水稻转基因实验方法与步骤.doc

水稻转基因一、实验目的 1.学习水稻组织培养的方法2.学习水稻转基因的方法二、实验原理 目的基因克隆到双元载体中，双元载体转入农杆菌，然后携带双元载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织，通过T-DNA插入，把我们的目的基因整合到水稻染色体上。历史：农杆菌感染受伤的植物产生冠瘿瘤病，发现是由Ti质粒引起，同时做杂交，发现只有T-DNA（transferred DNA）这一部分被整合到植物染色体上了。三、试验步骤：一、水稻愈伤组织的诱导（一） 以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织1 消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。2 诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28）培养5天；3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28）培养3天。（二） 以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织1 消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1） 将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒2分钟；2）倒去酒精，加入100ml 20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。 2诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿1214颗；2） 操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28光照培养箱，培养3周；3） 在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28光照培养箱，继代培养1周。（如不马上用，需转移至暗处，于22继续培养1周）一、 农杆菌培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100l于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。二、 共培养和抗性愈伤组织的选择1感菌与共培养：1） 取培养好的菌液500l于1.5ml离心管中，4，4000rmp，离心2min，去上清。用含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01；2） 将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟；3） 将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；4） 将愈伤组织置于共培养基上。25暗培养2.5天。2 选择：1） 将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）的无菌水清洗12遍。最后置于无菌滤纸上沥干2小时；2） 将晾干的愈伤转入含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）和50mg/l潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28，光照培养14天；3） 将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）和50mg/l潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。三、 抗性愈伤组织的预分化（可选）将新长出的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，25，光照培养7天。四、 抗性愈伤组织的诱导分化和生根挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中（每皿或每瓶放置5-7颗），用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗（15-30天）。待苗长至1cm左右，放入生根培养基中壮苗 注： 以上一至五的操作步骤皆在无菌条件下进行。五、 转基因苗的锻炼和移栽转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月左右。将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。四、注意事项 1. 超净台在用之前要紫外灭菌半个小事，使用前用酒精喷壶喷洒酒精，再用棉球擦干净台面2. 水稻转基因对无菌操作要求非常严格，所有物品包括手进入超净台时都要用70酒精擦拭3.使用的镊子，使用之前要先灭菌（湿热或者酒精灯烧灭）4.超净台内一直有酒精灯，在喷洒酒精时一定要注意安全，不要烧伤自己或他人。