基于网络药理学和分子对接技...后应激障碍焦虑样行为的机制_张峥嵘.pdf

基于网络药理学和分子对接技术研究安神定志方干预创伤后应激障碍焦虑样行为的机制张峥嵘，高峰，杨绍杰，王训翠，姬曼曼，朱国旗（安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 ）摘要 目的采用网络药理学方法和分子对接技术探讨安神定志方（，）干预创伤后应激障碍（，）的作用机制。方法使用 、等筛选 的有效成分及靶点，借助 和 等数据库收集 靶点；将 成分靶点与 疾病靶点取交集靶点；通过 数据库构建靶点互作网络筛选核心靶点；对交集靶点进行 功能分析和 富集分析，构建“中药成分靶点通路”网络；选取疾病关键靶点与 主要活性成分进行分子对接，并开展动物实验验证。结果 防治 的网络中共有 个活性成分、个交集靶点、个关键靶点、个生物过程、个细胞组分、个分子功能。对 、与 关键活性成分进行分子对接，结果显示具有较好的结合活性。在动物实验中，与正常对照组比较，可明显改善 的焦虑样行为与突触功能，同时增加 蛋白的表达水平。结论 治疗 可能通过调控 信号通路影响突触能传递、钙信号转导、蛋白合成等发挥作用。关键词 安神定志方；创伤后应激障碍；网络药理学；分子对接；机制研究 中图分类号 创伤后应激障碍（，）是指一个人暴露于极端的压力或者经历创伤事件后出现的严重心理创伤。目前对 的治疗仍以心理干预为主，临床治疗远低于预期，故寻找有效治疗 药物仍是巨大挑战。属于情志病，主要由惊恐所致，惊恐扰乱心神而致心气虚，过恐而致肾精不足。安神定志方（，）是 医学心悟 中记载的新安医学名方，由茯苓、茯神、人参、远志、石菖蒲、龙齿组成，有安神定志、益气镇惊之功效。方中茯苓治惊悸、心神不安；茯神安魂魄以养神；人参补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸；远志强志而益智，石菖蒲开心窍以补五脏；龙齿可镇静安神而解心下结气。诸药同用，可使神志安定、心肾皆宁，故曰“安神定志”。安徽中医药大学第一附属医院在 的治疗上积累了丰富的临床经验，运用安神定志丸加减联合草酸艾司西酞普兰片治疗 的效果显著。前期项目组评价了 对 的干预作用，但其药效物质与作用机制尚不清楚。本研究拟运用网络药理学结合分子对接技术和基金项目：国家自然科学基金项目（）；安徽省重点研究与开发计划项目（）；安徽省高等学校自然科学研究重点项目（）作者简介：张峥嵘（），女，硕士，助理研究员通信作者：朱国旗（），男，博士，研究员，博士研究生导师，实验验证，研究 治疗 的活性成分、靶点、通路及生物过程，旨在阐明该方的药效物质及作用机制，为临床运用提供参考。材料与方法 活性成分筛选通过中药系统药理数据库 、数据库平台，以口服生物利用度、药物相似性 作为筛选条件，结合文献挖掘与整理，获得 的潜在活性成分。靶点预测将筛选的有效成分结构导入到 平台，限定物种为 ，预测 活性成分中的潜在蛋白质靶点，选取前 位靶点中 的靶点为有效成分潜在靶点，并建立靶点数据库。治疗 潜在靶点收集应用 、和 数据库以“”为关键词检索 疾病靶点。合并个数据库结果并去除重复后作为 相关靶点。将疾病相关靶点与活性成分作用靶点取交集，将交集靶点视为复方治疗疾病的潜在靶点。网络构建及核心靶点筛选在 数据库中导入潜在靶点，选择 ，物种选择 ，设定最低相互作用阈值为，建立 网络。和 富集分析在 数据库中导入筛选的核心靶点，选择物种为 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 ，并将靶点基因校准为 ，然后进行生物分子功能富集分析和 通路富集分析。“药物成分靶点通络”网络的构建基于对 相关通路的筛选结果，统计相关通路中涉及的靶点，以及靶点对应的成分。将整理的结果导入 软件中，以度值大小构建网络，并筛选出 核心活性成分、核心靶点和核心通路。