浙江大学细胞培养-基本技术.ppt

细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养技术培养技术细胞系的建立和鉴定细胞系的建立和鉴定培养物的固定、染色培养物的固定、染色显微镜观察显微镜观察1 11、细胞培养技术、细胞培养技术细胞原代培养细胞原代培养细胞传代培养细胞传代培养细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏细胞的运输细胞的运输2 21.1.1 1 细胞的原代培养细胞的原代培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长繁殖的方法。工条件下培养使其生存并不断生长繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、细胞的衰老、死亡等生命现象。接触抑制、细胞的衰老、死亡等生命现象。幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养脏器等更容易进行原代培养3 3意义原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。原来组织的特性。利用原代培养做各种实验利用原代培养做各种实验（药物测试、细胞分化及病毒学药物测试、细胞分化及病毒学方面方面）效果很好。效果很好。原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。4 4掌握无菌操作技术掌握无菌操作技术了解小鼠解剖操作技术了解小鼠解剖操作技术了解原代细胞培养的一般方法与步骤了解原代细胞培养的一般方法与步骤了解培养细胞的消化分散了解培养细胞的消化分散了解倒置显微镜的使用了解倒置显微镜的使用原代细胞培养的原代细胞培养的实验目的和要求实验目的和要求5 5实验材料实验材料实验动物实验动物：孕鼠或新生小鼠：孕鼠或新生小鼠 液体液体：细胞生长液（内含：细胞生长液（内含20%20%小牛血清）小牛血清）0.25%0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶平衡盐溶液平衡盐溶液70%70%乙醇乙醇器材器材：灭菌镊子、剪刀、灭菌培养皿、细胞培养：灭菌镊子、剪刀、灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯、吸管、酒精灯瓶、小瓶、烧杯、吸管、酒精灯6 6原代细胞培养方法原代细胞培养方法胰酶消化法组织块直接培养法冷消化冷消化温消化温消化一次性消化一次性消化分次消化分次消化 消化法：消化法：采用无菌操作的方法，把组织（或器官）采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经从动物体内取出，经酶消化酶消化处理，使分散成单个细胞，处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。7 7贴块法贴块法消化法消化法原原代代培培养养方方法法分分类类8 8分次消化分次消化 消化法的分类消化法的分类9 9外植块培养步骤图解外植块培养步骤图解1010操作步骤操作步骤1 1-取材取材 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有把整个孕鼠浸入盛有7575乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。后放在大平皿中携入超净台。用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。镊子将皮肤扯向后腿。用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。置于无菌的培养皿上。剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。直至清洗液清亮为止。1111操作步骤操作步骤2 2-切割切割将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用用平衡平衡盐溶液盐溶液漂洗漂洗。然后用眼科手术剪刀然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎小心地绞碎胚胎，直到，直到成成1mm1mm3 3左右的小块，再用左右的小块，再用平衡盐溶液平衡盐溶液清洗，清洗，洗到组织块发白为止。洗到组织块发白为止。静置，使组织块自然沉淀到管底，弃上清。静置，使组织块自然沉淀到管底，弃上清。12121313胰酶消化法胰酶消化法操作步骤操作步骤-消化、接种培养消化、接种培养 视组织块量加入视组织块量加入5-65-6倍的倍的0.25%0.25%胰酶液胰酶液，3737中消化中消化20-40min20-40min，每隔，每隔5min5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。加入加入3-5ml3-5ml细胞生长液细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。静置静置5-10min5-10min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。1000rpm1000rpm，离心，离心5-10min5-10min，弃上清液。，弃上清液。