氨甲环酸醇质体的制备及体外评价.pdf

6Feb:32(1)2024氨甲环酸醇质体的制备及体外评价余胜男1,姜伟化,杜子蝶,李念光1*,刘飞2*1江苏省中药资源产业化过程协同创新中心南京中医药大学，南京2 10 0 0 0；2南京迈诺威医药科技有限公司，南京2 10 0 0 0摘要目的：制备氨甲环酸醇质体（TAES），并初步考察其体外透皮性能。方法：采用乙醇注入一挤出法制备TAES。通过单因素考察和Box-Behnken设计一响应面法对处方进行筛选及优化；按最优处方制备TAES，对其进行质量评价，并进行体外透皮试验。结果：优化后的TAES处方脂药比为3.2 0:1，胆固醇用量为0.6 2%，乙醇用量为19.37%。制得的TAES为类球形，平均粒径为（19 4.34.1)nm，Ze t a 电位为（-32.2 2.6)mV，包封率为（17.2 0 0.8 9)%。体外透皮试验结果表明，与氨甲环酸水溶液相比，TAES不仅提高了药物经皮渗透量（4.9 8 倍），而且还增加了深层皮肤滞留量（1.7 4倍）。结论：制备的TAES能够提高氨甲环酸的经皮渗透量和深层皮肤滞留量，有望成为黄褐斑治疗药物的新载体。关键词同氨甲环酸；醇质体;Box-Behnken设计-响应面法；体外透皮试验中图分类号R944.9文献标志码A文章编号1673-7806(2024)01-006-06黄褐斑是一种慢性难治性色素沉着障碍疾病，典型临床表现为色素沉着斑和斑块，一般对称分布在面部、颈部。目前确切的黄褐斑发病机制尚不十分清楚，一般认为遗传因素、紫外线照射和激素影响是其发病的主要原因2 。目前，治疗黄褐斑的方法均旨在减少黑色素形成(局部制剂)以及消除既存的黑色素3,例如化学剥脱、激光治疗4。但这些治疗方法都不可避免地因刺激、发炎或角质细胞损伤而活化黑色素细胞，进而导致色素复发或者炎症后色素沉着(post-inflammatory hyperpigmentation,PIH)。氨甲环酸（tranexamic acid,TA），又名凝血酸，主要用于治疗多种出血症状5。19 7 9 年，日本学者二條贞子首次发现TA对黄褐斑的治疗作用3,其作用机制是TA抑制纤溶酶原激活系统、减少黑色素的生成,可用来预防和治疗PIHI7。目前已有大量关于TA治疗黄褐斑的临床研究，给药途径包括注射、口服、局部给药等8。相对于口服及注射给药，局部给药是一种更具吸引力的替代治疗方案，可以提高药物生物利用度并消除潜在的全身副作用19.10。然而TA是一种极性分子，透皮吸收能力差，直接将其制成普通的皮肤外用制剂，药物不易到达皮肤深层，作者简介余胜男，女，在读硕士E-mail:*通信作者李念光，男，教授E-mail:刘飞，男，副高级工程师E-mail：l i u f e i m n v p h a r m a.c o m收稿日期2023-07-18修回日期2023-09-15影响疗效叫醇质体作为一种新型脂质体，目前主要用于皮肤给药12)。与普通脂质体相比，醇质体处方中含有较高浓度的乙醇，因此结构稳定，颗粒柔韧性佳，易变形穿透皮肤屏障进入皮肤深层，促进药物的扩散及吸收，从而大大提高经皮渗透量及深层皮肤（角质层下或表皮和真皮)滞留量12.13。目前暂无文献报道氨甲环酸醇质体（TAES）。本研究采用乙醇注人-挤出法制备TAES，基于单因素考察结果，采用Box-Behnken设计（BBD）,对处方中的脂药比、胆固醇用量和乙醇用量三个因素进行优化，并通过Franz立体扩散装置对优化后的TAES经皮渗透性能进行评价，为黄褐斑的治疗提供实验基础。1材料与仪器1.1材料与试剂氨甲环酸（TA，批号：VPTX21002，烟台万润药业有限公司，含量10 0.0%）；磷脂型号：SC-95,艾伟拓（上海）医药科技有限公司，AVT)；磷脂（型号：S75、S100，德国Lipoid公司）；胆固醇（批号：J2126327,美国Aladdin公司）；无水乙醇（南京化学试剂股份有限公司）；聚碳酸酯膜（批号：R3NA30391，美国MerckMillipore公司）；葡聚糖凝胶SephadexG-50（批号008HS196386，上海源叶生物科技有限公司）；超滤离心管（美国MerckMillipore公司）；甲醇为色谱PharmaceuticalandClinicalResearch研药学与临床研究药学纯；其他试剂为分析纯。