流式细胞仪操作规程-SOP.doc

流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测3：HLA-B27测定4：CD55CD59测定5：干细胞检测和绝对计数6：白血病免疫分型测定7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-/IL-4测定8：细胞周期分析9：活化血小板检测10：血小板抗体测定11：红细胞抗体测定12：粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪) 医院检查科操作规程文献号：200 年 月 日起实行第1版(共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文献分发部门和或个人 院档案室保管者： 检查科 主任： 检查科 实验室： 淋巴细胞亚群测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，通过溶血、洗涤（和固定）等环节后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；克制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，运用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。标本采集与解决 受检者的准备 检核对象生活饮食处在平常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 规定 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内解决，冷冻或溶血的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0109/L之间。若10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 28 (CD45/4/8/3 No.6607013 CD45/56/19/3 No.6607073 CD4/8/3 No.IM1650 同型对照IgG1/IgG1/IgG1 No.IM1672 CD3/19 No.IM1293 CD3/16+56 No.IM2076 CD19-PC5 No.IM2643Flow-Count荧光微球 No.7547053) 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C No.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温 4：清洗液(No.8546930) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照规定，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）6)需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，并且加完即上机) 报告结果 报告百分数（和绝对值）操作性能 精密度 批内五次反复CV10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 28 (CD3/HLA-DR No.IM1295 CD25-PC5 No.IM2646 CD3-FITC No.IM1281 CD45RA-PE No.IM1834 CD45RO-PE No.IM1307 CD4-PC5 No.IM2636 ） 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C No.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温 4：清洗液(No.8546930) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照规定，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次反复CV5-10%提醒排斥、连续增长提醒应作病理活检；CD3+/HLA-DR+增长5-10%但不伴CD25增长提醒MCV感染。2.正常机体内各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持一定比例，假如它们之间比例失调就会引起免疫功能紊乱，将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的发生，检测淋巴细胞各种亚群有助于疾病的诊断、预后和治疗。CD45RA、CD45RO均为T细胞的辅助分子，CD45RA+纯真型T细胞当免疫力下降时减少；CD45RO+记忆型T细胞对第二次抗原刺激极其敏感，通常在急性感染疾病中增长，在慢性感染疾病中减少。方案（Protocol）同淋巴细胞亚群检测结果（Result）HLA-B27测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/ HLA-B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，通过溶血、洗涤（和固定）等环节后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的比例。 标本采集与解决 受检者的准备 检核对象生活饮食处在平常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 规定 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内解决，冷冻的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0109/L之间。若10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核 细胞。 4溶血样本不能用。试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 (HLA-B27/HLA-B7 No.IM1502 同型对照IgG1IgG2a No.IM1389) 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；天天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照规定，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITCIgG1-PE)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)洗、离心、上机测样（备注： 测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果 报告阴阳性操作性能 精密度 批内五次反复CV90%。 临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，特别是强直性脊柱炎。HLA-B27基因属于型MHC基因，所有有核细胞上均有表达，特别是淋巴细胞表面含量丰富，人们发现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性，超过90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表达阳性，而正常人群中仅5-10%的认为阳性。由于强直性脊柱炎症状与许多疾病相类似，临床上难以确诊，因此HLA-B27检测在疾病的诊断中具有重要意义，HLA-B27的检测是该疾病诊断和鉴别诊断中的一个重要指标。方案（Protocol）1.选参数点击点击 键入文献名，点击Save2.画图 结果1. positive (+) X-Mean=17.12. negative(-) X-Mean=1.2 X-Mean=5.8CD55/CD59测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双色直接免疫荧光法。近年的研究表白，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺少表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。 标本采集与解决 受检者的准备 检核对象生活饮食处在平常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 规定 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内解决，冷冻的标本不能用。 3溶血样本不能用。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 (CD59-FITC No.IM3457 CD55-PE No.IM2726) 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；天天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备:(一)白细胞CD55CD59检测1准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品100ul。2溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）3离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。4洗涤离心 5上机测样(二)红细胞CD55CD59检测 1准备2支流式细胞仪专用管，分别标记 2分别加入CD55CD59 10ul和相应的同型对照10ul。 3向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。 4洗涤离心。5混匀、上机测样。 报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次反复CV97% CD5997% PNH的临界值：RBC CD5995% WBC CD5990% PNH的诊断值：RBC CD5991% 大部分80% 中性粒细胞CD5984% 临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。方案（Protocol）(同HLA-B27) 结果1.RBC: normal 2.RBC: abnormal 3.WBC干细胞检测和绝对计数方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与干细胞膜上相应的抗原结合，通过溶血、洗涤（和固定）等环节后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。标本采集与解决 受检者的准备 检核对象生活饮食处在平常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 规定 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内解决，冷冻或溶血的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0109/L之间。若10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 28 (CD34 No. IM1871 CD45-PC5 No.IM2653/IM2652Flow-Count荧光微球 No.7547053) 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C No.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温 4：清洗液(No.8546930) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照规定，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)需要做绝对计数时，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，并且加完即上机)6)上机测样报告结果 报告百分数（和绝对值）操作性能 精密度 批内五次反复CV10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 28 (CD34 No. IM1871 CD45-PC5 No.IM2653/IM2652Flow-Count荧光微球 No.7547053) 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C No.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温 4：清洗液(No.8546930) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作-样本制备： 细胞膜表面抗原1一方面准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。2一方面每管中加入5ul CD45-PC5抗体。3然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)4各管中加入标本(骨髓或外周血)30100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光2030分钟。5溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）细胞浆和核抗原1准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。2一方面每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。3每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。4各管中加入PBS4ml。5300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min)6各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。 7加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。8各管中加入4mlPBS，振荡混匀。9300g离心5分钟后，弃去上清液。10各管中加入PBS500ul，振荡混匀。11上机测样报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次反复CV2 参考值 CD34+5% MPO+5% 粒系20% 淋系10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核 细胞。 4溶血样本不能用。试剂 淋巴细胞培养体系(自配) 成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 选白美国SIGMA公司。 单克隆抗体 ( BeckmanCoulter公司) CD4-PC5(No.IM2636)、IL-4-PE(No.IM2719)、IFN-FITC(No.IM2716)。 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；天天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 细胞培养与染色 取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5C02 37孵育18小时，取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞提成两管，其一为测定管加入lOul抗人IL-4-PE和IFN-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。流式细胞仪测定 打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-FITC的表达。 淋巴细胞在FSSSC散点图中位置，即A门内细胞； A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞； B门内TH细胞亚群分布： 1区数值-Th 1细胞 (%) 4区数值-Th 2细胞 (%) 2区数值-Th 0细胞 (%)报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次反复CV2 正常参考值 Thl(IFN-)：17.395.52% Th2(IL-4)：1.500.44% ThO ：0.510.26% 临床意义淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl细胞重要分泌IL-2，IL-12，IFN-和TNF-ba等，Th2细胞重要分泌IL-4IL-5IL-6，IFN-为Thl最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。Thl为IFN-+，Th2为IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅具有很少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的IFN-和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中Th0即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-和IL-4也较多。本实验的检测事实上是检测Th细胞对刺激素刺激的反映能力。方案（Protocol） 细胞周期分析方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 运用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等) 与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量标本采集与解决 检测对象 实体（肿瘤）组织、灌洗液、石蜡块、培养细