连翘酯苷A对肝星状细胞增殖及凋亡的影响.pdf

Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期287网络出版地址：https：/ 基础医学院（成都 610500）；2.成都医学院第一附属医院（成都 610500）；3.雅安市名山区人民医院（雅安 625000）【摘要】目的研究连翘酯苷A（FA）对肝星状细胞增殖活化及凋亡的影响。方法以人肝星状细胞（LX-2）作为实验对象，采用血小板衍生生长因子（PDGF）-BB模拟肝纤维化微环境，实验分为对照组、PDGF-BB组、FA组、PDGF-BB+FA组。采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测LX-2细胞活力；采用油红O检测细胞内脂滴的情况；采用免疫荧光染色检测细胞内平滑肌肌动蛋白（-SMA）的表达；采用蛋白质印迹技术（Western Blot）检测纤维化相关标志蛋白-SMA、1-I型胶原蛋白（COL1A1）和凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2蛋白（BCL-2）、剪切的-腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved-PARP）、BCL-2相关X蛋白（BAX）、剪切的-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（cleaved-CASPASE-3）的表达；采用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果FA处理后LX-2细胞活力明显下降，且呈剂量依赖性；油红O实验结 果显示，与PDGF-BB组比较，FA组细胞内脂滴数量较多；免疫荧光染色结 果显示，与PDGF-BB组相比，FA组细胞内-SMA荧光斑点的数量减少；Western Blot实验结 果显示，FA组-SMA、COL1A1、BCL-2蛋白表达减少，cleaved-PARP、BAX、cleaved-CASPASE-3蛋白表达增加。结论FA可抑制肝星状细胞的增殖、活化，促进凋亡，改善PDGF-BB诱导的体外肝纤维化。【关键词】凋亡；肝纤维化；肝星状细胞；连翘酯苷A【中图分类号】R34【文献标识码】AEffects of Forsythiaside A on Proliferation and Apoptosis of Hepatic Stellate CellsLiu Rong1，Tang Bin2，Liu Yilun3，Tan Yuehao1，Li Can1，Hu Xue1，Shen Haotian1，Deng Fengmei1.1.School of Basic Medical Sciences，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；3.Peoples Hospital of Mingshan District，Yaan 625000，China【Abstract】ObjectiveTo study the effects of forsythiaside A（FA）on the proliferation，activation and apoptosis of hepatic stellate cells（HSCs）.MethodsHuman HSCs（LX-2）were used as the model.And platelet derived growth factor（PDGF）-BB was used to simulate the microenvironment of liver fibrosis.LX-2 cells were divided into control group，PDGF-BB group，FA group and PDGF-BB+FA group and received corresponding treatment.The activity of LX-2 cells was detected by cell counting kit-8（CCK-8）.The lipid droplets in cells were detected by oil red O.The protein expression of smooth muscle actin（-SMA）in cells was detected by immunofluorescence staining.The expressions of fibrosis-related marker proteins-SMA，and collagen type I alpha1（COL1A1）and apoptosis-related proteins B-cell lymphoma-2（BCL-2），cleaved poly ADP-ribose polymerase（cleaved-PARP），BCL-2-associated X protein（BAX），and cleaved cysteine aspartate proteinase 3（cleaved-Caspase-3）were detected by Western Blot.The cell apoptosis was detected by flow cytometry.ResultsThe activity of FA treated LX-2 cells decreased in a dose-dependent manner.Oil red O experiment showed that compared with PDGF-BB treatment，FA treatment up-regulated the number of lipid droplets in cells.Immunofluorescence results showed that compared with