加入加入平衡盐溶液平衡盐溶液5ml5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。加入加入细胞生长液细胞生长液l-2mll-2ml（视细胞量），血球计数板计数。（视细胞量），血球计数板计数。将细胞调整到将细胞调整到5105105 5/ml/ml左右，转移至左右，转移至25ml25ml细胞培养瓶中，细胞培养瓶中，3737下培养。下培养。1414胰酶消化法胰酶消化法操作步骤操作步骤-消化、接种培养消化、接种培养也可将此步骤简化为：也可将此步骤简化为：视组织块量加入视组织块量加入5-65-6倍的倍的0.25%0.25%胰酶液胰酶液，3737中消化中消化20-4020-40minmin，每隔，每隔5min5min振荡一次。振荡一次。静置，吸去上清，用静置，吸去上清，用细胞生长液细胞生长液漂洗消化后的组织块，用漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。织块下沉。取细胞悬液接种至加了取细胞悬液接种至加了细胞生长液细胞生长液的培养瓶中（调整细胞的培养瓶中（调整细胞浓度到浓度到5105105 5/ml/ml左右），左右），3737下培养。下培养。（注意：省略了离心、计数等步骤）（注意：省略了离心、计数等步骤）1515组织块直接培养法组织块直接培养法操作步骤操作步骤 组织块接种：将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。翻转瓶底朝上，将翻转瓶底朝上，将细胞生长液细胞生长液加至瓶中，培加至瓶中，培养液勿接触组织块。养液勿接触组织块。3737静置静置3-5h3-5h，轻轻翻转培养瓶，使组织，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入浸入细胞生长液细胞生长液中（勿使组织漂起），中（勿使组织漂起），3737继续培养。继续培养。1616原代细胞培养结果原代细胞培养结果 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长 如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，5-7 d5-7 d5-7 d5-7 d即可形成单层即可形成单层即可形成单层即可形成单层17171.1.2 2 传代细胞培养传代细胞培养 细胞细胞“一代一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增倍增不同。在一代中，细胞培增3 3-6 6次次 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:21:2或或1:31:3以上的比以上的比率转移到新的容器中进行培养，即为率转移到新的容器中进行培养，即为传代培养传代培养。也是一种也是一种将细胞种保存下去的方法将细胞种保存下去的方法。同时也是。同时也是利用培养细胞进行各利用培养细胞进行各种实验的必经过程种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。1818细胞传代方法细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3 3种。种。1.1.悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（离心法传代：离心（10001000转转/分分）去上清，沉淀物加新培养液后再）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。混匀传代。直接传代法：悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后，将上清培养液去除直接传代法：悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后，将上清培养液去除1/2-1/2-2/32/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2.2.半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代（HeLaHeLa细胞）细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.3.贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用消化液是采用酶消化法传代。常用消化液是0.250.25胰蛋白酶液。胰蛋白酶液。1919消化法传代培养步骤消化法传代培养步骤2020选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯 旁，倒去瓶中的旧培养旁，倒去瓶中的旧培养液，加入液，加入2 2-3 3 mlml的的D-HanksD-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片胞表面的碎片(思考：还有什么作用？）思考：还有什么作用？）加入适量加入适量0 0.1-.1-0.250.25胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液用用HanksHanks液洗涤液洗涤1 1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。液。