poor bioavailability, we try to prepare a Self-emulsifying Drug Delivery System (SEDDS) of Paclitaxel . The oil, water, surfactant and co-surfactant were chosen to establish a system which can dissolve the paclitaxel. SEDDS can improve the bio-absorbption of paclitaxel meanwhile reduce its toxicity.
We choose prescription by portraying the pseudo-ternary phase diagram and testing the selfemulsifying rate. We successefully embed paclitaxel in the SEDDS microemulsion, and find the best prescription : normal-butyl oleate + Cremophor-EL + propane-1，2-diol（3:7(2:1)）.The HPLC method was established to determine the concentration of paclitaxel in Self-emulsifying Drug Delivery System.

Keywords: paclitaxel SEDDS microemulsions HPLC

一．前 言

癌症是当今威胁人类健康的最凶顽疾之一，是疾病导致死亡的头号杀手。据世界卫生组织记录，全世界平均每年死于癌症的患者达690多万人，每年新增患者约为870万例，并且该数字呈逐年上升的趋势。对于这种全身性、全程性的疾病来说，开发一种高效低毒的治疗药物具有非常重要的意义。
植物生物碱和其他天然药物是抗肿瘤药中的领先类别，从临床用药情况看，呈现出逐年上升的趋势，已在抗肿瘤药物中占据了半壁江山。

1．紫杉醇
1.1 理化性质及药理作用
紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一种单体双萜类天然抗癌原料药，从红豆杉属植物短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离得到，是由紫杉烷（taxane）衍生的生物碱。
其分子式为：C47H51NO14， 分子量：853.90，分子结构式为 ：

作为一种天然抗癌药，紫杉醇具有高效、低毒和广谱的特点。紫杉醇是细胞克制剂类抗肿瘤药物，可干扰癌细胞的微管蛋白合成从而发挥抗癌作用，对正常细胞基本无影响。它对大多数实体瘤有强力克制作用，临床实验表白，它对多种人肿瘤细胞系如卵巢癌、乳癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤、白血病、膀胱癌、肝肿瘤、中枢神经肿瘤等均有明显的细胞毒作用[1]。特别对晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和卡波济氏肉瘤的疗效确切、副作用较小，故上市2023来一直保持较高的增长率。同时，它也用于风湿性关节炎、皮肤病症的治疗。
紫杉醇的作用机理独特、结构新奇、抗癌活性显著，引起了医药界的极大重视和学科科研人员的广泛关注。但是紫杉醇较差的水溶性（<0.006mg/ml）使得其临床应用存在诸多不便，如急性过敏反映、生物运用度低等。由于紫杉醇缺少那些在药学范围内能离子化的基团，所以调节PH值不能提高它的水溶性，通常所采用的那些提高溶解度的方法，如添加带电荷的复合剂或将药品转化为相应的盐等，都不合用于紫杉醇[2]。

1．2 现行制剂与重要问题
目前，临床上使用的紫杉醇制剂重要是：美国百时施贵宝公司（BMS）生产的泰素（Taxol），北京四环制药厂生产的紫素（紫杉醇浓缩注射液）以及赛诺制药的复方红豆杉胶囊（原名：紫杉醇胶囊）。其中口服胶囊的生物运用度较低，在临床上使用相对较少；注射液则由于价格昂贵和存在过敏反映也未在国内市场上广泛使用。
为了解决现行紫杉醇制剂中存在的问题，国内外学者对此进行了大量的研究，提出了许多可行性方案。其中以胶体分散系统，如微乳、脂质体、胶束、生物可降解纳米粒等倍受关注，这些给药系统能不同限度地提高与癌细胞的亲和力，增长药物被癌细胞的摄取量，从而减少用药剂量和不良反映，提高疗效。然而这些给药系统又分别存在各种问题，如微乳的乳化剂选择，脂质体的稳定性差和易泄漏，胶束在临界缔合浓度以下的快速释药，纳米粒载体的毒性等等，这些问题使得这些给药系统距临床用药尚有一定距离[3, 4]。

