从纯化到星辰&生命之初.doc

. 从纯化到星辰-CSH蛋白质纯化课侧记Royluo本文献给YL 引子 2000年5月6日，我一个人在合肥三孝口书店闲诳,希望买点参考书带出国去。我注意到有一本翻译过来的书，书名叫做蛋白质纯化与鉴定实验指南。这本书很奇怪，里面列出了很多具体实验的步骤和解释。我很快意识到，这本书实际上是冷泉港实验室开设的一门蛋白质纯化与鉴定实验课的教材。这本书深深的吸引了我，因为里面记录的实验十分经典，涵盖了蛋白质纯化中可能用到的大部分手段，并且对实验细节有十分详尽的解释。我对这本书爱不释手，于是就买了下来,而且当时就动了上这门课的念头。这是一个很模糊的想法，没有想到的是，五年以后这个想法竟然实现了。 这一系列文章是我对这次上课经历的全面总结，一部分是八卦，一部分是流水账般的记叙，还有一些是从这课程学到的tricks,最后也掺杂着自己过去做蛋白质纯化的心得。想到哪说到哪，文字挺松散的，见笑了。 我来解释一下标题。课程结束之后，每一个学员都有一份证书，印着PerPuraAdAstra几个大字。这是拉丁语，直译就是“从纯化到星辰”。原始的谚语是,PerAsperaAdAstra,意思是throughsufferingtorenown。所以“从纯化到星辰”实际的意思是，做好蛋白质纯化，以后就容易出人头地。呵呵。（二）同学和老师 冷泉港的蛋白质纯化与鉴定培训班历史相当悠久，从1989年开始每年都开课，到今年是第十六次。每年都是四月初开始，持续两个星期。值得一提的是，冷泉港有相当多的培训班和会议，是一个科学家交流和学习的中心。这是冷泉港享有盛名的最主要原因。 2004年底,我下定决心上这门课，于是递交了申请。二月份的时候的到消息，我被录取了，并且还有1000刀的tuitionwaiver。可我还是高兴不起来，因为还得解决1600刀(学费一共2600刀)。老板人很nice,但是他实在没钱了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解决了，去年的退税就这样全搭进去了,欲哭无泪啊。 四月五号下午我赶到冷泉港，办完登记手续后被告知晚上七点全体开会，与教员和同学见面。老师一共有四个，每人负责一个模块的实验，持续三天时间,每个老师都有一两个助手帮忙。学生则一共有16个，分成四组，轮转式的做完四个模块。我这一组其他三个人是:来自coloradoBoulder的chad,做有丝分裂的;来自Princeton的Adam,做海洋生物学的。Chad和Adam都是博士后。第三个是来自丹麦的Charlotte，是个博士生，做植物的。 现在开始八卦一下几个老师，_ 总负责人是来自wisconsin-madison的RichardBurgess教授,这老头很有意思，带这个培训班已经带了十二年了，到现在还是乐此不疲。他六十年代是watson的博士后，watson似乎跟他关系很好，每年纯化课的时候，watson都会跑到培训班的实验室找Burgess聊天，同时拉他去吃饭什么的。后来的有一天，我还真的看到了watson去找他聊天。不过令人惊讶的是，watson此人相当精神，走路象年轻人。watson此人口碑很不好，很自大。连Burgess教授一次和我们吃饭的时候都承认，watson有时候口无遮拦，让他都觉得很难堪。但是Burgess又承认watson对他自己的学生很支持，很提拔，这几年又尽心尽力为冷泉港筹 款，贡献巨大。 第二位教员是来自UCLA的AlbertCourey教授。这位教授人很nice也很幽默，四位老师中我对他印象 最好。申请这个课前，我先跟他发过e-mail询问这个课的情况，而他也鼓励我申请。这老哥研究果蝇的,但是他却负责教一组纯化转录因子的实验。我一开始不太理解，后来问他的学术经历，才明白是怎么回事。原来这老哥博士是做生化，博后跟的是robertTjian（钱泽南），还是做生化，研究转录因子。后来做了faculty之后，决定用果蝇做模型来研究转录因子。他那时侯不懂果蝇的遗传学，完全靠自学和到处问人。我知道后觉得特佩服，真正的科学家不应该被自己过去所受的训练束缚死了，应该是根据研究的需要随时准备学习新东西。这老哥虽然不是最年轻的，但是却很能跟上年轻人的潮流，比如他说他有一个ipodmini,还在网上itunes商店买过歌。