以以1 1:2 2或或1 1:3 3进行分装，并在培养瓶上做好标进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻记，注明代号、日期，轻轻摇匀，轻摇匀，37CO37CO2 2培养箱培养。培养箱培养。观察：细胞培养观察：细胞培养24h24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法2121传代细胞培养结果传代细胞培养结果一般情况，传代后的细胞在2h时左右就能附着在培养瓶壁上，2-4d就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代2222取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管 把培养瓶把培养瓶中的细胞吹打均匀。中的细胞吹打均匀。转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（10001000r rpmpm/min/min）5min5min。(区别贴壁传代区别贴壁传代)在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。管吹打细胞，制成悬液。以以1 1:2 2或或1 1:3 3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，号、日期，轻轻摇匀，37CO37CO2 2培养箱培养。培养箱培养。观察：细胞培养观察：细胞培养24h24h后，即可进行观察。后，即可进行观察。悬液细胞的传代培养悬液细胞的传代培养2323要预先与临床外科医生和护士商量要预先与临床外科医生和护士商量，并做好一切必要的并做好一切必要的准备工作。争取拿到的标本新鲜、无菌、少坏死等。准备工作。争取拿到的标本新鲜、无菌、少坏死等。联系好手术时间后，立即做好如下准备工作：准备联系好手术时间后，立即做好如下准备工作：准备1-21-2个个贮有培养液和抗生素的标本收集瓶，将盖盖紧，保持无贮有培养液和抗生素的标本收集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写上工作人员名字、地点和电话号菌，瓶外贴上标签，写上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送往医院，并与医生和护士讲清取手术标码；将收集瓶送往医院，并与医生和护士讲清取手术标本的部位及注意事项。本的部位及注意事项。1.3 1.3 人体活检人体活检(或手术或手术)材料材料2424标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往组织培养实验室。工作人标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集员最好是等在手术间外。但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料的瓶子盖好后，放入材料的瓶子盖好后，放入44冰箱，尽快打电话通知工作人员。冰箱，尽快打电话通知工作人员。取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，但仍有污染可能性的存在。取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制污染。如手术标本比较大（约可选用抗生素类控制污染。如手术标本比较大（约200mg200mg以上），可以上），可将其浸于将其浸于70%70%酒精中约酒精中约30-6030-60秒，这样会减少表面污染而不损坏内部组秒，这样会减少表面污染而不损坏内部组织的结构和存活。不要用纱布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。织的结构和存活。不要用纱布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。人体活检人体活检(或手术或手术)材料材料2525整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润，随时给组织整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润，随时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般情况下，最好是使块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般情况下，最好是使用用冰冷的冰冷的液体。液体。在剪碎或切割组织块时，尽量使用在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的锋利的刀剪，防止以钝刀剪，防止以钝器对组织揉、捻、撕拉等而造成细胞损伤。器对组织揉、捻、撕拉等而造成细胞损伤。整个取材过程整个取材过程耗时越短耗时越短越好。在万不得已的情况下，取材越好。在万不得已的情况下，取材后也可将组织贮存在冷的后也可将组织贮存在冷的(4(4)含平衡盐溶液含平衡盐溶液(或其它缓冲或其它缓冲盐溶液盐溶液)的营养液中，最好不超过的营养液中，最好不超过2424-4848 h(h(视不同组织类型视不同组织类型而定而定)。