2．自乳化给药体系
2．1 简介
口服自乳化给药系统（Self-Emulsifying Drug Delivery System，简称SEDDS）是近年来发展起来的用于疏水性药物口服给药的新技术，它是由药物、油相、非离子表面活性剂（S）和潜溶剂（助表面活性剂，Co-S）组成的热力学稳定的均一、透明或半透明、各向同性的、热力学稳定的溶液[5]。口服后在胃液水相中由于胃蠕动和乳化剂的作用下自发形成性能良好的O/W(水包油)微乳，也被称之为自微乳化药物传递系统（Self-Microemulsifying Drug Delivery System, 简称SMEDDS）。药物存在于这些细小的油滴中，可快速分布于整个胃肠道中，从而减少大块药物与胃肠道壁长时间接触后产生的刺激性。同时大大促进了水不溶性或溶解性小的药物的溶出和吸取，提高了药物的生物运用度。
与普通的乳剂相比，SEDDS是一种均相体系，因此具有较高的稳定性。与普通的油溶液相比，SEDDS能自动形成的粒径较小的乳剂（常小于5μm）[6, 7, 8]，具有较大的表面积，吸取迅速。此外，SEDDS还具有剂量准确、服用方便、制备简朴、性质稳定、适合于工业化大规模生产等优点，同时为提高水溶性小的药物的口服提供了一个新的具有广阔前景的剂型，具有极大的发展前景和应用价值。

2．2 处方设计研究
前几年的研究[ 9,10,11]重要在SEDDS的（1）油/表面活性剂的特性；（2）表面活性剂的浓度和油与表面活性剂的比例；（3）自乳化的温度。这些研究为更有效自乳化给药体系的建立打下基础。
2．2．1 油相的选择
SEDDS的油相设计是一个关键。油相在SEDDS中质量分数（w/w）一般在35%～70%，规定其安全、稳定，即使在低温贮藏条件下也不会有药物析出，且能以较少的用量溶解处方量的药物，要在不同的温度等条件下容易被所用的表面活性剂所乳化。最早使用的油是一些天然植物油，如大豆油、油酸和亚油酸等。然而这些油溶解脂溶性药物的能力和自乳化性能不是很强，所以目前使用较少。现在很多研究工作显现，对天然植物油进行结构改造后，例如用聚乙二醇改造，这些物质具有较好的结果特点和生理学上的优势，已经被成功地运用在SEDDS中 [19,22,23] 。目前常采用长链和中链的有不同限度饱和度的甘油三酯油类来设计自乳化剂型。见表1所示。
表1 几种现用的SEDDS或SMEDDS的组成成分
给药系统
油相
表面活性剂
潜溶剂
药物
药物含量
文献
SEDDS
甘油单油酸和双油酸混合物
聚乙二醇甘油单酯、双酯、三酯（HLB=14）
—
Ontazolast
白三烯克制剂
7.5%
[11]
SEDDS
(山地明®)
橄榄油
聚乙二醇甘油酯（HLB=3/4）
乙醇
环孢素A
10%
[12]
SEDDS
中链饱和脂肪酸、花生油
中链甘油单酯、双酯、Tween80、聚乙二醇-25-甘油三酯
—
Ro 15-0778,
一种萘衍生物
5%
[13]
SEDDS
中链饱和脂肪酸
聚乙二醇-25-甘油三酯
—
WIN 54954
35%
[9]
SMEDDS

聚乙二醇甘油酯（HLB=1-14）
—
消炎痛吲哚美辛
4%
[14]
SMEDDS
(Neoral®)
氢化玉米油
聚乙二醇甘油酯,
POE-蓖麻油衍生物
甘油
环孢素A
10%
[15]
SMEDDS
(Neoral®)
氢化玉米油
聚乙二醇甘油酯,
POE-蓖麻油衍生物
乙醇
环孢素A
10%
[16]
正电荷SEDDS
油酸乙酯
Tween80
乙醇
环孢素A
10%
[17]
正电荷SEDDS
油酸乙酯
Tween80
乙醇
黄体酮
2.5%
[8]