我还跟他就ipod聊了一阵子，因为我也有个ipod。 第三位教员是来自TexasMDandersoncancercenter的sue-hwalin教授。她是一个身材瘦小的中年妇女，台湾人，特搞笑，非常喜欢给我们讲她博士后老板的笑话。一个笑话是这样的,有一天有一个学生向这个老兄投诉说和实验室另一人有矛盾。这个老兄想了想，然后一本正经的说，和人产生矛盾了，一般有三种选择。第一种呢，就是既然你恨他，那就杀了他好了。那个学生听了之后，差点倒了。这个老兄说看起来你丫没这胆量，那还有第二种选择，就是杀了你自己。那个学生听了几乎要吐血。这老兄一看乐了，然后说你既然没种杀人或者自杀，就剩第三种选择了,就是ignorethatguy!哈。还有另一个笑话，sue-hwalin的 博士后老板虽然当了老板，但是还是喜欢做实验，并且和一个博后共用一个bench。有一天那个博后指着这老兄的鼻子说，XXX呀，你把bench弄得太乱了，赶快给我清理干净了。这老兄听了之后也不怒，而是慢条斯理的辩解说，每个人都有自己喜欢的工作方式，我喜欢乱，你丫管我呢，要是不喜欢，我们可以在bench上画条线划清界线，从此井水不犯河水。哈哈哈。这老美连三八线都出来了。 第四位教授是rutgersuniversity的konstantinSeverinov副教授，这老兄是俄罗斯人，这四位老师中最年轻的一位。此君满头乱发，一脸大胡子，看起来很邋遢，所以一开始我对他印象不佳。后来发现此人相当nice。Konstantin特搞，有一次他做报告，他的电脑的桌面上有一堆乱七八糟的文件夹，其中有一个竟然是divorce!我告诉坐我旁边的一个老美，老美说也注意到了，认为实在是很sad，呵呵。另外，他有两个未成年的儿子，喜欢不断打他手机。结果他常常讲实验讲到一半就得停下来接电话。这个课结束之后，他还跑到冷泉港书店买了一堆虫子毛绒玩具给两个儿子做纪念品。舔犊情深，可见一斑。（三）不溶的sigma32 四月六号早上，我们开始了第一模块的实验，Burgess教授负责。这老兄研究了一辈子E.Coli的RNApolymerase。E.ColiRNApolymerase 核心酶是一个蛋白质复合体，只有合成RNA的活性，却没有识别DNA的能力。Sigma系列因子能够识别启动子,并且与核心酶结合，从而实现转录。我们这个实验 的核心主角就是其中一个因子，叫sigma32。Sigma32可以识别heatshockgenes的启动子。Sigma32过表达在大肠杆菌里面的时候，绝大部分形成了不溶的包涵体(inclusionbody),我们的任务就是要用变性 剂溶解变性不溶的蛋白，然后做重折叠。 所有的buffer几乎都已经配好了，所以直接做就行了。我们先用1%Triton来溶解细菌本身的一些蛋白，inclusionbody相当稳定，不溶于triton,所以这一步，绝大部分垃圾就被去掉了。 下一步就是用变性剂来溶解inclusionbody。用什么好呢？Burgess教授提到了sarkosyl。sarkosyl(N十二烷基肌氨酸钠）是一种比较强的阴离子去垢剂,0.3%的浓度就可以让包涵体溶解。sarkosyl的优点是，虽然在高浓度下有变性作用，低浓度下却对蛋白质有稳定的作用。所以用sarkosyl做重折叠之前的变性剂是再好也不过的了。 Burgess还要我们试了经典的GudnHCl（盐酸胍)来变性，作为对比。inclusionbody在这两种变性剂下很容易就溶解了。然后我们得去掉变性剂，做重折叠。怎么做呢？方法有很多种，最简单的是透析，把变性剂全部换掉。这个方法Burgess并不喜欢，因为，透析是个缓慢的过程。在透析袋里面，蛋白的浓度还是很高。折叠中间产物容易相互接触形成不溶的聚合物。另一种方法是突然稀释变性的蛋白，由于蛋白浓度相对与透析低了很多，好一点。但是问题也是类似的。Burgess提议用逐步滴加稀释的办法。就是放一大烧杯的缓冲液，里面有一个磁石可以不断混合液体，然后一滴一滴加入变性的蛋白溶液。由于烧杯里的溶液蛋白量是逐渐增加的，所以一开始蛋白折叠中间产物能够相互作用的几率大大降低了。Burgess说的还真象那么回事，可事实上，嘿嘿。我们先用试着重折叠GudnHCl溶解的Sigma32。