实验用猪皮（约2 月龄的巴马香猪猪皮）购自临西县敬德农产品销售有限公司。1.2仪器与设备QUINTIX224-1CN型电子天平（德国Satorius公司）；TLE2002E电子天平（瑞士MettlerToledo公司）；T25高剪切分散乳化机（德国IKA集团）；AE005挤出器安拓思纳米技术（苏州）有限公司;HT7800透射电子显微镜（日本HITACH公司）;Ze-tasizer Nano ZS纳米粒度及Zeta电位分析仪（英国Malven公司）;TG16G台式高速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；VAPOSCAN经皮水分丢失测定仪（日本ASCH公司）；TD-12AT全自动透皮扩散系统（深圳市华溶分析仪器有限公司）；AgilentHPLC系统（包括ZORBAXSB-Aq、Y M C-Pa c k O D S-A Q色谱柱,UV、CA D 检测器）。2方法与结果2.1氨甲环酸醇质体的制备采用乙醇注人-挤出法制备TAES。称取处方量的磷脂、胆固醇，加人适量无水乙醇，30 恒温水浴加热溶解，作为有机相；将TA溶于水相介质中，作为水相。用注射器吸取有机相,将其缓慢匀速滴人30 磁力搅拌下的水相中，滴加完毕后继续搅拌30min。设定挤出器压力为2 0 0 kPa，使用0.2 2 m聚碳酸酯膜将溶液反复挤出3次,即得TAES。2.2粒径、Zeta电位的测定取10 0 LTAES,用纯化水将其稀释至1mL，对样品粒径进行测定，平行测定3次。取适量TAES样品，加人到电位样品池，对样品的Zeta电位（9)进行测定，平行测定3次。2.3含量测定采用高效液相色谱法(HPLC)检测TAES包封率及样品含量，检测器：UV检测器；AgilentZORBAXSB-Aq色谱柱(2 50 mm4.6mm,5m);流动相：50mmolL-磷酸二氢钠缓冲溶液（pH2.5)-甲醇(9 0:10）；检测波长为2 10 nm；柱温：2 5；流速：1.0 mLmin-l;进样量:2 0 L。采用HPLC法检测体外透皮试验样品含量，检测器：CAD检测器；YMC-PackODS-AQ色谱柱(150mm4.6mm,3m）；流动相：0.1%甲酸溶液-甲醇（9 0:10）；检测波长为2 10 nm；柱温：30；流速：0.5mLminl;进样量:10 L。2.4包封率（entrapmentefficiency,EE)测定2.4.1醇质体含量测定吸取TAES200L置于10 mL量瓶中，加入0.5mL1molL-lNaOH溶液，于8 0 恒温加热15min，取出后静置至室温，再加人0.5mL 1molL-l HCl 溶液,加水定容,摇匀后用0.45mPTFE滤膜过滤，取续滤液，按照“2.3”项下的条件进行含量测定，记TAES含量为WT2.4.2葡聚糖凝胶柱的制备将SephadexG-50葡聚糖凝胶在纯化水中浸泡48 h，使其充分溶胀。取适量装填于2.5mL去芯注射器内，保证凝胶柱高度为5cm,即得微型SephadexG-50葡聚糖凝胶柱。2.4.3EE测定量取0.2 mLTAES于凝胶柱顶端，加纯化水多次洗脱，收集洗脱液。用2.4.1 项下的方法测定洗脱液含量，计算被包封药物含量WE。根据公式EE（%）=W e/W r 10 0%，计算包封率。2.5体外透皮试验2.5.1扩散池透皮试验采用Franz立体扩散装置研究TAES的体外经皮渗透性。将猪皮固定在Franz立体扩散装置上（有效扩散面积A=1.33cm）。加人脱气处理的纯化水作为接收介质（V=12.5mL)。试验温度设置为（32.0 1.0)，转速设定为6 0 0 rmin-l。待系统平衡后，使用经皮水分丢失测定仪检查皮肤完整性，确认皮肤无破损后,加入6 0 L待测样品。2 4h后，测定接收液含量，记浓度为C,计算单位面积药物经皮渗透量=CVIA。2.5.2角质层滞留量和深层皮肤滞留量的测定24h后,取下猪皮，轻轻擦去皮肤表面残留制剂，用滤纸吸干。