2．2．2 表面活性剂的选择
具有较高HLB的非离子表面活性剂常被用于SEDDS。不同类型的液体或固体乙氧基聚氧乙烯甘油酯和聚氧乙烯油酸酯(Tween 80)，是常被作表面活性剂。（见表1所示）常用的非离子表面活性剂尚有F68、司盘80等。以聚乙二醇甘油酯（PPG）作表面活性剂制备SEDDS也取得了较好的乳化效果。常用的PGG有：Labrafac CM8 BM284 (HLB 8)，Labrafac CM10 BM287 (HLB 10)，Labrafil M10 BM355 (HLB 10)，Labrafil NA10 BM369 (HLB 10)，Labrasol (HLB 14)[22]。通过对多种非离子表面活性剂的比较筛选研究，发现其中最有效的是HLB值为10的含油酰基链的非离子表面活性剂。Tween 85或Tagat TO比脂肪酸乙基氧化物有更好的自乳化性能[13]。对PPG的研究发现聚乙二醇（PEG）的分子大小、脂肪酸链的长短、脂肪酸的不饱和限度等因素对自乳化性能均有不同限度的影响[26]。

2．2．3 助表面活性剂的选择
加入潜溶剂的作用是减少界面张力；增长界面膜的流动性；调节HLB值；同时可以辅助溶解药物。一般采用中档链长的醇、胺及有机酸等。常用的有乙二醇、丙二醇、丙烯醇、聚甘油的衍生物。乙醇、异丙醇、甘油、聚乙二醇、Transcutol等可用作口服的SEDDS的潜溶剂。在以SEDDS为内容物的胶囊剂中，醇和其他挥发性的潜溶剂能迁移入明胶胶囊壳，也许导致酯溶性药物的沉淀。无醇的SEDDS处方无此缺陷，但对对脂质药物的溶解性有限。

2．2．4 药物
处方中药物的性质对SEDDS的自乳化有一定的影响。SEDDS通常被设计成胶囊剂。一般情况下, 固体形式的SEDDS可以有更大的含药量, 但难以拟定药物在固体SEDDS中的状态, 所以一般采用均相液体形式的自乳化系统[27]。药物在某种限度上会影响自乳化的过程, 并且对每一个SEDDS 的影响都也许不同, 但可以通过改变油/表面活性剂的比例对处方进行优化。药物也许提高自乳化的性能, 如在苯甲酸中加入中链脂肪酸甘油酯/Tween85 时, 自乳化性提高[30]； 但药物也也许对自乳化性能无影响, 如在一种甲基溶菌酶中加入中链脂肪酸甘油酯/聚氧乙烯甘油三油酸酯(Tagat TO) 体系时, 自乳化性不变[31]；此外，若表面活性剂中含乙氧基，药物中有可以与乙氧基形成氢键的基团，则其对SEDDS的乳化效果将会产生较大的影响。
总之, 为了设计一种优良的自乳化药物载体, 处方前对其溶解性和相图的研究是非常必要的。

2．3 质量评价
对SEDDS的评价重要从以下几方面进行，乳剂的粒径、乳化的速率、乳剂粒子极性等。
2．3．1 乳剂的粒径
SEDDS能自动形成的粒径较小的乳剂（常小于5μm）。其平均粒径可用Coulter Nanosizer进行测定。乳剂的粒径越小，油水界面的面积越大，乳化所得到的乳剂的稳定性越好。乳剂粒径的进一步减小将导致形成热力学稳定、均质、透明的水包油自微乳化体系（SMEDDS）[14]。

2．3．2 乳化的速率
乳化速率是测定乳化速度的一个指标，它的大小可以看出SEDDS性能。乳化速率可以通过比浊计对整个乳化过程中散射光的强度变化来进行测定，通过对时间作图来作为测定乳化速度的量度[26]。

2．3．3 乳剂粒子极性
乳剂粒子的极性与表面活性剂的HLB有关，表面活性剂中的脂肪酸链长和饱和度、亲水基团的大小都会影响到乳剂粒子极性。乳剂粒子极性可用酯溶性药物在油和水中的分派系数来衡量[26]。
药物从油滴中释放的速度与粒径、极性有密切的关系。可用如下公式[7]表达：