需要注意的事项需要注意的事项26261.4 1.4 培养细胞培养细胞生长生长测定测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任任何何培培养养瓶瓶内内生生长长的的细细胞胞都都由由死死细细胞胞和和活活细细胞胞组组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。成，从形态上区别死、活细胞是困难的。方法：方法：细胞计数法细胞计数法台盼蓝染色法台盼蓝染色法生长曲线法生长曲线法四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法2727细胞计数细胞计数用细胞计数法测定细胞生长动力学是目用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方法。前采用的最普遍的方法。血细胞计数板人工计数血细胞计数板人工计数 细胞计数器细胞计数器 血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏(Neubauer)(Neubauer)血细胞计数板。血细胞计数板。2828细胞计数细胞计数实验原理实验原理实验原理实验原理：血球计数盘一般有二个血球计数盘一般有二个chamberschambers，每个，每个chamberchamber中细刻中细刻9 9个个1m1mmm2 2 大正方形，其中大正方形，其中4 4个角落之正方形再细刻个角落之正方形再细刻1616个个小格，深度均为小格，深度均为0.1mm0.1mm。当。当chamberchamber上方盖上盖玻片后，上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为每个大正方形之体积为1 1mmmm2 20.1mm=1.0100.1mm=1.010-4-4mlml。使用。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以再乘以10104 4，即为每，即为每mlml中之细胞数目。中之细胞数目。存活测试为利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞存活测试为利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。2929细胞计数细胞计数 具体操作具体操作具体操作具体操作：1.1.将计数板及盖片将计数板及盖片用用75%75%酒精酒精擦拭干净，并将盖片盖在计数板。擦拭干净，并将盖片盖在计数板。2.2.吸取少许吸取少许混合均匀的混合均匀的细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置盖片和计数板之间，静置3min3min，注意盖片下不要有气泡，也，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。不能让悬液流入旁边槽中。3.3.计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：然后按公式计算：细胞数细胞数/mL=/mL=四大格细胞总数四大格细胞总数/410/4104 4 稀释倍数稀释倍数注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液3030由于由于由于由于死细胞死细胞死细胞死细胞的的的的细胞膜通透性细胞膜通透性细胞膜通透性细胞膜通透性发生改变，某些染料可发生改变，某些染料可发生改变，某些染料可发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞大量进入却不被排出，因而细胞大量进入却不被排出，因而细胞大量进入却不被排出，因而细胞呈色呈色呈色呈色。而。而。而。而活细胞活细胞活细胞活细胞反反反反之，能排出进入细胞内的染料，因而之，能排出进入细胞内的染料，因而之，能排出进入细胞内的染料，因而之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色不易着色不易着色不易着色。此。此。此。此法的原理即是法的原理即是法的原理即是法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应利用死、活细胞对染料的不同反应利用死、活细胞对染料的不同反应利用死、活细胞对染料的不同反应而而而而区分开两种细胞。区分开两种细胞。区分开两种细胞。区分开两种细胞。台盼蓝染细胞时，时间不宜过长台盼蓝染细胞时，时间不宜过长台盼蓝染细胞时，时间不宜过长台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约（约（约（约2 min2 min2 min2 min）。台盼蓝排除检测法台盼蓝排除检测法3131将将将将1 1 1 1滴细胞悬液滴细胞悬液滴细胞悬液滴细胞悬液(贴壁细胞可经贴壁细胞可经贴壁细胞可经贴壁细胞可经0.250.250.250.25胰蛋白酶溶胰蛋白酶溶胰蛋白酶溶胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液液消化后，吹打制成细胞悬液液消化后，吹打制成细胞悬液液消化后，吹打制成细胞悬液)与与与与2 2 2 2滴台盼蓝液滴台盼蓝液滴台盼蓝液滴台盼蓝液混混混混合后，合后，合后，合后，滴入细胞计数板滴入细胞计数板滴入细胞计数板滴入细胞计数板。2min2min2min2min后，在显微镜下计数至少后，在显微镜下计数至少后，在显微镜下计数至少后，在显微镜下计数至少200200200200个细胞。未着色个细胞。未着色个细胞。