使用压敏胶带反复粘贴10 次后放入10mL离心管中，加入2 mL10%甲醇溶液超声1h，用0.45m尼龙滤膜过滤，取续滤液按照2.3 项下的条件进行含量测定，即得药物在角质层中的滞留量。将猪皮给药区域剪碎，放入10 mL离心管，后同法测定含量，即得药物在深层皮肤中的滞留量。2.6单因素考察本实验以粒径、多分散性指数（polydispersityindex,PDI)、电位值及包封率为评价指标，对TAES处方进行单因素实验考察，具体内容如下。2.6.1磷脂型号的考察固定脂药比为3:1，胆固醇用量为0.6%，乙醇用量为2 0%，按照“2.1 项方法制备TAES，考察不同磷脂型号（LipoidS100、Lipoid S75、A VT SC-9 5)对醇质体粒径、电位及包封率的影响。结果如表1所示，三种不同型号的磷脂制备的TAES样品粒径均在150 2 0 0 nm范围内,PDI 30 mV，稳定性良好；在20mV左右，即能满足稳定性要求4。LipoidS75制备的TAES样品电位为-33.5mV，提示其具有更好的稳定性，原因可能是Lipoid S75含有更多带负电荷的磷脂酸、磷脂酰肌醇和游离脂肪酸，而这些成分会使醇质体的电位变低15。故综合考虑TAES样品包封率，磷脂型号选用LipoidS75。表1磷脂型号考察（n=3）磷脂型号粒径(nm)PDI电位（mV)EE(%)Lipoid S100195.2 1.60.06 0.023.3 0.33.75 0.05Lipoid S75185.4 3.10.18 0.0133.5 6.19.86 0.03AVTSC-95177.3 1.90.13 0.01-3.9 0.49.49 0.24选择LipoidS75磷脂，固定胆固醇用量为0.6%，乙醇用量为10%，按照“2.1 项方法制备TAES，考察脂药比(2:1、3:1、6:1)对醇质体粒径、电位及包封率的影响。由表2 可知,脂药比对TAES的粒径无明显影响,所制得的TAES样品粒径均在2 0 0 nm左右，且PDI均小于0.2,粒度分布均匀。所有TAES样品的电位绝对值均大于30mV，提示其可能具有良好的物理稳定性。当脂药比为3:1时，醇质体的包封率最高；当大于或小于该比值时样品包封率均下降。这可能是因为在一定范围内，磷脂用量的增加有助于提供更多的包囊空间包封药物，而当磷脂浓度过高，包封率反而下降0 ；固定磷脂用量，只能保证一定的载药浓度17 ，继续增加处方中原料药的比例，只会减小药物包封率。表2脂药比考察(n=3)脂药比粒径（nm)PDIg电位（mV)EE(%)2:1201.4 2.40.17 0.01-54.4 6.97.20 0.073:1207.21.50.17 0.0338.2 1.015.37 0.436:1198.9 0.50.14 0.02-44.5 1.78.200.12选择LipoidS75磷脂,固定脂药比为3:1，乙醇用量为2 0%，考察不同胆固醇用量（0.4%、0.6%、0.8%）对TAES粒径、电位及包封率的影响。由表3可知,在一定范围内,随着胆固醇用量增加,TAES的粒径略增大，但均小于200nm，且均匀性良好。胆固醇用量为0.4%和0.6%时，电位分别为-32.4mV和-33.5mV；当胆固醇用量增大至0.8%时，电位显著降低至-49.6 mV，但都低于-30 mV，制剂稳定性良好。胆固醇用量在0.4%0.8%范围内，包封率呈现先上升后下降的趋势，可能是因为胆固醇用量低，会导致醇质体流动性过大，难以包封较多药物；用量过高，得到的醇质体刚性过强，包封率也随之减小18 表3胆固醇用量考察(n=3)胆固醇用量粒径(nm)PDI电位（mV)EE(%)0.4%163.7 1.40.15 0.01-32.4 0.95.89 0.270.6%185.4 3.10.18 0.0133.5 6.19.86 0.030.8%192.5 1.20.19 0.01-49.6 2.17.46 0.31定脂药比为3:1，胆固醇用量为0.6%，考察10%、20%、30%乙醇用量对TAES粒径、电位及包封率的影响。表4结果表明，随着乙醇浓度提高，样品粒径和电位绝对值均减小。包封率随乙醇浓度增加呈现出先升高后降低的趋势。