其中：Qt为在不同时刻从油滴扩散到水中的药物量；
r为油滴的粒径；
k为油水分派系数。
油滴的粒径r越小，油水分派系数k越小，药物释放的速度越快。

3．应用与前景
自乳化给药系统目前国内研究得比较少，尚未见文献报道。国外也刚刚起步，报道也较少。现已上市的产品只有少数几个，如环孢素软胶囊等。目前国内尚没有紫杉醇自乳化给药系统的应用报道，其他药物的自乳化给药的报道也很少见。由于自乳化给药体系可用于疏水性药物的口服给药,起到提高生物运用度和治疗效果的作用，国内外学者和公司家均一致认为自乳化给药系统是一种非常有前景的新剂型，将为解决大量水溶性差的药物的口服吸取提供一个新的途径，特别对那些在水中不稳定、生物运用度又低的药物意义更大，具有巨大的经济和社会效益。
自乳化给药体系是一种能提高弱水溶性和脂溶性药物生物运用度的很有前程的新剂型，具有巨大的经济和社会效益。然而, 处方的多样性对SEDDS性质的影响, 如微粒结构、粒径、微粒表面电荷、体内行为等仍然不很清楚, 需要进一步研究。同时SEDDS的形式多样, 设计者有很多种也许的处方选择。进一步对SEDDS中各种物质的种类及其性质的进行系统研究，并在此基础上筛选出针对性强的SEDDS的优化处方，对其体内外的研究，将是一件十分故意义的事情。

本研究以紫杉醇为模型药物，微乳为药物载体系统，研究制备了紫杉醇自乳化制剂，并对其进行质量检测。目的在于，研究一种应用方便，使用安全，毒性较低甚至无毒的新型紫杉醇制剂。

二．实验部分
一． 实验仪器、药品及试剂
1． 仪器
（1）UV-2102 C型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司
（2）2023型－HH－4数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司
（3）DF-101B集热式恒温磁力搅拌器，巩义市英峪予华仪器厂
（4）78HW-1恒温加热磁力搅拌器，杭州仪表电机有限公司
（5）KQ－50B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司
（6）DDS－11A型电导率仪，上海第二分析仪器厂
（7）DGG－9053AD型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司
（8）OHAUS AdventurerTM AR1140型电子分析天平，奥豪斯国际贸易（上海）有限公司
（9）KNAUER SY－4000K型高效液相色谱仪，德国KANUER有限公司
（10）Zetasizer3000激光粒子测定仪，

2． 药品及试剂
（1）紫杉醇：西安天诚科技有限公司
（2）1,2-丙二醇，分析纯，如皋市金陵试剂厂
（3）正丁醇，分析纯，浙江杭州双林化工试剂厂
（4）无水乙醇，分析纯，安徽特酒总厂
（5）十四酸异丙酯，化学纯，国药集团化学试剂有限公司
（6）油酸正丁酯，化学纯，国药集团化学试剂有限公司
（7）聚氧乙烯蓖麻油Cremophor-EL，
（8）橄榄油
（9）气溶胶Aerosol OT，
（10）异丙醇，分析纯，浙江杭州双林化工试剂厂
（11）蒸馏水，实验室自制
（12）苏丹红，亚甲基蓝，上海三爱思试剂有限公司
二． 实验内容
1．处方的初步筛选
1．1 油相的选择
微乳的形成规定油相分子与界面膜分子应保持适当联系，这意味着油相分子的大小对微乳形成较为重要。原则上油相分子体积越小，溶解力越强。为了提高主药在油相中的溶解度，增大微乳形成区域，应选用短链油相。
初期在许多微乳的配方中使用的是一些植物油，后来油相的选择得到了充实。为了比较各种油相在形成微乳方面有不同的效果，我们选用橄榄油、十四酸异丙酯和油酸正丁酯三种油相。橄榄油是一种可以食用的植物油，在西方国家其用途极为广泛，如今在中国也开始普遍使用。我们考虑选择橄榄油，是由于它对人体的高度安全性，而十四酸异丙酯和油酸正丁酯也是比较常见的油相。

1．2 表面活性剂的选择
表面活性剂又称乳化剂，其作用重要在于减少界面张力和形成吸附膜，促进微乳形成。根据不同的油相往往要选择不同表面活性剂。非离子型表面活性剂因毒性和刺激性均较小，合用于药物载体的制备。其在pH3～10内均可使用，受系统中电解质或离子强度的影响较小，并且可以与多种类型的助表面活性剂合用。
根据相关文献，考虑到对紫杉醇的溶解性能，本实验选择的表面活性剂是Aerosol OT、Cremophor-EL、吐温80和吐温85。