一开始还好，滴到后来，溶液就变浑浊了，最后几乎成了冲淡了的牛奶那样的东东。Burgess脸色不好看，说不应该这样的。我们一离心，沉淀出来一大堆不溶解的蛋白。剩下的上清跑了一个PorosHQ50阴离子交换柱，拿到的蛋白很少，回收率小于5%。失败啊。 从这里开始，我要岔开一下，讲一些跟这个模块实验没太大关系，但是很有意思的东西。（四）Hydrostaticpressure和跑小柱子的trick Dr.Burgess假定我们对蛋白质纯化一无所知，所以讲得很细致。比如他特别提到了disposablecolumn的用法。这种小柱子很简单，把beads倒进去，冲洗一下就可以用来纯化蛋白了，很方便。唯一的问题是，由于是依靠重力跑，速度有时候会十分慢。液体流经柱子速度由hydrostaticpressure(静流体压力）来决定。而hydrostaticpressure又是由实际柱高(即液体经过的长度)来决定。如果你嫌液体流得太慢（尤其是洗柱子的时候），可以在柱子下端出口连一个长的塑胶管子或者针管，这样速 度会快很多。这是很简单的小trick,但我觉得对初做蛋白质纯化的人还是很有帮助的。 我知道一个例子。我原来很喜欢女生A,有一天晚上主动等在她实验室等她做完实验，就开车送她回家。这一等不得了，从晚上七点等到了凌晨一点。这个过程中，她好像没什么事情，但是每隔20分钟，她就会去一次coldroom。作完实验了之后，我好奇的问她，到底是什么试验花了这么长时间，结果她说她在用一个disposablecolumn纯化蛋白，由于beads稍微多了一点，速度很慢，而protocol有一步要求用数百毫升的洗液来冲洗柱子。所以她每隔二十分钟就去加洗液，所以白白花了好几个小时。我听了之后都要ft了,没想到她们实验室竟然没有人告诉她,有简单的办法可以让柱子跑得快一点的。只要在下端出口加一个长管子，她至少可以少等两个小时。 当然最简单的办法还不是这个，最简单的办法的是把盛有洗液的容器放高，然后利用虹吸的原理让液体源源不断的流经柱子。同时，柱子的下端连上塑胶管，弯成一个连通器，这个连通器的高度应该略高于柱面，这样冲洗结束后，柱子就不会干。如果用这种方法，A就不用在实验室待一晚上了，因为一切都是自动完成的。 我现在跟A已经完全没有来往了,但我对她映象还是十分深刻，主要就是因为她那晚跑柱子的经历。话撤远了，现在再回到蛋百质纯化课。（五）万金油buffer Dr.Burgess这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。比如，他得意说他是全美国最早用coomassieblue染蛋白胶的人。据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章,讲述一种新奇的染料叫考马市亮蓝,比当时流行的染料amidoblack灵敏十倍以上。所以他就写了一封信要了一些，结果效果奇好。我们听得都目瞪口呆。 不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。他告诉我们说，他几十年了，总喜欢用这个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种buffer,可以说到了包治百病的神奇地步。尽管他吹得神乎其神，配方却十分简单。这个buffer叫TGE,就是Tris,glycerol和EDTA。配方是这样的: 50mMTrispH7.9 0.5mMEDTA 50mMNaCl 5%glycerol TrisEDTANaCl这三样都没什么，真正关键的是5%glycerol。有了这个glycerol,很多蛋白，尤其是酶会十分稳定。这个稳定的效果是十分惊人的。Dr.Burgess就此跟我们讲了他的经历。六十年代的时候，他还是个小博士后，在watson实验室里干，主要是纯化细菌RNApolymerase的各个亚基。那时候一个大问题是RNApolymerase纯化出来后十分不稳定,放冰上,过30分钟，活性还会损失一半。Burgess有一次不小心出了错误，把纯化出来的RNApolymerase和glycerol混合了。结果意外发现，RNApolymerase变得十分十分的稳定。