这可能是因为在一定范围内，TAES包封率随着乙醇用量的增加而增加，超过该值后，乙醇会溶解磷脂，导致醇质体结构被破坏，造成药物泄漏，从而导致包封率下降16 表4乙醇用量考察(n=3)乙醇用量粒径（nm）PDI9电位(mV)EE(%)10%207.2 1.50.17 0.03-38.2 1.015.37 0.4320%168.3 1.40.19 0.01-25.0 0.117.01 0.5430%145.2 2.90.21 0.01-17.1 1.18.53 0.24选择LipoidS75磷脂，固定脂药比为3:1，胆固醇用量为0.6%，乙醇用量为2 0%，考察不同浓度和pH的磷酸盐缓冲液和纯化水作为溶剂对TAES粒径、电位及包封率的影响，结果见表5。不同的水相介质种类对TAES的粒径影响不大，得到的TAES粒度均匀性良好。但与纯化水作为水相介质相比，选用PBS作为水相介质会显著减小TAES的电位绝对值及包封率。故选择纯化水作为水相溶剂。表5水相介质种类考察考察（n=3)水相介质粒径(nm)PDI9电位（mV)EE(%)种类20 mmol L-I205.8 0.70.12 0.01-3.5 0.34.510.12pH5.0 PBS50 mmol L-1205.4 0.90.12 0.033.2 0.26.32 0.29pH6.0 PBS50 mmolL-1175.2 1.60.10 0.02-3.2 0.45.29 0.04pH6.8 PBS50 mmol L-1180.7 1.70.11 0.01-2.5 0.64.98 0.01pH8.0 PBS纯化水185.43.10.18 0.0133.56.19.860.032.7响应面法优化根据单因素考察结果,选定脂药比（X）、胆固醇用量(X2)、乙醇用量(X3)为三因素,以包封率(Y)为考察指标，运用DesignExpert进行BBD，优选TAES处方。考察因素水平、试验设计及结果见表6。本实验方案采用二次多项式模型，该模型显著性检验P0.05，表明该模型与试验结果拟合程度比较好。模9PharmaceuticalaClinicalResearch药学与临床研究表6BBD试验设计与结果序号XX2XY12:1(-1)0.6(0)10(-1)10.4223:1(0)0.6(0)20(0)15.7134:1(1)0.6(0)30(1)9.7843:1(0)0.5(-1)10(-1)10.5653:1(0)0.7(1)10(-1)9.8662.4:1(0.6)0.6(0)10(-1)12.173:1(0)0.6(0)20(0)17.3583:1(0)0.7(1)30(1)10.6593:1(0)0.6(0)20(0)16.85102:1(-1)0.5(1)20(0)11.81114:1(1)0.6(0)10(-1)10.39123:1(0)0.5(-1)30(1)7.3133:1(0)0.6(0)20(0)17.04143:1(0)0.6(0)20(0)19.09152:1(-1)0.6(0)30(1)4.75164:1(1)0.5(-1)20(0)11.89174:1(1)0.7(1)20(0)14.53型相关系数=0.9 6 6 0，校正系数RAg=0.9223，表明该模型拟合较好，适合用于预测TAES包封率。通过该模型的方程回归系数显著性检验（表7),X,和X,对TAES包封率的线性效应显著(PXiX2;Xi、X和X，的二次项P值均小于0.0 1，说明对响应结果的曲线效应较显著。使用Design-Expert软件对各因素之间的交互作用进行效应面分析，绘制效应面曲线，结果见图1。表7响应面二次系数显著性分析来源平方和自由度方差FP模型230.88925.6522.100.000 2X6.5816.585.670.0489X21.4611.461.260.298 4X310.89110.899.380.0183X,X21.7511.751.510.2595XX;7.1017.106.120.0426X2X34.1014.103.530.1022X?27.50127.5023.700.001 8X215.60115.6013.440.008 