1．3 助表面活性剂的选择
助表面活性剂在微乳中重要起三方面的作用：（1）协助表面活性剂减少界面张力，使(γo/w)a减少，πf升高，从而使γt为负值；（2）增长界面流动性，减少微乳形成时的界面弯曲能，使微乳自发形成；（3）调节表面活性剂的HLB值，使表面活性剂在油-水界面上有较大的吸附。这些规定决定了助表面活性剂必须在油相与界面上都达成一定的浓度，且分子链较短。以往常用短链的醇、氨类作为助表面活性剂制备微乳。
我们选择了无水乙醇、1,2-丙二醇和正丁醇作为助表面活性剂。

1．4 水温的选择
形成微乳需要在适宜的温度下才干自发形成，由于药物需在体内代谢，而人体温度约为37℃，所以我们选择水浴温度为37℃。有助于考察微乳在人体环境温度下的各种变化。

1．5 处方配制及筛选
1．5．1 预选处方
将待选的各种油相、表面活性剂和助表面活性进行配比，拟出36种预选处方，见表2-1。
表2-1 预选处方
编号
油相
表面活性剂
助表面活性
1
橄榄油
Aerosol OT
乙醇
2
橄榄油
Aerosol OT
1，2丙二醇
3
橄榄油
Aerosol OT
正丁醇
4
橄榄油
Cremophor-EL
乙醇
5
橄榄油
Cremophor-EL
1，2丙二醇
6
橄榄油
Cremophor-EL
正丁醇
7
橄榄油
吐温80
乙醇
8
橄榄油
吐温80
1，2丙二醇
9
橄榄油
吐温85
正丁醇
10
油酸正丁酯
Aerosol OT
乙醇
11
油酸正丁酯
Aerosol OT
1，2丙二醇
12
油酸正丁酯
Aerosol OT
正丁醇
13
油酸正丁酯
Cremophor-EL
乙醇
14
油酸正丁酯
Cremophor-EL
1，2丙二醇
15
油酸正丁酯
Cremophor-EL
正丁醇
16
油酸正丁酯
吐温85
乙醇
17
油酸正丁酯
吐温85
1，2丙二醇
18
油酸正丁酯
吐温85
正丁醇
19
十四酸异丙酯
Aerosol OT
乙醇
20
十四酸异丙酯
Aerosol OT
1，2丙二醇
21
十四酸异丙酯
Aerosol OT
正丁醇
22
十四酸异丙酯
Cremophor-EL
乙醇
23
十四酸异丙酯
Cremophor-EL
1，2丙二醇
24
十四酸异丙酯
Cremophor-EL
正丁醇
25
十四酸异丙酯
吐温85
乙醇
26
十四酸异丙酯
吐温85
1，2丙二醇
27
十四酸异丙酯
吐温85
正丁醇
28
油酸正丁酯
吐温80
乙醇
29
油酸正丁酯
吐温80
1，2丙二醇
30
油酸正丁酯
吐温80
正丁醇
31
十四酸异丙酯
吐温80
乙醇
32
十四酸异丙酯
吐温80
1，2丙二醇
33
十四酸异丙酯
吐温80
正丁醇
34
橄榄油
吐温80
乙醇
35
橄榄油
吐温80
1，2丙二醇
36
橄榄油
吐温80
正丁醇

1．5．2 配制方法
将所选的油相、表面活性剂和助表面活性剂按照1：1：1的质量比（即各1g）加入到100ml锥形瓶中，在37℃水浴中用磁力搅拌器搅拌30分钟使三种成分充足混匀。用移液管逐量加入去离子水至500ml，观测过程现象并记录成微乳所需的水量。