分 子 对 接选 取 核 心 活 性 成 分，用 进行结构优化，保存能量最低的优势构象的 格式，在 软件中导出为 格式，设为配体；通过 数据库获得排名靠前的靶蛋白的 格式文件，导入 软件输入“”“”命令进行去水和去小分子配体处理，再在 软件中加氢，导出为 格式，设为受体。使用 将配体与受体进行对接，取结合力最高的构象用 软件进行分析作图。实验动物 只雄性 小鼠（体质量为 ，月龄），实验动物购于安徽医科大学实验动物中心 生产许可证号 （皖）。饲养于温度（）、相对湿度 的动物房中，光照条件设置为 的明暗循环，小鼠可随意饮水和摄食。实验经安徽中医药大学动 物 伦 理 委 员 会 批 准，伦 理 编 号：。的制备 由茯苓、茯神、人参、远志各，石菖蒲、龙齿各 组成，购于安徽中医药大学第一附属医院。每剂用 倍量蒸馏水浸泡 ，煮沸后维持微沸状态 ，用纱布滤出滤液；再用蒸馏水煮沸后保持微沸 ，依上法滤出滤液。将次滤液合并放入旋转蒸发仪，减压浓缩后冷冻干燥成 水提物冻干粉（干粉相当于 药 材 量），低 温 干 燥 条 件 下 保 存备用。模型制备与给药 小鼠适应周后 建 立 单 次 延 长 应 激（，）模型。实验流程如下：束缚、强迫游泳 、休息 后，用异氟烷麻醉，足部电击（，）。模型复制完成后，将 只小鼠随机分为组（）：正常对照组、模型组、组。组小鼠灌胃给药 （），正常对照组和模型组均给予等量生理盐水。每日定时给药次，连续给药。在最后天给药后对小鼠进行行为学测试。（）旷场实验将待测小鼠放入旷场测试装置中心区，安静环境下观察小鼠 内的自发活动，使用行为学自动分析系统（上海欣软信息科技）比较各组之间运动的总路程、进入中央区域的次数及运动总路程。（）高架十字迷宫实验将小鼠放置于中央区域面对开放臂的方向，安静环境下小鼠自由探索。采用行为学自动分析系统（上海欣软信息科技）记录小鼠 内进入开臂、闭臂的滞留时间百分比。透射电子显微镜观察海马突触、神经元超微结构将海马组织从 戊二醛溶液中取出，经过 冲洗后，用锇酸固定，并经过梯度乙醇脱水，树脂浸透，包埋，切片（），铀染、铅染处理，透射电子显微镜下观察海马神经元、髓鞘超微结构及突触和突触小泡的数量。法检测、通路蛋白的表达水平将取材的小鼠海马组织置于 管中，加入 裂解液，组织匀浆，、离心 ，取上清。测定蛋白浓度，分离蛋白质样品，转膜，室温下用脱脂牛奶封闭，洗膜后加 入（，）和 一抗（，），过夜。对应的二抗孵育。洗膜，显色液显影成像。采用 软件进行数据分析。统计学方法测量数据采用“均数标准差（?）”表示，以 软件采用单因素方差分析用于组间比较。.表示差异有统计学意义。结果 的潜在活性成分从 、个中医药数据库中搜集到 中 个候选化合物，然后通过 平台以候选化合物的口服生物利用度和类药性为指标，共筛选出 中活性成分 个，其中茯苓个、茯神个、人参 个、石菖蒲 个、远志 个、龙齿个。去重后最终得到 活性成分 个。部分有效成分见表。活性成分作用靶点通过 预测活性成分作用靶点，以 为指标，筛选去除重复后得到 个活性成分作用靶点。其中人参 个、石菖蒲 个、远志 个、茯苓 个、龙齿 个、茯神 个。治疗 的潜在靶点通过 、数据库检索、筛查并去除重 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 表 部分活性成分序号本草编号活性成分相对分子质量来源 山柰酚 人参、石菖蒲 啤酒甾醇 茯苓 ，二甲氧基酮 茯苓 去甲头孢拉酮 远志 去甲莨菪碱 远志 远志酮 远志 胡椒内酰胺 远志 甲氧基藤黄菌素 人参 阿朴天仙子碱 人参 蛇藤苄酰胺 人参复，共得到 相关靶点 个。将 活性成分靶点与 靶点，使用 软件处理分析后，最终获得 治疗 的潜在作用靶点 个。见图。图 治疗 靶点的韦恩图 靶点交集 网络构建及拓扑分析使用 数据库构建 网络，去除一个逸 出 靶 点，将 结 果 导 入 到 软件中，以节点连接度的大小绘制网络，筛选出核心靶点共 个，选 取 前 个作 为 关键 靶 点，具体信息见表。核心靶点基因 富集分析和 通路分析利用 平台，以 为筛选条件，对 与 的 个共同靶点进行富集分析和 通路富集分析。富集分析共得到 个富集条目，其中生物过程 个、细胞组分 个、分子功能 个。