PDGF-BB treatment，FA treatment down-regulated the number of-SMA fluorescence spots in cells.Western Blot results showed that FA treatment down-regulated the protein expression of-SMA，COL1A1 and BCL-2，and up-regulated the protein expression of cleaved-PARP，BAX，and cleaved-Caspase-3.ConclusionFA can inhibit the proliferation and activation of HSCs，promote their apoptosis，and improve the in vitro liver fibrosis induced by PDGF-BB.【Key words】Apoptosis；Liver fibrosis；Hepatic stellate cells；Forsythiaside A*基金项目：四川省中医药管理局科研项目（No：2021MS101）；四川养老与老年健康协同创新中心科研项目（No：YLZBZ2021）；成都医学院研究生创新基金（No：YCX2022-01-04）通信作者：邓峰美Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期288肝纤维化是肝硬化和肝癌的必经阶段，由肝内结缔组织异常增生形成。病毒性肝炎、酒精性或肥胖相关的脂肪性肝炎、寄生虫病、代谢性疾病、自身免疫性肝病等均可引起慢性肝损伤，导致肝脏炎症和纤维化1。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）驻留在血管内皮下间隙，在各种损伤因素下可被激活，使之活化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞分泌细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白，从而产生瘢痕组织2。在肝脏疾病中，HSCs的激活是肝纤维化发展的关键步骤。在生理情况下，HSCs处于静息状态；当受到各种损伤因素刺激时，肝脏中的细胞（肝细胞、枯否细胞等）释放大量细胞因子作用于静止状态的HSCs，使其活化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞是以表达丰富的细胞内蛋白为特征，包括波形蛋白、平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，-SMA）和1-型胶原蛋白（collagen typealpha1，COL1A1）等，而ECM的主要成分又是I型胶原蛋白，实验中常把-SMA和COL1A1蛋白作为体外肝纤维化的标志物3。血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是肝脏中关键的有丝分裂原，可激活HSCs4-5，增加-SMA的表达，而PDGF-BB是其中最强的丝裂原，因此在实验中常采用PDGF-BB来激活HSCs，模拟体内肝纤维化微环境。细胞凋亡、坏死和自噬性死亡均会触发细胞死亡6，可 作 为 介 导HSCs的 靶 点。研 究7表 明，抑 制HSCs增殖、激活或诱导HSCs衰老和凋亡，阻断ECM的过度沉积，可有效改善肝纤维化8-9。慢性肝损伤后，肝细胞发生凋亡，导致HSCs活化、增殖并导致炎症和纤维化反应，因此抑制肝细胞凋亡被认为是肝纤维化治疗的重要策略10。长期肝损伤引起的肝纤维化和肝硬化是全球卫生保健的主要负担之一，迄今为止，肝移植仍然是失代偿性肝病的主要治疗方法11。近年来随着肝病发病率的逐年上升，急需研发高效、毒性较小的新药物，中药因作用靶点多、副作用小、毒性低等特点备受关注。连翘酯苷A（forsythiaside A，FA）是从连翘的风干果实中分离出来的一种苯乙醇苷类物质，具有多种生物学功能，如抗炎12、抗氧化13、抗病毒感染14等。近年来研究15发现，FA具有保肝作用，FA可通过PI3K/AKT介导细胞凋亡，改善乙酰氨基酚诱导的斑马鱼肝损伤；FA通过调节肠道微生物组群从而减轻四氯化碳诱导的肝纤维化16。FA可预防过氧化氢诱导的线粒体依赖性PC12细胞凋亡17。FA还可通过抗炎和抗凋亡作用改善脓毒症诱导的急性肾损伤18。目前，FA对LX-2细胞凋亡及改善肝纤维化的作用机制尚未完全阐明，因此本研究拟探索FA对人肝星状细胞增殖活化及凋亡的作用，现报道如下。1材料与方法1.1细胞采用人源肝星状细胞（LX-2）为实验对象，LX-2细胞株购自武汉普诺塞公司，于无菌培养箱中培养（37、5 CO2）。每天观察细胞密度及形态，待培养基颜色发生变化时更换细胞培养液，后续进行油红O染色、蛋白质印迹技术等实验。1.2主要试剂杜氏改良高糖培养基（货号：11965092）、胎牛血清（货号：10100147）、0.25胰蛋白酶（货号：25200072）、青链霉素双抗（货号：15070063）购自美国Gibco公司；FA（货号：HY-N0028）、PDGF-BB（货号：HY-P7055）购 自 美 国MCE公 司；4，6-二 脒 基-2-苯 基 吲 哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（货号：C1002）、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG（货号：A0423）购自北京碧云天生物技术有限公司；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（货号：CA1020）、油红O染色试剂盒（货号：G1262）购自北京索莱宝公司；兔多克隆抗体-平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin，-SMA）（货号：19245）、1-I型 