新版GMP培养基适用性检查验证方案.doc

培养基合用性检查
验证方案

文献编号：VMP-VV-501-00

起 草 人：
审 核 人：
批 准 人：
批准日期： 年 月 日

验证立项申请表
申请部门
质量部
申请日期
年 月 日
验证对象
培养基
规定完毕日期
年 月 日
验证因素
微生物验证
验证类别
微生物验证
为了确认所采用细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查的培养基是否符合微生物限度检查法的规定规定，以保证检查结果的准确、可靠及检查方法的完整性。

申请部门负责人署名： 日期：
质量部意见

署名： 日期：
验证方案编号
VMP-VV-501-00
验证报告编号
VMP-VV-501REP-00
负责人意见

署名： 日期：
验证小组成员
部门
姓名
职务

备注：

验证方案审批表
审批
程序
部门
负责人署名
日期
备注
起草

审核

批准
负责人

备注

1.概述
通过验证以确认所采用的培养基适合于细菌、霉菌及酵母菌的测定及控制菌的检查，根据特性制订检查方法和检查条件，按制定的方法进行实验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检查方法和检查条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
2.验证目的及范围
为了确认所采用细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查的培养基是否符合微生物限度检查法的规定规定，以保证检查结果的准确、可靠及检查方法的完整性。
3.验证风险评估
对于本次验证的执行进行了如下的风险分析：
严重限度
S
也许性
P
可检测
D
风险优先级 RPN = S×P×D
1
低
1
低
1
高
RPN≤7
低
可以接受，无需采用措施
2
中
2
中
2
中
16≥RPN≥8
中
一定限度上接受，但应按风险优先级
采用措施尽也许减少
3
高
3
高
3
低
RPN＞16或严重限度＝4
高
不能接受，尽快采用措施减少
4
关键
4
极高
4
极低
环节/单元
危害
S
也许因素/
程序失败
P
现行控制
D
R
P
N
需采用措施
S
P
D
R
P
N
培训
验证部分项目出现偏差或漂移
3
方案培训不到位，方案的执行者不熟悉方案内容
2
严格执行经批准的验证报告进行培训，并考核合格
3
18
确认按照批准的方案培训，培训者均纯熟掌握所培训内容。
1
1
2
2
检查过程操作不妥
未达成设定标准，验证失败。
3
未遵循培养基合用性检查检查操作规程，未严格遵循方案规定方法。
2
制定培养基合用性检查检查操作规程，并对规程及设立的验证方法培训，按规程及方案规定进行操作。
3
18
确认培养基合用性检查检查操作规程已制定并批准，确认人员已培训；确认操作规程合用性。
1
1
2
2
4.验证前准备
4.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实行前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。
4.2将所有的平皿和稀释剂都应当严格按照相关的灭菌程序消毒，以保证其对实验的结果没有影响。
4.3仪器与器具：恒温培养箱、生化培养箱、高压蒸汽灭菌器、净化工作台、无菌培养皿、无菌移液管。
5.验证内容
5.1测试环境条件规定
所有检查在环境洁净度C级下的局部A级洁净度的单向流空气区域内隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。
5.2计数培养基
5.2.1验证用菌种及培养基：
5.2.1.1来源： 食品药品检查所
5.2.1.2菌落计数用菌种
菌种名称
内控编号
大肠埃希菌(Escherichia coli) [CMCC（B）44 102]
E-
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC（B）26 003]
S-
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC（B）63 501]
B-
白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC (F) 98 001 ]
C-
黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98 003]
A-
注：编号由菌种首字母-传代代数-配制日期组成。
5.2.2培养基及其制备方法：取市售的脱水培养基，分别按照规定方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌，在实验前加温熔化备用。
培养基名称
培养基批号
配制日期
有效期至
营养琼脂培养基

玫瑰红钠琼脂培养基

营养琼脂对照培养基

玫瑰红钠琼脂对照培养基

5.2.3菌液制备
5.2.3.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml，加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。
5.2.3.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，取此培养液1ml，加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。
5.2.3.3接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天的用3～5ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤丝的无菌毛细吸管）至无菌试管中，取1ml加含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6,制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液备用。
5.2.4验证方法：
5.2.4.1实验组：取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml，分别注入无菌平皿中，立刻倾注营养琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数、观测菌落情况；取白色念珠菌、黑曲霉各1ml，分别注入无菌平皿中，立刻倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数、观测菌落情况。测定结果见附件2。
5.2.4.2对照组：取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml，分别注入无菌平皿中，立刻倾注营养琼脂对照培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数、观测菌落情况；取白色念珠菌、黑曲霉各1ml，分别注入无菌平皿中，立刻倾注玫瑰红钠琼脂对照培养基，每株实验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数、观测菌落情况。测定结果见附件2。
5.2.4.3菌回收率计算：
;Jt*实验组的菌回收率（%）=   （实验组平均菌落数/ 对照组平均菌落数）×100% `h
12  
5.2.5鉴定标准：菌回收率均应不低于70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。
5.2.6结论：对计数培养基合用性检查的验证结果进行评价和总结。
5.3控制菌培养基合用性检查：
5.3.1验证用菌种：
5.3.1.1来源： 食品药品检查所
5.3.1.2验证用菌种
菌种名称
内控编号
大肠埃希菌(Escherichia coli) [CMCC（B）44 102]
E-
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC（B）26 003]
S-
5.3.1.3培养基及其制备方法：取市售的脱水培养基，分别按照规定的方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌。在实验前加温熔化备用。
培养基名称
培养基批号
配制日期
有效期至
胆盐乳糖培养基