1．5．3 实验结果
在实验中观测到，含水量低时各系统均可形成油包水型微乳或胶束，表现为一种透明或略带乳光的油状溶液；有些油包水型微乳加水至一定量出现浑浊，再加至一定量时又澄清，此时认为形成了水包油型微乳。当表面活性剂含量高时会出现玻璃状的凝胶态，其粘度较大，随着水量的增多会逐渐溶解。有些处方则未能形成水包油型微乳，水量直至500ml仍浑浊未达半透明状态或分层。
将稳定后的各体系倒入已编号的试管，加入少量苏丹红染色，可清楚观测到系统的均一或分层情况。

图2-1 第1-9号处方

图2-2 第10-18号处方

图2-3 第19-27号处方

图2-4 第28-36号处方

1．5．4 分析与结论
（1）在实验操作中发现，Aerosol OT由于是固体，需先用助表面活性剂将其溶解，但实验中两者搅拌超过30min还是未溶解，加入油相后需再搅拌30m才干完全溶掉，溶解性能较差且操作上比较麻烦，故考虑将其淘汰。
（2）由图一可以发现油相为橄榄油的系列基本都出现分层现象，油溶性的苏丹红染色在最上层表现为较深的橙红色，下层则为无色或较浅色。操作中橄榄油系列成微乳现象不抱负，故考虑将其淘汰。
（3）图四中9组配方都以吐温80为表面活性剂，但其分层及浑浊现象明显，且配制过程中较难形成半透明微乳，体系不够均一稳定，故考虑将吐温80淘汰。

2． 处方的进一步筛选优化和最优处方的确立
2．1 处方的选择和配比
鉴于预选处方所得到的结论以及查阅紫杉醇溶解性能相关资料，现拟定待选各自乳化辅料成分如下：
油相：十四酸异丙酯，油酸正丁酯
表面活性剂：Cremophor-EL，吐温85
助表面活性剂：1，2丙二醇，正丁醇，异丙醇，乙醇
将三种成分组合配比如表2-2进行微乳配制：
表2-2
编号
油相（A）
表面活性剂（B）
助表面活性剂（C）
用量比B:C
用量比A:(B+C)
1
十四酸异丙酯
Cremophor-EL
正丁醇
①1：1
②2：1
③4：1
④8：1
①-④分别要做1：9，2：8，3：7，4：6，5：5，6：4，7：3，8：2，9：1九个比例
2
油酸正丁酯
Cremophor-EL
正丁醇
同上
同上
3
十四酸异丙酯
Cremophor-EL
1，2丙二醇
同上
同上
4
油酸正丁酯
Cremophor-EL
1，2丙二醇
同上
同上
5
十四酸异丙酯
Cremophor-EL
异丙醇
同上
同上
6
油酸正丁酯
Cremophor-EL
异丙醇
同上
同上
7
十四酸异丙酯
Cremophor-EL
乙醇
同上
同上
8
油酸正丁酯
Cremophor-EL
乙醇
同上
同上
9
十四酸异丙酯
吐温85
1，2丙二醇
同上
同上
10
油酸正丁酯
吐温85
正丁醇
同上
同上

2．2 微乳的配制方法
将表二中的各种处方成分按照相应质量比精确称量并加入到100ml锥形瓶中，用磁力搅拌器在37℃水浴中搅拌20分钟，使油相、表面活性剂和助表面活性剂充足混匀。用移液管逐量加入去离子水，观测过程现象并记录成微乳所需的水量。水量应加至油相质量的500倍为终点，即油相0.5g，水250ml（水的密度视为1g/ml）。
2．3 形成微乳的判断方法及现象分析
判断形成0/W型微乳的方法是：体系形成澄清透明、稳定均一的水溶液，略带蓝色乳光，上层无油状物质漂浮。有些处方乳光明显且不容易达成全透明状态，则应继续加水至半透明；有些处方不够稳定，刚加完水时澄清透明，但放置一段时间后会有油状物质析出，判断为过量的表面活性剂，因此需继续加水直至放置2h以上仍稳定无析出物。在肉眼无法拟定的情况下，应借助亚甲基蓝或苏丹红染色法来判断体系的水/油溶性，以及用电子显微镜观测粒径大小加以判断。
一般较好的处方加水量在10ml内便可形成微乳，因此在加去离子水时务必要逐量操作，通常一次加1-2ml后放置观测，临近终点时可逐次加0.5ml以加强数据的精确性。

