蛋白酶活力的测定.doc

实验三 蛋白酶活力的测定
一、目的
掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。
二、原理
蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。
三、试剂及仪器
1． 福林—酚试剂
称取50g钨酸钠(Na2WO4•2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。
使用时用2倍体积的水稀释。
2． 0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。
3． 0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。
4． 2%酪蛋白溶液
称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。
5． pH7.2磷酸缓冲液
0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O)，用水溶解稀释至1000mL；
0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)，用水溶解稀释至1000mL；
pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。
6． 标准酪氨酸溶液：
准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。
7． 仪器：分光光度计、试管
四、操作步骤
1． 标准曲线绘制
取9支试管，按下表将标准酪氨酸溶液稀释。
编 号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
标准酪氨酸溶液 (mL)[100 mg/mL]
0
1
2
3
4
5
6
7
8
水 (mL)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
稀释酪氨酸溶液浓度 (mg/mL)
0
10
20
30
40
50
60
70
80

在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸mg数，即为K值。

2． 酶液的制备
准确称取酶粉0.5g，用pH7.2磷酸缓冲溶液定容至100mL，置入400C水浴浸取0.5h，用纱布过滤。根据酶活力的高低，再用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释一定倍数(使其测定的吸光度在0.2~0.4范围内为宜，约4-5倍)。
3． 测定
取一支离心管，加入1mL稀释酶液，置入400C水浴中预热3~5min，再加入预热至400C 的2%酪蛋白溶液1mL，准确及时保温10min。立即加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，15min后离心分离或用滤纸过滤。吸取1mL清液，加5mL0.4mol/L碳酸钠溶液，最后加入1mL福林—酚试剂，摇匀，于400C水浴中显色20min。
另取一支离心管为空白管。在空白管中先加入1mL稀释酶液，再加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，再加1mL2% 酪蛋白溶液，15min后离心分离或用滤纸过滤。吸取1mL清液，加5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，最后加入1mL福林—酚试剂，摇匀，于400C水浴中显色20min。
以空白为对照，在680nm波长下测吸光度。
4.　计算
蛋白酶活力单位的定义：1g酶粉，在400C，pH7.2下，每分钟水解酪蛋白为酪氨酸的微克(mg)数。
蛋白酶活力 =

式中： E——试管的吸光度
4——离心管中反应液的总体积，mL
10——反应10min
N——稀释倍数
W——酶粉称取量，g
K为Y=1时X的值 即1.14

结果与分析：
OD680
CK 1 2 3

0 3.85 2.05 3.71

表面上看2号样的数据看似很有可以于是从上面的表格分析，平均的习惯值为 样品标准误差为

根据格拉布斯法则来判断样品2数据是否舍去。『1』
Xp=质疑的数据
=平均值
为置信水平
N为样品数

S为样品标准误差
所以样品2的数据属于正常范围内。即在处理数据的时候不应该将样品2忽略舍去。
于是样品的酶的活力。
样品1酶活力为702.24
样品2酶活力为373.92
样品3酶活力为676.704
平均酶活力为： 584.288
从上述的实验，样品2的波动的原因可以归结为一、有可能是在酶液移液的时候有过多的损失而造成了酶活力很少的偏差 二、 有可能是在处理酶液的时候由于条件的不适而造成酶活力的降低，有可能实验时候温度的波动 三、有可能是分光光度计的操作的失误。

参考文献：[1]《实验设计与数据处理》 李云雁 胡传荣 化学工业出版社 12页

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