MUG培养基

乳糖胆盐发酵培养基

胆盐乳糖对照培养基

MUG对照培养基

乳糖胆盐发酵对照培养基

5.3.2菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，使细菌数约为500～1000cfu/ml。
5.3.3验证方法：
5.3.3.1促生长能力培养基：取大肠埃希菌各0.1ml，分别涂布于胆盐乳糖培养基、MUG培养基和乳糖胆盐发酵培养基及其对照培养基上，在30～35℃培养18小时，观测菌落情况。测定结果见附件3。
5.3.3.2克制能力培养基：取金黄色葡萄球菌各0.2ml，分别涂布于胆盐乳糖培养基和乳糖胆盐发酵培养基及其对照培养基上，在30～35℃培养18小时，观测菌落情况。测定结果见附件3。
5.3.3.3指示能力培养基：取大肠埃希菌各0.2ml，分别涂布于乳糖胆盐发酵培养基及其对照培养基上，在30～35℃培养18小时，观测菌落情况。测定结果见附件3。
5.3.4鉴定标准：
5.3.4.1促生长能力培养基：实验培养基与对照培养基生长的菌落大小、形态特性应一致。
5.3.4.2克制能力培养基：实验菌均不得生长。
5.3.4.3指示能力培养基：实验培养基与对照培养基生长的菌落大小、形态特性、指示剂反映情况等应一致。
5.3.5结论：对控制菌培养基合用性检查的验证结果进行评价和总结。
6. 变更和偏差解决：
验证过程中假如出现偏差和变更，应立即告知验小组对偏差和变更进行具体记录，分析偏差产生的主线因素并提出解决方法。所有偏差和变更得到有效解决后，验证方可进入下一环节。偏差解决单和变更单通过批准后其原件必须附在验证报告中。见附件4。
7. 验证结果评估及结论：
质量部负责收集各项验证实验结果，起草验证报告，报验证委员会。
验证委员会负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书，确认培养基合用性检查情况。见附件5。
8.拟定再验证周期：
验证小组根据验证情况，拟定再验证周期，报验证领导小组审批。
9.会审及批准
会 审：

批 准：附件1
培训人员登记表
部 门
培训人员署名
签到日期

培训师署名

日 期

附件2
营养琼脂计数培养基

结果
实验菌
营养琼脂
营养琼脂对照
回收率
菌落观测情况
菌落数
菌落数
大肠埃希菌
1

1

2

2

平均

平均

金黄色葡萄球菌
1

1

2

2

平均

平均

枯草芽孢杆菌
1

1

2

2

平均

平均

结果
实验菌
玫瑰红钠琼脂
玫瑰红钠琼脂对照
回收率
菌落观测情况
菌落数
菌落数
白色念珠菌
1

1

2

2

平均

平均

黑曲霉
1

1

2

2

平均

平均

验证结果评估

操作人

日期

复核人

日期

附件3
控制菌检查用培养基

项目
结果
促生长能力
克制能力
指示能力
胆盐乳糖培养基

——
胆盐乳糖对照培养基
MUG培养基

——
MUG对照培养基
乳糖胆盐发酵培养基

——

乳糖胆盐发酵对照培养基
验证结果评估

操作人

日期

复核人

日期

附件4
偏差解决与变更记录
验证项目名称

验证项目编号

偏差说明：

也许的因素：

偏差分类：□重大 □小
理由：
采用措施：（如需要另附文献）

结果：（如需要另附文献）

建议（如需要另附文献）
□ 接受偏差
□ 不接受偏差

理由：（如需要另附文献）
批准人： 日期：
附件5

验证证书
★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★
根据《药品生产质量管理规范》（2023年版）规定，对
验证。经本公司有关部门进行验证审查，结果符合验证规定，批准使用。
特发此证。
验证项目名称：
验证方案编码：
验证完毕日期：
有 效 期：

1．培养基合用性检查应在当前验证条件下使用，使用条件发生变更，应报验证领导小组审核，必要时重新验证。
2．培养基合用性检查应按批准的标准检查和验证。

批准人：
年 月 日

备 注：
1．设备（公用系统）、工艺应在当前验证条件下使用，使用条件发生变更，应报验证领导小组审核，必要时重新验证。
2．设备（公用系统）应按批准的标准使用、维护保养程序进行操作、维护和保养。