稳定到什么程度呢,就是你把这个酶加上50%glycerol，用平信从美国寄十几天到澳洲，活性还有780%！另外Burgess也提到，如果要保存的蛋白有二硫键，加一点DTT，防止蛋白形成非天然的二硫键,也会对蛋白质的稳定有好处。 为了让我们对这个万金油buffer的好处有感性认识,Burgess设计了一个实验让我们做。他之前已经准备好了在大肠杆菌中表达的GFP包涵体(inclusionbody)。我们把包涵体分成两部分，一部分用guanidiniumhydrochloride（盐酸胍）溶解变性，另一部分用sarkosyl(N十二烷基肌氨酸钠）溶解变性。然后把这些溶解的GFP溶液分到一个96孔板上,每个孔10微升，然后加入倍的refoldingbuffer来稀释，稀释了之后，变性的GFP就开始重折叠。我们有一个hampton卖的refolding试剂盒，内有十几种不同配方的refoldingsolution。我们试了所有这些buffer同时还试了TGE,TGE+15%glycerol,TGE+35%glycerol,TGE+45%glycerol,这四种buffer。由于GFP折叠好了才能发荧光，用一个fluorescenceplaterreader，我们可以实时监控折叠的效果。结果让人很吃惊，Hamton卖的这个试剂盒，虽然配方都很fancy,但是一塌糊涂，没有一种溶液能让GFP重折叠的很好。相比之下，TGE的四种溶液都很好，GFP重折叠的效率是hampton kit的几十倍。最强的是TGE+35%glycerol。 另外，不论是用GudnHC变性还是用sarkosyl来变性，TGE+glycerol的重折叠的效果都很好。实验结果出来后，看着我们惊讶的表情，Burgess脸上都笑开花了，呵呵。这个实验我还学到的一个教训是,不能迷信商业化的kit,很多kit吹得很牛，但并不一定真的好用。（六）兴风作浪的乳糖(lactose) 晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是BillStudier的报告。本来这个报告是后来才听到的，但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌钟表达蛋白的，我把这一段提前来说说。Studier这老哥是BrookhavenNationalLaboratory的，一生研究T7噬菌体，也是T7RNApolymeraseinductionsystem(pET系列质粒)的发明者。 T7系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个系统。长话短说，pET系列的质粒都用T7promoter来控制基因的表达。T7promoter只能被T7RNApolymerase识别，而这个咚咚大肠杆菌是没有的。但是有一些溶原菌株,染色体里面已经整合入了由LacUVpromoter和lacoperon控制的T7RNApolymerase基因片断。如果在细菌培养基里面加入IPTG,来诱导T7RNApolymerase的表达，就可以启动目的蛋白的表达。这个系统非常强大，原因 在于T7RNApolymerase工作起来非常有效率，效率高到什么地步呢？就是表达一个蛋白，表达量可以占到大肠杆菌总蛋白量的50%!大家可以想象，这种系统虽然很强大，但是表达量太大，对大肠杆菌有毒性，造成的结果就是大肠杆菌十分排斥表达蛋白的质粒。 这一点我深有体会。我曾经想用细菌表达一个蛋白,而且估计这个蛋白会形成包涵体。妖怪的是，用质粒转化蛋白表达菌株BL21(DE3)怎么也不能转化，铺的板一个菌落也没有。我当时就怀疑是因为表达的蛋白对大肠杆菌有毒性，仅仅是本底的一点表达就足以杀死细菌。我来来回回一共转化了五六次，最后终于找到了唯一的一个菌落。虽然当时我怀疑过本底表达是罪魁祸首，但是我没有仔细想过本底是怎么 来的。这个问题到了billstudier做报告之后，才真相大白。原来我们一般用的LBbroth有三种成分，其中一种是tryptone.Tryptone是caseine的酶解产物，而casein又是milk里提取而来。由于milk有乳糖(lactose)，tryptone里面也有乳糖的污染。