未着色个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。分比。分比。分比。活体染色与细胞计数活体染色与细胞计数3232细胞生长曲线的绘制细胞生长曲线的绘制 细胞生长曲线细胞生长曲线细胞生长曲线细胞生长曲线(cell growth curve)(cell growth curve)(cell growth curve)(cell growth curve)是观测细胞在是观测细胞在是观测细胞在是观测细胞在一代生存期一代生存期一代生存期一代生存期内的内的内的内的增生过程增生过程增生过程增生过程的重要指标，可根据细胞的重要指标，可根据细胞的重要指标，可根据细胞的重要指标，可根据细胞生长曲线分析生长曲线分析生长曲线分析生长曲线分析细胞增殖速度细胞增殖速度细胞增殖速度细胞增殖速度，确定，确定，确定，确定细胞传代细胞传代细胞传代细胞传代、细胞细胞细胞细胞冻存冻存冻存冻存或或或或具体实验具体实验具体实验具体实验的最佳时间。的最佳时间。的最佳时间。的最佳时间。它以培养它以培养它以培养它以培养时间时间时间时间为为为为横坐标横坐标横坐标横坐标、细胞密度细胞密度细胞密度细胞密度为为为为纵坐标纵坐标纵坐标纵坐标作坐标作坐标作坐标作坐标图。图。图。图。33331 1 1 1)培养细胞培养细胞培养细胞培养细胞 首先首先首先首先在在在在2 2 2 2孔培养板内分别接种孔培养板内分别接种孔培养板内分别接种孔培养板内分别接种相同数量的相同数量的相同数量的相同数量的细胞。计数并记录接种的细细胞。计数并记录接种的细细胞。计数并记录接种的细细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为胞悬液之密度。接种时间记为胞悬液之密度。接种时间记为胞悬液之密度。接种时间记为0 h0 h0 h0 h。2 2 2 2)计数细胞密度计数细胞密度计数细胞密度计数细胞密度 从接种时间算起，每从接种时间算起，每从接种时间算起，每从接种时间算起，每隔隔隔隔24242424 h h h h计数孔内的细胞密度，算出平均值。为提计数孔内的细胞密度，算出平均值。为提计数孔内的细胞密度，算出平均值。为提计数孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数高准确率，对每孔细胞可计数高准确率，对每孔细胞可计数高准确率，对每孔细胞可计数2 2 2 2-3 3 3 3次。如此操作至第七天结束次。如此操作至第七天结束次。如此操作至第七天结束次。如此操作至第七天结束。l 3 3)绘制曲线绘制曲线 以培养时间为横坐标、细胞密度以培养时间为横坐标、细胞密度 为纵坐标，将全部结为纵坐标，将全部结果在坐标纸果在坐标纸 上绘图，即得所培养细胞的生长上绘图，即得所培养细胞的生长 曲线。曲线。3434 四唑盐（四唑盐（MTTMTT）商品名为噻唑蓝）商品名为噻唑蓝 四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（水的蓝紫色产物（formazan)formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。种功能。二甲亚砜（二甲亚砜（DMSODMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的色深浅与所含的formazanformazan量成正比，用酶标仪测定量成正比，用酶标仪测定ODOD570nm570nm值。值。MTTMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。肿瘤放射敏感性实验等。四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法3535操作步骤操作步骤四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法100L单细胞悬液接种于96孔板(5104)。37、5CO2培养箱中培养一段时间加入2mg/ml的MTT液（50L/孔）；继续培养3h。吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150L/孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10min，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm）。记录结果。高浓度血清可影响光吸收值，在加入异丙醇溶液或DMSO前尽量吸净培养液。吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。36361.1.5 5 细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏 SpallanzaniSpallanzani(17761776)最早发表了最早发表了“冷冷”处理对处理对“细胞细胞”生命活动影响的报道。生命活动影响的报道。19001900年前后，科学家基本上肯定了生物成分年前后，科学家基本上肯定了生物成分(如精子如精子)能够在零下温度能够在零下温度贮存的事实。贮存的事实。PolgePolge等人等人(19491949)发现了发现了甘油甘油对低温下贮存细胞的保护作用。对低温下贮存细胞的保护作用。Luyet(1951)Luyet(1951)与与Lovelock(1953)Lovelock(1953)等多位学者发现等多位学者发现电解质浓度增大电解质浓度增大是造成冷是造成冷冻贮存细胞损伤的主要原因。