胶 原 蛋 白（collagen type I alpha1，COL1A1）（货号：72026）、腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）（货号：9532）、B淋巴细胞瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2，BCL-2）（货号：4223）、BCL-2相关X蛋白（BCL-2-associated X protein，BAX）（货号：41162）、剪切的-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（cleaved-CASPASE3）（货号：9664）、甘油醛-3-磷酸脱 氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（货号：5174）和HRP偶联的抗兔IgG抗体（货号：7074）购自美国CST公司。1.3检测 LX-2 细胞活力当LX-2细胞密度达到 8090时，用胰蛋白酶进行消化并收集细胞，然后进行细胞计数。在 96孔 细胞培养板中以 3103个/孔的密度接种，每组接种 6个 复孔，放入培养箱培养；次日，加入不同浓度（0.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0 mol/L）的FA处理；24 h后每孔加入 10 L的细胞计数（cell counting Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期289kit-8，CCK-8）试剂；在 37 的条件下孵育 1 h；在酶标仪上选择波长为 450 nm条件下测定吸光度值，并计算6孔的平均值。1.4油红 O 染色将细胞爬片放入 24孔细胞培养板中，将LX-2细胞以 5104个/孔的密度接种至孔内，将细胞分为 4组：二 甲 基 亚 砜（dsulfoxide，DMSO）组、PDGF-BB组、FA组、PDGF-BB+FA组，采用 40 g/L PDGF-BB和 100 mol/L FA处理细胞，作用 24 h，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗 5 min3次；用 10中性甲醛室温固定 10 min；用PBS洗涤 1 min1次，然后用 60异丙醇处理 15 s；在 37 避光环境下用已过滤的油红O染液对细胞爬片染色；用 60异丙醇处理细胞 15 s；用PBS洗涤 3 min3 次；用苏木素染液对细胞进行复染、甘油封片；在光学显微镜下观察染色结果并拍照。1.5蛋白质印迹技术将 4组细胞用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液在冰上裂解，离心后取蛋白上清液，用BCA法测定蛋白浓度，加入Loading Buffer制备蛋白样品；样品加入SDS-PAGE凝胶进行电泳，转膜后，用 5脱脂牛奶室温封闭 1 h；加一抗 4 孵育过夜，三乙醇胺缓冲盐吐温溶液（tris buffered saline tween，TBST）洗膜5 min3 次；加二抗室温孵育 2 h，TBST洗膜 5 min3次；采用凝胶成像仪进行曝光并拍照。1.6免疫荧光染色在细胞爬片上进行细胞培养，FA 处理 24 h后，4多聚甲醛室温固定 15 min，PBS漂洗 5 min；0.1的Tritonx-100处理 15 min；PBS漂洗 5 min；5山羊血清室温封闭 1 h；4 孵育一抗（-SMA）过夜；恢复至室温，PBS漂洗细胞；使用荧光二抗Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG，37 避光孵育 1 h，PBS漂洗；DAPI染核5 min，PBS漂洗 3 min3次；用防荧光淬灭剂封片，使用 光学显微镜（日本Olympus公司，型号：BX-63）观察细胞形态并拍照，全程避光操作。1.7流式细胞仪检测收集 4组细胞，用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的 胰 酶 消 化 细 胞，1 000 r/min，离心半径 5 cm，离心 5 min，沉淀细胞，吸除上清，加入 1 mL 4 预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀，小心吸除上清。按照说明书加入Annexin V-FITC和碘化丙锭溶液（propidium iodide，PI）；最后使用流式细胞仪检测FA对LX-2细胞凋亡的影响。1.8统计学方法采用GraphPad Prism 9.0统计软件进行数据分析，定性资料采用例数（）表示，定量资料采用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用Dunnett s t检验。检验水准除特别说明外均设定为 0.05。2结果2.1FA 对 LX-2 细胞增殖活化的影响CCK-8实验结果显示，不同浓度的FA（0.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0 mol/L）处理后，LX-2细胞活力降低，且呈剂量依赖性。油红O染色结果显示，PDGF-BB组细胞中脂滴较少，而FA组和PDGF-BB+FA组细胞中脂滴较多（图 1、表 1）。表 1LX-2细胞在不同浓度FA处理下的细胞活力分析（，n=3）浓度/（mol/L）增殖率/0.0100.000.0012.5100.000.4625.098.671.0250.096.470.64*75.094.571.40*100.087.981.07*150.078.791.76*200.066.371.31*F366.800P 0.001注：与 0 mol/L比较，*P0.05。图 1油红O检测 4组细胞内脂滴的变化注：A：DMSO组；B：PDGF-BB组；C：FA组；D：PDGF-BB+FA组。