分析生物过程主要涉及化学突触传递、对药物刺激的反应、聚合酶启动子转录与凋亡过程的正调控、级联的正调控、兴奋性突触后电位等；细胞组分主要涉及细胞质膜、突触、神经元胞体及神经元投射等；分子功能主要涉及蛋白质、大分子化合物等合成及神经递质激活。表 治疗 关键靶点的拓扑参数序号靶点连接度介度紧密度 通路富集分析共得到 条通路，筛选 条与 相关通路，其机制主要涉及神经活性配体受体相互作用、神经退行性多发通路、钙信号、血 清 素 能 突 触、多 巴 胺 能 突 触、雌激素、谷氨酸能突触、内分泌抵抗、胆碱能突触等。“药物活性成分靶点通路”网络分析通过 软件可视化处理构建“药物活性成分靶点通路”网络。结果展示了 的主要活性成分防治 作用靶点的所在通路，此网络共 个节点，其中中药材个，中的不同活性成分 个；与 共同作用靶点 个；与 疾病靶点的信号通路 个。网络中活性成分、靶点、通路依据度值排名前 的结果见表。分子对接结果根据“药物成分靶点通路”网络分析结果，选择节点度值排名靠前的核心活性成分山柰酚和啤酒甾醇为分子对接配体，与对应排名靠前的核心靶蛋白（、）进行分子对接（见图、表）。结果显示，山柰酚和啤酒甾醇与选取的靶蛋白均可自发结合，且构像稳定。其中山柰酚与 、啤酒甾醇与 的结合能均 ，形成数条氢键结合。另外，与山柰酚和啤酒甾醇都有较低的结合能，表明山柰酚和啤酒甾醇与对应靶点之间有较好的结合活性。这侧面验证了 可能主要通过山柰 酚 和 啤 酒 甾 醇 作 用 于 、和 ，从而发挥防治 的作用。改 善 小 鼠 样 行 为 旷 场 实验结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠进入中心区域内运动距离（图）和进入中心区域次数（图）显著减少（.）。与模型组比较，组小鼠进入区域内运动距离和中心区域次数 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 表“药物活性成分靶点通路”网络度值前 的节点草本编号活性成分度值基因名度值信号通路度值 山柰酚 神经活性配体受体相互作用 啤酒甾醇 神经退行性多重疾病 人参皂苷 癌症通路 人参炔 阿尔茨海默病 原人参三醇 钙信号通路 （）人参三醇 信号通路 人参三醇 信号通路 吉九里香碱 羟色胺能突触 阿朴天仙子碱 多巴胺能突触 南蛇藤苄酰胺 信号通路 均增加（.）。高架十字迷宫实验中，与正常对照组比较，模型组小鼠进入开放臂的探索时间明显 减 少（.）；与 模 型 组 比 较，组小鼠进入在开放臂的探索时间显著延长（图，.）。但给予 后不影响小鼠在旷场实验的总路 程（图，.），表 明 防 治 的焦 虑 和 抑 郁 样 行 为 与 小 鼠 的 运 动 功 能无关。注：山 柰 酚 ；山 柰 酚 ；山 柰 酚 ；啤酒甾醇 ；啤酒甾醇 ；啤酒甾醇 图 核心活性成分与靶蛋白相互作用表 核心成分与关键靶点的结合能名称生物活性编号结合能（）山柰酚 啤酒甾醇 注：正常对照组；模型组；组；与正常对照组比较，；与模型组比较，图 改善 小鼠 样行为（?，）海马神经元和突触结构形态的变化透射电子显微镜观察发现，正常神经元细胞结构较为完整，神经细胞数量多，排列整齐而紧密，胞浆丰富，细胞核清晰，圆形而居中。与正常神经元比较，病变的神经元数量减少，且排列疏松而不规则，细胞形态不一，部分神经元皱缩，染色质聚集，分布不均匀。正常髓鞘边缘清晰，同心圆状排列的膜性结构较完整。病变的髓鞘同心圆状排列的膜性结构模糊不清。正常情况下，突触前细胞的突触小泡数量较多，排列紧密，而发生病变时突触小泡的数量明显减少，且排列稀疏。正常海马神经元中突触数量较多，且神经元轴突、树突和突触间隙结构完整清晰，而病变的突触数量明显减少，神经元轴突、树突和突触间隙模糊不清。见图。与正常对照组比较，模型组小鼠海马神经元数量显著增多（.），髓鞘的病变数量呈升高趋势（.）；给予 后海马神经元和髓鞘有一定的改善作用，但差异无统计学意义（.）。