0X104.721104.7290.230.0001残差8.1271.16失拟向2.1630.72050.48340.7117纯误差5.9641.49总离差239.0116以TAES的包封率处于最大值作为优化指标，通过DesignExpert软件进行BEE(%)A0.720(%）国明10(%)0.6一5000.740.630.5+胆固醇(%)0.552234脂药比脂药比DEE(%)C30-2010(%)(%）Z20030420310+乙醇(%)234102脂药比脂药比FEE(%)E30-2010(%)(%)Z20-500300.7200.610+乙醇(%)100.5胆固醇(%)0.50.60.7胆固醇(%)图1基于效应面法不同因素对包封率的影响(A)(B)脂药比和胆固醇用量（XX);(C)(D)脂药比和乙醇用量(X,X);(E)(F)胆固醇与乙醇用量(X,X,)。分析优化，得到最佳处方为：脂药比为3.2 0 2:1，胆固醇用量为0.6 15%，乙醇用量为19.36 6%，在此条件下包封率为17.40 5%。为验证优化处方参数的可靠性，结合实验便捷性和可操作性，将处方调整为：脂药比3.2 0:1，0.6 2%胆固醇，19.37%乙醇。在此条件下进行3次平行试验，得到TAES包封率为（17.2 0%0.89%），与理论值的误差为1.2%（2%），说明由响应面优化得到的最佳处方条件具有高度可靠性。最优处方条件下，TAES包封率为17.40 5%，与TA脂质体包封率报道结果基本一致19 。虽然脂溶性和水溶性药物均可被醇质体包封，但现有包封率较高的醇质体或脂质体的药物多为脂溶性，而TA属于极性小分子药物，亲脂性较差，故包封率偏低。2.8质量评价图2 A可看出制得的TAES外观为澄清半透明、带蓝色乳光的液体。使用TEM对2%醋酸铀负染后的TAES（稀释10 倍）进行形貌观察，图2 B的结果显示TAES为近球形结构，粒径在17 0 nm左右。TAES的粒径和PDI分别为（19 4.34.1)nm和(0.2 10.0 1)(图3A）,Ze t a 电位为10TAES在2 8 贮存2 周和氨甲环酸醇质体的制备及体外评价AB200nm图2形貌观察(scale bar=200 nm)（-32.2 2.6)mV（图3B）。通过动态光散射（dynam-iclight scattering,DLS)测量的粒径略大于TEM结果，这是因为DLS测得的结果是样品水合粒径，而TEM测定的结果来自脱水样品，所以粒径偏小。一个月后,再次测定TAES的粒径及电位。结果如表8 所示，TAES在2 8 条件下贮存一个月，其粒径、PDI及电位均无明显变化，表明制得的TAES稳定性良好x105126AB8442-0+0+10100100010000-200-1000100Size(nm)ApparentZetaPotential(mV)图3(A)粒径分布和(B)Zeta电位表8 TAES稳定性情况稳定性条件粒径(nm)PDI电位(mV)0天194.3 4.10.21 0.01-32.2 2.6282 周196.0 9.10.20 0.04-28.5 3.7281月190.0 0.50.18 0.00-37.1 2.62.9体外透皮试验结果与分析制备1%TA水溶液作为对照组，考察TAES和TA水溶液的体外透皮行为，结果见表9。与对照组比较，TAES药物2 4h累积渗透量显著增加，相同药物浓度下,TAES组的经皮渗透量为对照组的4.98倍。透皮吸收2 4h后,TAES组的皮肤滞留（角质层+深层皮肤）总量6 1.41g?cm-2与对照组59.71g?cm基本一致；但是TAES组在角质层和深层皮肤的TA药物滞留量分别为对照组的0.43倍和1.7 4倍，表明TAES能有效提高药物渗透，增强药物在深层皮肤储留。而黄褐斑的色素沉着主要表现在皮肤深层的黑色素较多2 0 ,所以TAES可能为黄褐斑的治疗提供一种新的方法，3 讨 论醇质体能促进药物透皮吸收的原因主要分为两个方面14.第一是“乙醇效应”,即乙醇与皮肤角质表9 体外透皮试验结果(gcm,n=6)24h累积24h后角质层24h后深层皮肤样品渗透量药物量滞留药物量对照组6.07 3.9342.78 18.1618.36 6.19TAES30.26 30.85*21.81 3.83*37.90 15.33*注：与对照组比较，P0.05，*P 0.0 1。