2．4 绘制伪三元相图
根据各处方形成O/W型微乳的用水量及油相、表面活性剂和助表面活性的用量，可将每个编号系列的①-④分别绘制一个伪三元相图，即10个编号系列共40个图，分列如下：
(1)十四酸异丙酯+Cremophor-EL+正丁醇

图2－5
(2)油酸正丁酯+Cremophor-EL+正丁醇

图2－6

(3)十四酸异丙酯+Cremophor-EL+1,2丙二醇

图2－7

(4)油酸正丁酯+Cremophor-EL+1,2丙二醇

图2－8
(5)十四酸异丙酯+Cremophor-EL+异丙醇

图2－9
(6)油酸正丁酯+Cremophor-EL+异丙醇

图2－10

（7）十四酸异丙酯+Cremophor-EL+乙醇

图2－11
（8）油酸正丁酯+Cremophor-EL+乙醇

图2－12

（9）十四酸异丙酯+Tween85+1，2丙二醇

图2－13

(10) 油酸正丁酯+Tween85+正丁醇

图2－14

2.5相图分析与结论
根据各组伪三元相图的成微乳区域的面积大小，以及油相用量和水量的多少，可进一步筛选处方。由此可选出每组处方中表面活性剂与助表面活性剂的最佳比例；而油相与表面活性剂加助表面活性剂的比值则应选择形成微乳时所需用水量占总量比例最小的那组。由此筛选得出各组最优配比如表2-3。
表2-3 各处方最优配比
组别
处方
最佳B：C
最佳A/(B+C)
（1）
十四酸异丙酯+Cremophor-EL+正丁醇
1：1
3：7
（2）
油酸正丁酯+Cremophor-EL+正丁醇
8：1
3：7
（3）
十四酸异丙酯+Cremophor-EL+1,2丙二醇
1：1
3：7
（4）
油酸正丁酯+Cremophor-EL+1,2丙二醇
8：1
3：7
（5）
十四酸异丙酯+Cremophor-EL+异丙醇
1：1
2：8
（6）
油酸正丁酯+Cremophor-EL+异丙醇
4：1
1：3
（7）
十四酸异丙酯+Cremophor-EL+乙醇
4：1
3：7
（8）
油酸正丁酯+Cremophor-EL+乙醇
2：1
3：7
注：①表中A代表油相，B代表表面活性剂， C代表助表面活性剂。
②组别（9）和（10）的伪三元相图中各配比的成微乳区域都非常小，几乎集中在顶点位置，且这些处方在配制微乳过程中很难形成半透明微乳液，少量水时几乎都浑浊不透明，水量加至100ml甚至200ml才达成半透明状态，由此可判断吐温85不是抱负的表面活性剂，因此将（9）（10）组别淘汰。

2.6 自乳化速率测定
2．6．1 方法与结果
将表三中选出的8个较好的处方配比分别投入到模拟胃环境中，测定其自乳化速率。具体方法为：称取相应量的油相、表面活性剂和助表面活性剂于100ml锥形瓶中，在37℃水浴中搅拌20分钟，使三者充足混匀。用1ml针筒抽取0.5ml混合物，注入事先置于37℃水浴中的有搅拌装置的大烧杯中，内盛有800ml去离子水，保持温和搅拌状态，每隔3-5min测一次大烧杯内混合体系的吸光度，直至系统基本达成稳定。绘制自乳化速率图如下：