Billstudier研究发现即使很微量的lactose也能有效的诱导蛋白表达。原来如此！ 所以要解决我原来的那个问题，用一种不含有乳糖的media做培养板就完事了。有意思的是，细菌有一种很有意思的特点，如果培养基里有足量的glucose，细菌会优先摄取glucose,而不能摄取lactose。Billstudier根据这个特点研究出一种可以自动诱导的培养基。这种培养基含有成比例的glucose和lactose。细菌首先摄取glucose，不摄取lactose,当细菌长到一定密度，耗完glucose之后，就开始摄取lactose,从而开始诱导表达。所以用这种培养基养菌，很省事，接种了第二天收细菌，提蛋白就行了。 最后Billstudier老爷子特别强调的是细菌的供氧。氧气是限制细菌生长最重要的瓶颈,如果有足够氧气在培养基里面,大肠杆菌的密度可以从一般的OD60023翻十倍到2030!要提高培养瓶的供氧，可以用baffledflask。这种flask的瓶底边缘有几处凹陷(类似于可乐塑料瓶底那样的形状)，能有效增加空气培养基的混合。 最后，详细内容可以见下列文献: ProteinExpressionandpurification41:207-234(2005)（七）古怪的CDC6 这里再给大家讲一个在大肠杆菌中表达蛋白质的例子，一个很夸张的例子，但是很有启发性。 BruceStillman是冷泉港的现任主管，是一个绝对的牛人。不但科学做得很好，而且还很爱国。他是澳洲人，在美国待了N年，却从没有加入美国国籍，所以他只是外籍院士。我们的晚间报告有一个是他作的。他主要研究真核生物的DNA复制。这是一个到现在为止都没有完全弄明白的领域。在报告里面，他特别提到了表达纯化CDC6蛋白的经历，我觉得十分有意思。这个蛋白,用他的话说，是apainintheass。 CDC6是干什么的呢？这要从ORC说起。真核生物的DNA有多个复制起始位点 (replicationorigin)，ORC(OriginReplicationComplex)是一个很大的蛋白复合体，可以识别这些复制起始位点。ORC在整个细胞周期里面都是与DNA结合的。在G1期里面，CDC6这个蛋白会与ORC结合，同时让MCM(DNA解旋酶)也装载到ORC上,形成一个prereplicationproteincomplex。这个complex一旦形成，DNA复制的准备工作就完成，只等其他kinase的激活，细胞从G1进入S期，复制就开始。 Stillman实验室一直想表达酵母的CDC6和ORC的重组蛋白，然后做结构研究。但是到了CDC6，他们碰到了大麻烦。首先他们尝试真核系统来表达，但是意外的是，他们发现表达出来的CDC6完全没有活性。然后他们尝试用大肠杆菌来表达。首先发现37度诱导表达出来的蛋白不溶，重折叠也没有用。然后他们尝试在室温下诱导表达，发现蛋白虽然可溶了，但是都被降解了。然后呢，他们就想到了加一个GSTtag,这下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是还是没有活性。他们估计是因为GST可以形成dimer，干扰CDC6的正常功能。所以呢，他们重新做了一个construct,在GST和CDC6序列中间加了一个蛋白酶切割位点。正当他们满心欢喜的以为问题解决了的时候，意外又出现了。有GST的CDC6是可溶的，可是一旦把GST切掉了，CDC就沉淀出来了.#%#&%$#! 几乎是山穷水尽了，但是做这个project的博士后还是没有放弃希望，他做了最后的孤注一掷。他猜到这个蛋白可能很不稳定，对缓冲液要求可能很高，所以他让一个本科生连续试了十多种buffer，最后发现如果用磷酸钾谷氨酸钾缓冲液，切掉GST之后CDC6就不会沉淀了。Stillman认为谷氨酸根和磷酸根跟氯离子相比更接近与核酸,可能让CDC6更稳定。这个CDC6一共花了他们18个月时间,却就这一点小trick! 这以后，他们表达的CDC6都有活性了，后来做了一系列的电镜三维结构重构实验，研究CDC6和ORC的复合体结构。Stillman实验室正在准备一篇文章要投到nature上去。大家等着看把。（八）”液体DEAE“ 绕了这么大一圈，现在再回到第一个模块的实验来。