冻贮存细胞损伤的主要原因。LovelockLovelock等人等人(19591959)发现了一种新的化学保护剂，这就是现在人们熟发现了一种新的化学保护剂，这就是现在人们熟知的知的二甲基亚砜二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)。当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技术当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技术，贮存时，贮存时间几乎是无限的。间几乎是无限的。3737细胞冻存细胞冻存细胞冻存细胞冻存(cryopreservation)(cryopreservation)：将体外培养物悬：将体外培养物悬浮在浮在冷冻保护剂冷冻保护剂的溶液中，以一定的的溶液中，以一定的降温速率降温速率降降至零下某一温度至零下某一温度(-70(-70)，并在此温度下对其长，并在此温度下对其长期保存的过程。期保存的过程。复苏复苏复苏复苏(thawing)(thawing)：以一定的：以一定的复温速率复温速率将冻存的培将冻存的培养物养物恢复到常温恢复到常温的过程。的过程。3838影响冷冻效果的因素影响冷冻效果的因素1.1.冷冻速率冷冻速率细胞冷至细胞冷至-5-15-5-15之间时，细胞外溶液先出现结冰而细之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态，细胞内未结冰的水分子会向细胞胞内仍保持未结冰状态，细胞内未结冰的水分子会向细胞外流动外流动-冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内溶质浓度增高，细胞内不冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰发生结冰，但脱水严重，细胞体积严重收缩，甚至使细胞失去活性；，但脱水严重，细胞体积严重收缩，甚至使细胞失去活性；-冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，随着温度的下降会冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，随着温度的下降会发生细胞内结冰发生细胞内结冰，造成细胞膜及细胞器的破坏，造成细胞膜及细胞器的破坏。3939影响冷冻效果的因素影响冷冻效果的因素2.2.冷冻保存温度冷冻保存温度液氮温度（液氮温度（-196-196）是目前最佳冷冻保存温度。）是目前最佳冷冻保存温度。-70-70-80-80 条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，时间延长，细胞存活率下降。影响，时间延长，细胞存活率下降。3.3.复温速率复温速率是在细胞复苏时温度升高的速度是在细胞复苏时温度升高的速度一般复温速度越快越好一般复温速度越快越好1-2min1-2min内从内从-196-196升温至升温至3737（水浴锅）（水浴锅）。40404.4.冷冻保护剂冷冻保护剂 可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。渗透性：甘油、渗透性：甘油、DMSODMSO 非渗透性非渗透性：聚乙烯吡咯烷酮：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、蔗糖、聚乙二醇影响冷冻效果的因素影响冷冻效果的因素甘油或DMSO分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷。4141慢冻程序慢冻程序 标准程序标准程序标准程序标准程序：采用细胞冻存器：采用细胞冻存器当温度在当温度在-25-25以上时，以上时，1 12/min2/min当温度达当温度达-25-25以下时，以下时，5 510/min10/min当温度达当温度达-100-100时，可迅速放入液氮时，可迅速放入液氮(-196(-196 C C)中中 简易程序简易程序简易程序简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1-21-2的速度，在的速度，在40min40min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。传统程序传统程序传统程序传统程序：冷冻管置于：冷冻管置于41h-201h-8016-18h(41h-201h-8016-18h(或隔夜或隔夜)液氮槽长期储存液氮槽长期储存 4242低温保护剂的应用低温保护剂的应用在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是二甲基亚枫（二甲基亚枫（DMSODMSO），它是一种，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶减少胞内冰晶，从而，从而减少冰晶对细胞的损伤。减少冰晶对细胞的损伤。常温下常温下DMSODMSO对细胞的毒副作用较大，在对细胞的毒副作用较大，在44时，其毒时，其毒副作用大为减弱，冻存时副作用大为减弱，冻存时DMSODMSO平衡应在平衡应在44下进行。下进行。