HPV操作步骤.doc

HPV操作步骤详细
一、 试剂配制区、样品处理区、核酸扩增区。
步骤
注意事项
同时准备
关紫外灯。
开排气扇。
申请单及其对应的标本编号，相应个数离心管准备。标本震荡30秒/个
阴阳质控管视情况做，若做，加试剂的顺序是先阴最后阳且在放入扩增仪前不做任何处理。
将试剂拿出来解冻、预热，预热一管蒸馏水、杂I、杂II、溶II。这里也可以同时PCR管编号
转移标本液约1ml于1ml的离心管
粘液不要吸取，不要过猛，不接触离心管内圈

离心5分钟，12000转/分

开干式恒温仪
去上清液
倒（准备吸纸）或用移液枪（沿页面慢慢吸下去）

加生理盐水，震荡至均匀
酌情加入该步

离心5分钟，12000转/分

或者这步开干式恒温仪
去上清液
倒（准备吸纸）或用移液枪（沿页面慢慢吸下去）

加入DNA提取液50μl并震荡至均匀
这里注意吸取上珠子

放入干式恒温仪100℃10分钟
按R/S键调节时间，必须要100℃才能放入并计时
这里可以配杂I、杂II、溶II。溶II放室温，杂I、杂II预热
离心5分钟，12000转/分

PCR管编号
吸取5μl上清液至PCR管
不可破蜡，也不可离口太近

顺势离心
转速达到6000转/分即可

将PCR管放入PCR扩增仪扩增约2小时20分钟
注意检查程序，选择程序（共两个程序）该区与产品分析区的门最好别打开
程序二开始的时候或之前（若标本量大）准备相应的10ml的离心管（加≥4ml杂I，杂I继续预热）和膜条，两者都要编号
冰水混合盒转移PCR管
当程序二运行结束的时候，必须（切记很关键）马上转移PCR管

二、 产物分析区。
步骤
注意事项
同时准备
转移PCR管里的液体50μl至10ml离心管
争取一次性吸取成功
PCR管在冰水混合盒一般放置2分钟以上再转移，从蜡中心突破
用无水乙醇将枪头擦拭
水浴恒温摇床杂交1小时
一定要盖好盖子并且尽量固定，同时控制好时间
是否固定可以摇荡看看
膜条取出置于蒸馏水管漂洗同时弃10ml离心管
结合液配好后，便可以将膜条从蒸馏水管里取出放入结合液中。结合液、洗脱液、显色液要现配
配结合液，以5条膜条为基数：15ml杂I+40μl溶I。即每条膜条为：3ml杂I+8μl溶I。
结合管里水浴恒温摇床10分钟
洗净蒸馏水管，再配一管蒸馏水放于水浴恒温摇床预热
洗脱液配≥20ml杂II
将膜条从结合管转移至洗脱管置水浴恒温摇床10分钟
洗净结合管

倒掉杂II，加入溶II
这里不用将膜条取出，直接水浴恒温摇床，摇到显色液配好即可
配置显色液。每条膜条：
3ml溶II+0.3ml溶III+1.5μl溶IV。溶III最后加，最关键
倒掉溶II，将膜条转移至显色管，显色5分钟
洗净洗脱管
若是前面忘了配一管蒸馏水，这里可以配，但是要放在水里预热
膜条从显色管里取出放入蒸馏水管稍微漂洗（约1~2分钟）
显色液先不要倒掉，看显色效果如何，若可以便可以倒掉，洗净显色管

将膜条取出放在A4纸上肉眼读取结果并发报告单
洗净显色管和蒸馏水管

用无水乙醇擦拭枪头、仪器和桌面。
关排气扇。
开紫外灯。