前面提到Dr.Burgess要我们 试GudnHCl溶解sigma32之后的重折叠，结果很糟糕。我们接着试了用sarkosyl做 变性剂的蛋白重折叠。步骤和前一个类似，只是这一次是突然稀释至25倍体积。效果好了很多，至少没有浑浊现象了。接着我们用PorosHS50，一种阳离子交换柱，来把可溶的sigma分离了出来。为什么这一次用PorosHS50而不是前面用的阴离 子交换柱呢？因为sarkosyl带负电，会与阴离子交换柱结合得很好。再加上sigma32 很奇怪，既有负电的表面，又有带正电的表面，所以可以用阳离子交换柱。值得一提的是绝大部分蛋白质都是偏酸性，所以阴离子交换柱用的比阳离子交换柱频繁得多。 好了，聊完离子交换柱，现在回到DrBurgess要我们作的另一个很重要的实验。 Sigma32在大肠杆菌过表达的时候，绝大部分都是inclusionbody,但是也有一部分 是可溶的。这些可溶的sigma32可以和细菌体内的CoreRNApolymerase结合形 成复合体。我们这个实验就是要把这个复合体纯化出来。核心办法是用免疫亲合柱来纯化。但是为了提高纯化的效果，Burgess要我们提前用PEI沉淀的办法来粗分一下。PEI是什么呢？就是polyethyleneimine（聚乙烯亚胺）。这个东东我过去没碰到，所以很感兴趣。PEI呢是一个带正电的polymer，和酸性蛋白质和核酸结合以后聚合体沉淀出来。由于这种结合是受离子强度影响的，感觉上很象DEAE那之类的性质，所以Burgess称之为液体DEAE。RNApolymerase和DNA是结合的，所以PEI沉淀DNA的同时，把RNApolymerase+sigma32都沉淀了下来。然后再用高盐洗脱蛋白质，而DNA和PEI结合很紧密，所以还是在沉淀里面。这样一来，好多垃圾蛋白和核酸都被去掉了。到了这一步，还有一个问题。就是洗脱下来的蛋白里面还有PEI,如果现在就用透析的办法降低盐浓度，PEI和蛋白会重新形成沉淀。所以下一步就是用硫酸胺沉淀的办法把蛋白和PEI分开。用低盐buffer重溶沉淀的蛋白,过免疫亲合柱就行了。免疫亲合柱就没有什么好说的了。最后结果很不错，跑胶后用coomassieblue就可以清楚的看到RNApolymerase的各个亚基。（九）沉淀，沉淀，沉淀 上一部分我匆匆提到了用硫酸氨沉淀来去掉PEI(Polyethyleneimine）的步骤。不常做生化的同学可能对硫酸氨沉淀的方法不熟悉。但其实这种沉淀是蛋白质纯化中及其重要的一种方法。说实话我过去也很少接触，但是在这个课里面，四组实验中有 三个都用到了这个方法，可见其重要性。 硫酸氨沉淀是怎么做的呢？其实很简单，把磨细了的硫酸氨粉末往样品溶液里 倒就行了，蛋白就会相继沉淀下来。由于不同的蛋白，在不同的硫酸氨浓度下被分 别沉淀下来，这种方法把蛋白质样品粗粗的分离一下。这种方法对大量样品尤其好 用，因为比较方便快捷便宜。硫酸氨沉淀的优点是什么呢？最大的优点是这东西虽 然能让蛋白质沉淀下来，但是不会让蛋白质变性，所以沉淀下来的蛋白质一般可以 重新溶解。 其实沉淀蛋白质的方法有很多种，但是对于娇贵的蛋白质来说，很多常用方法 都太harsh了。我举两个例子把：TCA沉淀大家都熟悉的。TCA是个强酸，施放出 来的质子中和了蛋白质的负电荷，只留下正电荷与TCA形成不溶物，从而变性。 丙酮沉淀，通过改变介电常数来降低蛋白质的溶解度，从而沉淀，由于丙酮一类的 有机溶剂可以与蛋白质的疏水表面相互作用，所以沉淀的同时，蛋白质也会变性。 硫酸氨沉淀的机理是什么呢？简而言之就是盐析（saltout）。蛋白质在溶液里 面溶解度和盐浓度有关系。在低盐浓度下，如果增加盐浓度，会增强蛋白质的溶解，这是因为，盐的离子与蛋白质表面的正负电荷配对，减少了蛋白质电荷表面相互作用的机会。当盐浓度高到一定程度的时候，过多的盐会跟蛋白质疏水表面争夺水分子，以至于蛋白质疏水表面倾向于相互作用形成聚合物沉淀下来。 硫酸氨如果运用的好可以帮很大的忙。Dr.Burgess讲过一个例子。他有一年去 一个公司做sabbatical。这个公司是做单抗的，有一个工序是要从ascitesfluids里 头把抗体给纯化出来。这个公司用硫酸氨沉淀的方法来粗分蛋白。Burgess很惊讶的发现，这个公司竟然没有做仔细的分析，就随便用了一个很高的硫酸氨浓度，结果把抗体和serumalbumin一起沉淀了。