4343细胞冻存方法细胞冻存方法预先配制冻存液预先配制冻存液-10-10DMSODMSO 细胞生长液（细胞生长液（2020血清基础培养液）血清基础培养液）取取对数生长期对数生长期对数生长期对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液存液,用吸管吹打制成细胞悬液（用吸管吹打制成细胞悬液（1-5101-5106 6cell/ml)cell/ml)加加1ml1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名细胞名细胞名细胞名称和冷冻日期称和冷冻日期称和冷冻日期称和冷冻日期。液氮长期保存。液氮长期保存4444注意事项注意事项1.控制冻存细胞的质量2.不宜将冻存的细胞放置在-20过长时间，易引起低温损伤3.冻存小管宜用塑料冻存管4545保存细胞的复苏方法保存细胞的复苏方法快速解冻快速解冻快速解冻快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入3737水浴中，轻轻摇水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在动冷冻管，使其在1min1min内（不要超过内（不要超过3min3min）全部融化）全部融化 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶进解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶进行培养，行培养，24h24h后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSODMSO如果细胞对冷冻保护剂特别敏感如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中到含完全生长培养液的培养瓶中46461.准备水浴准备水浴2.取冻存管，入水浴快速晃动至完全融取冻存管，入水浴快速晃动至完全融化化3.去除去除DMSODMSO4.4.加入培养基制成细胞悬液，移入培加入培养基制成细胞悬液，移入培养瓶培养养瓶培养4747注意事项注意事项1.尽快使细胞恢复到常温2.尽快离心弃去冷冻保护液，防止对细胞的毒害4848冻存和复苏的原则：冻存和复苏的原则：慢冻快融慢冻快融冷到零度以下，细胞可以产生以下变化：冷到零度以下，细胞可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。，即冰晶的重结晶。49491.1.6 6 细胞的运输细胞的运输由于培养细胞株由于培养细胞株(系系)的商品化，细胞培养室之间的交流、的商品化，细胞培养室之间的交流、交换和购买已成为生命科学研究中的一个重要组成部分，交换和购买已成为生命科学研究中的一个重要组成部分，培养细胞的运输成为研究工作的一个重要环节。培养细胞的运输成为研究工作的一个重要环节。如果不了解所要细胞的性状、培养液特点及培养注意事如果不了解所要细胞的性状、培养液特点及培养注意事项，运输时不注意使用特殊容器或温度等，就可能影响项，运输时不注意使用特殊容器或温度等，就可能影响细胞的生长，或出现差错，或导致培养失败等。细胞的生长，或出现差错，或导致培养失败等。装运细胞的主要方法如下：装运细胞的主要方法如下：冷冻储存运输冷冻储存运输 充液法充液法5050细胞的运输细胞的运输-冷冻储存运输冷冻储存运输利用特殊容器内盛液氮或干冰的运输方法。保存效果较好，但缺点是比较麻烦，不宜长时间运输，多需空运，代价较大。5151细胞的运输细胞的运输-充液法充液法一般选择生长良好的细胞，以生长一般选择生长良好的细胞，以生长1/31/31/21/2瓶底壁为宜，瓶底壁为宜，去掉旧培养液，补充新的培养液至瓶颈部，保留微量空去掉旧培养液，补充新的培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖，并用胶带密封，放在一运送盒内，用棉气，拧紧瓶盖，并用胶带密封，放在一运送盒内，用棉花等做防震防压处理。运输时间需花等做防震防压处理。运输时间需4-5d4-5d，一般放在贴身，一般放在贴身口袋即可，到达目的地后倒出多余的培养液，只需保留口袋即可，到达目的地后倒出多余的培养液，只需保留维持生长所需的培养液置维持生长所需的培养液置3737培养，次日传代。培养，次日传代。如果在市内运输或仅需数小时运输路程，也可将细胞附如果在市内运输或仅需数小时运输路程，也可将细胞附着面朝上，或把培养液全部倒掉放在胸部口袋运送。靠着面朝上，或把培养液全部倒掉放在胸部口袋运送。靠附着于细胞表面的培养液，可使细胞短时间不受损。附着于细胞表面的培养液，可使细胞短时间不受损。52522、细胞系的建立、细胞系的建立正常细胞系正常细胞系癌细胞系癌细胞系转化细胞系转化细胞系细胞克隆细胞克隆5353正常细胞系建立的程序：正常细胞系建立的程序：原代培养原代培养第一次传代第一次传代常规传代常规传代冻存和复苏冻存和复苏5454癌癌细胞系建立的程序：细胞系建立的程序：步骤类似正常细胞系建立步骤类似正常细胞系建立注意：注意：取转移灶组织癌细胞、癌最外层组织取转移灶组织癌细胞、癌最外层组织去除癌组织中的间质细胞去除癌组织中的间质细胞-胶原酶法胶原酶法5555细胞系的维持细胞系的维持细胞系档案要记录好：细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传代时间等；组织来源、培养基要求、传代时间等；传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；多种细胞维持传代，要防止交叉污染；多种细胞维持传代，要防止交叉污染；要有充足的冻存储