层、醇质体的脂质双层之间的相互作用引起的协同效应。醇质体穿透皮肤，乙醇与脂质极性区域的相互作用增加了脂质流动性，扰乱了角质层脂质的有序构象，并提供了醇质体柔软的特性，使它们能够穿透更深层的皮肤。第二是“醇质体效应”，角质层中磷脂与醇质体之间的融合可增强药物递送。优化后的TAES能有效促进药物经皮渗透，并增加药物在深层皮肤的滞留量，这对黄褐斑的治疗可能具有积极意义。参考文献1 中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组.黄褐斑的临床诊断和疗效标准(2 0 0 3年修订稿)J中华皮肤科杂志，2 0 0 4，37(7)：440.2GRIMES PE.Melasma.Etiologic and therapeutic con-siderationsJ.Arch Dermatol,1995,131(12):1453-7.3MAHAJAN VK,PATIL A,BLICHARZ L,et al.Medi-cal therapies for melasmaJ.J Cosmet Dermatol,2022,21(9):3707-28.4 TRIVEDI MK,YANG FC,CHO BK.A review of laserand light therapy in melasmaJ.Int J Womens Derma-tol,2017,3(1):11-20.5 RAMIREZ RJ,SPINELLA PC,BOCHICCHIOGV.Tranexamic acid update in trauma J.Crit Care Clin,2017,33(1):85-99.6KIM KM,LIM HW.The uses of tranexamic acid indermatology:a review J.Int J Dermatol,2023,62(5):589-98.7LINDGREN AL,AUSTIN AH,WELSH KM.The useof tranexamic acid to prevent and treat post-inflamma-tory hyperpigmentation J.J Drugs Dermatol,2021,20(3):344-5.8TARAZ M,NIKNAM S,EHSANI 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was 0.615%,and the dosage of ethanol was 19.366%.Themean particle size of the prepared TAES was(194.3 4.1)nm,the Zeta potential was(-32.2 2.6)mV,and the encapsulation efficiency was(17.20%0.89%).The results of in vitro permeation test showed thatthe TAES not only increased the permeation penetration of the drug(4.98 times),but also increased thedeep skin retention(1.74 times),as compared to tranexamic acid aqueous solution.Conclusion:The pre-pared TAES can improve the percutaneous penetration and deep skin retention of tranexamic acid,whichis expected to be a new vehicle for melasma treatment.KEYWORDSTranexamic acid;Ethosomes;Box-Behnken design-response surface method;In vitro per-meation test