与正常对照组比较，模型组小鼠海马突触结构中的 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 注：正常对照组；模型组；组；红色箭头示组织正常及病变部位；与正常对照组比较，；与模型组比较，图海马神经与突触结构形态的变化（?，）突触小 泡 数 量 和 突 触 的 数 量 均 明 显 减 少（.）；治 疗 后 可 阻 止 部 分 突 触 小 泡（.）和突触数量（.）的减少。见图。调节 小鼠海马组织 信号通路与正常对照组比较，模型组小鼠海马组织 、蛋白表达水平降低（.），在给予 干预后，小鼠海马组织 、蛋白表达水平显著上升（.）。结果提示，能上调 小鼠海马组织 、蛋白的表达水平。见图。讨论 是由单一或反复接触创伤事件发展而来的神经精神疾病。近年来，复方和单味中药在防治 及其并发症中疗效显著。前期研究发现，中富含皂苷、酚酸、醚类等活性成分，包括人参皂苷 、人参皂苷 、叶黄素和茯苓酸、细辛醚等。本研究显示，山柰酚和啤酒甾醇是 的主要活性成分，主要集中于人参、远志、石菖蒲味中药，故提示人参在 治疗 时具有不可或缺的作用，其次是远志和石菖蒲。为了明确共有靶点的相互作用，选取度值相对较高的关键靶点进行拓扑分析，结果发现 中活性成分主要通过、等靶点发挥作用。在 细 胞 存 活、增 殖 和 凋 亡及 免 疫 系注：正常对照组；模型组；组；与正常对照组比较，；与模型组比较，图 对 、蛋白表达水平的影响（?，）统中起重要作用。参与神经元发育和成熟神经元的正常功能（细胞凋亡、自噬、生长），主要通过整合细胞外多种信号刺激，参与体内多条信号通路，影 响 转 录 及 蛋 白 质 合 成。本 研 究 选 择 通路进行验证。同时，分子对接结果显示 与山柰酚和啤酒甾醇有较强的结合力，这一结果提示，可能是 防治 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 的核心靶点。本研究 仅探 讨了 通 路的作用，今后将对 蛋白作进一步的研究。对 生物过程分析结果表明，化学突触传递、兴奋性突触后电位和信号转导、凋亡过程正调控、神经元投射、等离子体膜的组成、蛋白合成等可能是 治疗 尤为重要的生物过程。在对海马突触、神经元和髓鞘形态的透射电子显微镜观察中发现，小鼠发生病变的海马突触、神经元和髓鞘细胞多于正常小鼠，在一定程度上可缓解病变细胞的形态与功能。通路分析结果显示，神经活性配体受体相互作用、钙信号等途径在 中起着重要作用。神经递质相关通路，如羟色胺能突触、多巴胺能突触、谷氨酸能突触、胆碱能突触等均可影响突触膜上受体神经递质的释放。在某些情况下，这些神经递质也参与神经系统功能调节，与 的发生密切相关。如羟色胺参与调节抑郁、焦虑等精神类疾病；多巴胺可调控奖赏、动机和情感等生理活动；谷氨酸能神经元是脑内主要的兴奋性神经元，其与 能神经元在脑内保持动态平衡；胆碱能神经元能调控恐惧的学习和消退。对上述通路进行研究将有助于进一步了解这些通路如何 参 与 的 发 生，以 及 发 现 潜 在 的 治 疗手段。综上所述，本研究通过网络药理学多方向、多层次地深入研究 治疗 的有效活性成分、潜在靶点及潜在机制，进一步结合分子对接技术、动物行为功能和蛋白表达等实验进行验证。研究结果证实，信 号 通 路 与 突 触 功 能 是 影 响 发病的主要因素，其 可能 通 过 神 经 活 性 配体受体相互作用、钙信号、血清素能突触、多巴胺能突触等通路发挥作用。参考文献：黄瑞雯，吴诗瑜 创伤后应激障碍临床诊断与心理干预的研究进展 中国临床医学，（）：杨绍杰，陈玉状，朱国旗从心肾探析创伤后应激障碍病机及中药防治研究中医药临床杂志，（）：刘雪，谢道俊，王谢，等安神定志丸加减联合艾司西酞普兰治 疗 惊 恐 障 碍 临 床 研 究 中 医 药 临 床 杂 志，（）：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 ：，（，）（）（），（）（），；*欢迎投稿欢迎订阅 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月