但是其实可以用一个低一点的浓度，只把serumalbumin沉淀下来，从而把抗体和serumalbumin分开。Serumalbumin浓度是非常高的了，这样一分，大大提高了后续纯化步骤的效率。 Dr.Burgess强调说，用什么浓度把什么蛋白沉淀下来，完全是经验性的，而且每 次都不一定能重复的。因为是否能沉淀下来跟蛋白质浓度有关系，而每次样品内目标蛋白的浓度不一定一样。有一个很简单的方法可以用来估计蛋白质沉淀所需硫酸氨的浓度。把样品分成五份，每份分别加硫酸氨至20%,30%,40%,50%,60%,离心去掉沉淀，保留上清，再向上清里面添加硫酸氨使浓度从20%到30%,30%到40%,40%到50%,50%到60%,60%到70%，离心保留沉淀，然后分析沉淀里的蛋白,看看目标蛋白到底在 哪里，就完事了。（十）永远的转录因子 第一个模块的实验结束以后，我们进入第二个模块的实验。这个实验的指导教授叫AlCourey。这个模块的实验主要是要从Hela细胞里纯化AP-1。AP1是一种很重要的sequencespecific转录因子，在很多生理过程里都有作用。AP-1其实不是一种均一的蛋白质，实际上一种二聚体结构，要么 是Jun-Jun或者是JunFosdimer。Jun和Fos都是alphahelix的结构。Helix的一边有很多Leu,和另一个helix形成LeucineZipper的结构，而helix另一边就是碱性的氨基酸居多，所以可以和DNA 结合。这个转录因子看起来就象一双筷子夹着DNA。 sequencespecific转录因子是极其重要的一类蛋白质，真核生物的基因有510%是用来编码这种蛋白的。这个模块涉及的一些实验是最经典的一些分离转录因子的方法，所以很有用。 怎么才能分离纯化呢？首先要确定要纯化什么因子，换句话说就是要决定纯化跟什么特异DNA序列相结合的转录因子。决定了这个，才能有一个活性检测系统，才能真正开始纯化。另外就是，可以把这种特异序列的DNA固定在柱子上，然后做亲合层析，纯化效率会非常高。 整个纯化过程是这样的：首先制备Hela细胞的核提取物，然后用硫酸氨沉淀的办法粗分一下组分，小分子量蛋白(比如HistoneH1)因为无法沉淀而被去掉。到这里比活力会增加到原来的2倍。然后粗分的产物再跑一下凝胶过滤层析，比活力再提高到初始产物的5到10倍。凝胶过滤的产物再过DNA affinitycolumn,比活力从5-10倍一下子提到了50100倍。到了这一步，AP-1可以占到蛋白量的 1050%。 值得一提的是这个凝胶过滤层析。我们用的是SephacrylS-300HR凝胶(一种聚 丙烯酰胺凝胶)，这种凝胶分辨范围大概是10KDa到几千KDa，但是这种凝胶是比较粗的一种介质，分辨率不能跟superdex之类的比。大概由于不是那么精细，所以可以自己手工装柱，我们用的柱子是Amersham的XK26/40(直径2.6cm,高度40cm）。装好的柱子分辨率真的是很低，AP1的洗脱体积跟空体积(voidvolume）相差挺小，而AP-1只有4050KD已经很小了。这样一来很多蛋白根本没可能和AP-1分开！这也就是为什么这一步纯化倍数很小的原因。这样一来，为什么要自找麻 烦做这又贵又麻烦的一步呢？原因在于这一步可以去掉核提取物里面的核酸酶，所以如果直接跑DNAaffinitycolumn,column上的DNAOligos会被降解掉！另外一个原因是，核提取物有一些可以和DNA非特异结合的蛋白，这些蛋白会饱和DNAaffinitycolumn，影响要转录因子的纯化。 这个纯化步骤说明，不同的纯化手段必须加以精心组合才会有最好的效果。（十一）核抽提物 上回谈到纯化AP-1转录因子的大致流程。其实在过柱子之前的核抽提物的准备 也是十分关键的。从天然产物中纯化蛋白，如果大概知道蛋白在什么细胞器官，把 细胞器先分离出来作为纯化的起始原料，可以省好多事情。因为细胞器官的分离的 方法已经很成熟了。 核抽提物是怎么准备的呢？首先，融解Hela细胞。我们在这个模块用的细胞都不 是自己长的，而是直接从一个公司Biovest买来的。据说这个公司有NIH的补贴， 所以价钱不贵。一升media的Hela细胞才要刀。