10 m10 m10 m10 mABCDJournal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期2902.2FA 对肝纤维化相关指标的影响蛋白质印迹技术检测结果显示，与对照组相比，PDGF-BB组-SMA和COL1A1蛋白表达明显增加，而FA组和PDGF-BB+FA组-SMA和COL1A1蛋白表达明显降低。免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，PDGF-BB组-SMA表 达 明 显 增 加，而FA组 和PDGF-BB+FA组-SMA表达明显低于PDGF-BB组（图 2、表 2）。表 34组细胞凋亡相关蛋白的表达比较（，n=3）组别cleaved-PARPBCL-2BAXcleaved-CASPASE3DMSO组1.000.001.000.001.000.001.000.00PDGF-BB组0.730.371.010.110.630.17*0.830.05*FA组2.210.36*0.440.15*1.350.03*1.350.00*PDGF-BB+FA组2.360.11*0.450.16*1.320.03*1.290.07*F20.17020.59029.39063.040P0.0070.0010.0040.001注：与DMSO组相比，*P0.05。表 24组细胞-SMA、COL1A1蛋白表达情况比较（，n=3）组别-SMACOL1A1DMSO组1.000.001.000.00PDGF-BB组0.930.011.960.43*FA组0.630.11*1.030.13PDGF-BB+FA组0.540.22*1.180.11F6.8667.897P0.0470.037注：与DMSO组相比，*P0.05。2.3FA 对 LX-2 细胞凋亡的影响蛋白质印迹技术结果显示，与对照组相比，FA组和PDGF-BB+FA 组cleaved-PARP、BAX和 cleaved-CASPASE3蛋白表达增高，同时BCL-2蛋白表达降低（图 3、表 3）。流式细胞仪检测结果显示，与对照组相比，PDGF-BB组细胞发生凋亡的比例减少，而FA组细胞发生凋亡的比例明显增多（图 4）。图 2FA对肝纤维化相关指标表达的影响注：A：蛋白质印迹技术检测 4组细胞-SMA和COL1A1蛋白的表达；B：免疫荧光检测 4组细胞-SMA的表达。ABCOL1A1-SMAGAPDH10010040040000-SMADAPImergeDMSO?PDGF-BB?FA?PDGF-BB+FA?20 m20 m20 m20 m20 m20 m20 m20 m20 m20 m20 m20 mFA/(mol/L)PDGF-BB/(g/L)3讨论肝纤维化广泛存在于多种肝脏疾病的病理过程中，在各种损伤因素刺激的情况下，静息状态的HSCs活化为肌成纤维细胞，并合成大量ECM，ECM过度沉积导致肝纤维化1。HSCs是肌成纤维细胞最主要的细胞来源，HSCs的活化被称为是纤维化发生的核心环节3。图 3FA对LX-2凋亡相关蛋白的影响FA/(mol/L)PDGF-BB/(g/L)PARPcleaved-PAPPBCL-2BAXcleaved-CASPASE-3GAPDH10010040040000图 4流式细胞仪检测FA对LX-2细胞凋亡的影响注：A：DMSO组；B：PDGF-BB组；C：FA组；D：PDGF-BB+FA组。PIPIPIPIQ4-13.69Q4-22.12Q4-391.87Q4-42.32Q4-12.96Q4-20.96Q4-393.16Q4-42.92Annexin V-FITCAnnexin V-FITCAnnexin V-FITCAnnexin V-FITCQ4-16.14Q4-25.24Q4-377.74Q4-410.87Q4-17.04Q4-25.27Q4-380.05Q4-47.64ABCDJournal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期291PDGF最初发现于血小板中，是肝星状细胞活化的关键分子，而PDGF-BB亲和力更强19-20，因此本研究选择PDGF-BB作为HSCs的激活剂，模拟体内肝纤维化的微环境，使HSCs处于激活状态。本研究发现，FA可使细胞活力降低，抑制LX-2细胞的增殖。LX-2细胞在静息状态下富含多个储存维生素A的脂滴，而在激活状态下细胞内脂滴丢失。本研究结果显示，PDGF-BB能使细胞中脂滴数量减少，LX-2细胞呈活化状态；FA能使细胞中脂滴数量增加，LX-2细胞呈静息状态，表明FA不仅可抑制LX-2细胞的活化，还可使已经活化的LX-2细胞恢复静息状态。PDGF-BB可使LX-2细胞中-SMA和COL1A1蛋白表达增多，而FA处理后LX-2细胞中-SMA和COL1A1蛋白表达均降低，表明FA可使LX-2细胞不活化为具有肌成纤维表型的细胞，从而改善PDGF-BB诱导的体外肝纤维化。凋亡是细胞在特定的情况下，本身发生的主动性、程序性死亡21-22。研究23表明，正常情况下大多数肌成纤维细胞在修复完成后会主动发生凋亡，但是在慢性肝病中，活化的HSCs可通过旁分泌和自分泌细胞因子的作用来逃逸凋亡，加重肝纤维化，最终进展为肝硬化。研究24-25表明，黄芪素、卡维地洛通过促进肝星状细胞凋亡来减轻肝纤维化。活化的HSCs发生凋亡，可改善肝纤维化的发展，因此调控HSCs 凋亡是研究肝纤维化的关键靶点。为了进一步研究FA是否能够诱导LX-2凋亡的发生，本研究对细胞凋亡进行检测发现，PDGF-BB作为HSCs的激活剂可抑制LX-2细胞凋亡，而FA可促进LX-2细胞凋亡。综上所述，FA可抑制LX-2细胞的增殖活化，促进细胞凋亡，改善体外PDGF-BB诱导的肝纤维化。本研究存在一定不足，未探讨FA促进肝星状细胞凋亡的具体作用靶点以及FA在体内的作用，未来研究中还需要进一步深入研究。参考文献1 Roehlen N，Crouchet E，Baumert T F.Liver 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