图2－15 十四酸异丙酯系列处方的自乳化速率测定汇总图

图2－16油酸正丁酯系列处方的自乳化速率测定汇总图

2．6．2 分析与结论
由图2-15和图2-16可以判断：
（1）十四酸异丙酯+Cremophor-EL+1，2丙二醇3：7（1：1）体系直至170min吸光度仍处在上升趋势，说明此微乳液尚未达成稳定状态，自乳化速率不佳。
（2）十四酸异丙酯+Cremophor-EL+乙醇3：7（4：1）体系稳定期间在40min左右，自乳化速率一般。
（3）十四酸异丙酯+Cremophor-EL+异丙醇 2：8（1：1）体系虽然整体看吸光度起伏不大，但从20min至80min仍在缓慢地上升，因此其稳定期间应当为80min，自乳化速率也不佳。
（4）十四酸异丙酯+Cremophor-EL+正丁醇3：7（1：1）体系直至160min吸光度仍处在上升趋势，说明此微乳液尚未达成稳定状态，自乳化速率不佳。
（5）油酸正丁酯+Cremophor-EL+1，2丙二醇3：7（8：1）体系在10min左右已达成恒定的吸光度值，说明此时已形成稳定的微乳液，自乳化速率较好。
（6）油酸正丁酯+Cremophor-EL+异丙醇1：3（4：1）体系稳定期间在30min左右，自乳化速率一般。
（7）油酸正丁酯+Cremophor-EL+正丁醇3：7（8：1）体系于40min左右吸光度开始维持恒定，说明在40min时已基本形成稳定的微乳液。
（8）油酸正丁酯+Cremophor-EL+乙醇3：7（2：1）体系吸光度虽整体起伏不大，但前阶段一直缓慢上升，稳定期间在50min左右，自乳化速率一般。
总结出各处方形成稳定微乳体系的时间如表2-4。
表2-4 各处方自乳化时间
序号
处方
自乳化时间/min
（1）
十四酸异丙酯+Cremophor-EL+1，2丙二醇3：7（1：1）
>170
（2）
十四酸异丙酯+Cremophor-EL+乙醇3：7（4：1）
40
（3）
十四酸异丙酯+Cremophor-EL+异丙醇 2：8（1：1）
80
（4）
十四酸异丙酯+Cremophor-EL+正丁醇3：7（1：1）
>160
（5）
油酸正丁酯+Cremophor-EL+1，2丙二醇3：7（8：1）
10
（6）
油酸正丁酯+Cremophor-EL+异丙醇1：3（4：1）
30
（7）
油酸正丁酯+Cremophor-EL+正丁醇3：7（8：1）
40
（8）
油酸正丁酯+Cremophor-EL+乙醇3：7（2：1）
50
从表2-4可以清楚地看到，处方（5）的自乳化时间远远小于其他几个处方，在10分钟内便形成稳定的微乳体系，根据文献资料，良好的自乳化处方应当在15分钟内便达成稳定，因此此处方符合规定，自乳化速率抱负。

2．7 最优处方的确立
从自乳化速率测定实验中，得到的最优处方配比为：油酸正丁酯+ Cremophor-EL+1,2丙二醇（3：7（8：1）），微乳体系在10min内便达成稳定，自乳化速率比较抱负。且此配比的伪三元相图微乳区域很大，在所有相图中是最大的一个，配制过程中很容易形成透明带明显乳光的O/W型微乳，系统稳定，几种筛选比较方法结论一致，因此，确立该配比为最佳自乳化处方。

3． 微乳及紫杉醇自微乳体系特性评价
3．1 紫杉醇的溶解度测定
3．1．1 紫杉醇检测波长选择
将少量的紫杉醇溶于流动相中，在200-400nm波长 范围内扫描，拟定紫杉醇的最大吸取波长。

图2－13 紫杉醇波长扫描图
结论：紫杉醇在229nm的波长下有最大吸取

3．1．2 标准曲线的建立
配制浓度为4，8，20，40，80，100μg/ml的6个样品溶液，各取20 u1进样测定，记录各自中的紫杉醇在波长229nm所出的峰面积。以峰面积积分值对紫杉醇标准溶液浓度作图，得到体外测定紫杉醇浓度的标准曲线。

图2－14紫杉醇峰面积—浓度标准曲线
由图可见，以峰面积与浓度为两轴建立的标准曲线在4—100μg/ml浓度范围内线形关系良好。

3．1．3 回收率实验
精密称取紫杉醇适量，用高、中、低三种标准工作液浓度按拟定的方法测定，以考察方法的回收率，结果见表2-4。
表2-4 回收率表
称 量 （g）
稀释后浓度 （μg/ml）
测定的浓度 （μg/ml）
回 收 率 (%)
平均回收率（％）
总回收率(%)
0.0152
12.16
11.909
97.9
97.6
97.9
48.64
47.632
97.9
85.12
82.578
97
0.0151
12.08
12.058
99.8
98.8
48