冻存在-80度的hela泡在有 glycerol的buffer里面，第一件事情就是要用有镁离子的PBS来冲洗几遍。然后用 一种低渗buffer来重悬细胞。这种低渗buffer盐浓度很低，所以由于渗透压的影响， hela细胞膜会变得比较脆弱。这个时候呢，把重悬的细胞用Dounce匀浆器处理一 下,把细胞膜弄破。低渗buffer里头虽然盐浓度很低，但也不是没有盐在里面。主要 有两种成分，一个是10mMKCl,另一个是1.5mMMgCl2。KCl没有什么好说的， 可以换成NaCl。MgCl2就关键多了。镁离子可以稳定细胞核,让细胞核不至于在破 碎细胞的时候就破裂。当然说是这么说，一些转录因子还是可能在匀浆的过程就漏出来。细胞膜破碎之后，细胞核还是基本完整的，细胞质里面ER,Golgi之类的东东都漏出来了。然后再来一个低速离心。细胞核是比较重的，所以一离心，马上就沉淀下来了。而其他细胞质或者细胞膜的成分比较轻一些，还留在上清里面。 现在想起来，细胞器官的分离，几乎无一例外都是利用细胞器比重不一样来分离 的。细胞核是最好分离的了，因为比其他的膜结构重得多。有些细胞器，比如要把Golgi和ER分开，是个十分麻烦的事情，因为比重相差太小了。有些时候，可以用一些古怪的办法来分离。比如lysosome把，比重和线粒体及过氧化酶体很相近。一种办法就是往一堆无辜的耗子注射一种特殊的去垢剂叫TritonWR1339。耗子根本不能分解吸收这种化合物，就积累在肝脏细胞的lysosome里面，使得lysosome比重变轻了一些，这样就可以把lysosome从mitonchondria和peroxysome分出来了。话扯远了，现在再回到AP-1purification。 细胞核虽然被沉淀下来了，但里面还有很多染色质,如果DNA都降解漏出来，麻烦就大了。所以下一步就是用高盐buffer(0.42MKCl)来破碎细胞核。核膜，染色质之类的垃圾不能溶解，转录因子之类的蛋白却能溶解。再一离心，取上清就行了。我们要的转炉因子就在这里面。按理说，到这一步就可以上柱子了，但是这种上清溶液里面还有不少histoneH1，可以抑制体外转录反应。为了祛除hisone,我们又做了一步硫酸氨沉淀，histone由于太小，沉淀不下来，而转录因子什么的都可以被沉淀下来。沉淀重悬一下就可以跑SephacrylS-300的柱子了。（十二）Gelfiltration的先天缺陷 上一篇讲到核提取物。实验的下一步就是跑SephacrylS-300column。 这一步实验是整个课程中第一次跑凝胶过滤色谱(gelfiltrationchromatography)， 我感觉还是很激动的。Gelfiltration是色谱中及其重要的一个种类。我先来谈谈 原理把。Gelfiltration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。这些微珠呢，并不是 实心的，而是有很多孔状结构。当蛋白质样品经过这些微珠的时候，如果蛋白质分 子体积太大，不能通过微珠的孔状结构，就会绕过微珠，很快的被洗脱下来。如果 蛋白质分子体积不是那么大，可以通过微珠的孔状结构，就会迟一些被洗脱下来。 这样，蛋白质分子可以根据大小而被gelfiltrationcolumn分开。 Gelfiltration和其他色谱方法一个显著的不同是：Gelfiltration并不依赖 蛋白质分子与柱材料的结合来分离蛋白。这个特点的一个好处是，所有的蛋白样品 最后都能被洗脱下来，柱子重复用也不会有什么问题。但是这个特点也给Gelfiltration带来了一个严重的缺陷：低分辨率。分辨率包括两个因素，一个是两个蛋白峰的距离，另一个是，蛋白峰的宽度。由于蛋白在gelfiltrationcolumn里面并不与柱材料相互结合，所以很容易扩散(diffusion)，扩散的结果就是蛋白峰非常宽。这个宽度非常要命，很多时候即使用了很好的柱子，蛋白顶峰也大致能分开,但是由于蛋白峰太宽，重叠在一起，这样就很难分干净。另外，两个不同大小蛋白的洗脱体积的差别与分子量差别的对数呈线性关系，所以可以想见，如果分子量相近（比如只差两三倍）的话，洗脱位置也会相近，Gelfiltration是很难把两个蛋白完全分开的。 说一件我的糗事。