水稻转基因实验方法与步骤.doc

水稻转基因
一、实验目的
1.学习水稻组织培养的方法
2.学习水稻转基因的方法
二、实验原理

目的基因克隆到双元载体中，双元载体转入农杆菌，然后携带双元载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织，通过T-DNA插入，把我们的目的基因整合到水稻染色体上。
历史：农杆菌感染受伤的植物产生冠瘿瘤病，发现是由Ti质粒引起，同时做杂交，发现只有T-DNA（transferred DNA）这一部分被整合到植物染色体上了。
三、试验步骤：
一、水稻愈伤组织的诱导
（一） 以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织
1． 消毒：
取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：
1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；
2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）
3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；
4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
2． 诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）
1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；
2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天；
3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。
（二） 以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织
1． 消毒：
取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：
1） 将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒2分钟；
2）倒去酒精，加入100ml 20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30分钟；
3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）
1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；
2） 操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周；
3） 在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）

一、 农杆菌培养
挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100µl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。
二、 共培养和抗性愈伤组织的选择
1．感菌与共培养：
1） 取培养好的菌液500µl于1.5ml离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01；
2） 将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟；
3） 将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；
4） 将愈伤组织置于共培养基上。25℃暗培养2.5天。
2． 选择：
1） 将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）的无菌水清洗1~2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2小时；
2） 将晾干的愈伤转入含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）和50mg/l潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，光照培养14天；
3） 将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）和50mg/l潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。
三、 抗性愈伤组织的预分化（可选）
将新长出的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，25℃，光照培养7天。
四、 抗性愈伤组织的诱导分化和生根
挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中（每皿或每瓶放置5-7颗），用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗（15-30天）。待苗长至1cm左右，放入生根培养基中壮苗
注： 以上一至五的操作步骤皆在无菌条件下进行。
五、 转基因苗的锻炼和移栽
转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月左右。将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。

四、注意事项
1. 超净台在用之前要紫外灭菌半个小事，使用前用酒精喷壶喷洒酒精，再用棉球擦干净台面
2. 水稻转基因对无菌操作要求非常严格，所有物品包括手进入超净台时都要用70％酒精擦拭
3.使用的镊子，使用之前要先灭菌（湿热或者酒精灯烧灭）
4.超净台内一直有酒精灯，在喷洒酒精时一定要注意安全，不要烧伤自己或他人。