骨髓增生异常综合征中环状R...A差异表达的生物信息学分析_刘仪凡.pdf

论著骨髓增生异常综合征中环状 RNA 差异表达的生物信息学分析刘仪凡1，席亚明21.兰州大学第一临床医学院（兰州 730000）2.兰州大学第一医院血液科（兰州 730000）【摘要】目的 探索骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）中环状 RNA（circular RNA,circRNA）差异表达的模式和作用。方法 对 GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中的 circRNA 表达谱数据集GSE163386、GSE94591 和 GSE81173 进行预处理及差异分析，利用 circBank 数据库与 ENCORI、miRDB、miRWalk数据库分别预测与差异表达 circRNA 和差异表达信使 RNA（messenger RNA,mRNA）相互作用的微 RNA（microRNA,miRNA），构建 circRNA-miRNA-mRNA 轴。于 PubMed 中检索得到与 MDS 有关的 miRNA，取交集进一步得到 MDS 相关的竞争性内源 RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）网络。结果 通过分析得到 128个差异表达 circRNA，48 个高表达，80 个低表达。差异倍数10 的差异表达 circRNA 中 3 个表达上调，11 个表达下调。通过分析得到 101 个差异表达 mRNA，9 个表达上调，92 个表达下调。与 PubMed 检索得到的 MDS 相关miRNA 取交集进一步得到 MDS 相关的 ceRNA 网络，即 circRNA（has_circ_0061137）-miRNA（has-miR-16-5p）-mRNA（RUBCNL、TBC1D9、SLC16A6）和 circRNA（has_circ_0061137）-miRNA（has-miR-125b-5p）-mRNA（CCR5、SLC16A6、IRF4），这些网络均为下调表达。结论 该研究揭示的 ceRNA 网络可能有助于阐明 MDS 中的 circRNA机制。【关键词】生物信息学；骨髓增生异常综合征；环状 RNA；竞争性内源 RNABioinformatic analysis of circular RNAs differential expression in myelodysplasticsyndromeLIU Yifan1,XI Yaming21.The First School of Clinical Medicine,Lanzhou University,Lanzhou,Gansu 730000,P.R.China2.Department of Hematology,the First Hospital of Lanzhou University,Lanzhou,Gansu 730000,P.R.ChinaCorresponding author:XI Yaming,Email:【Abstract】Objective To explore the mode and role of differential expression of circular RNAs(circRNAs)inmyelodysplastic syndrome(MDS).Methods We preprocessed and analyzed the circRNA expression profile datasetsGSE163386,GSE94591,and GSE81173 in the GEO(Gene Expression Omnibus)database.By using the circBank databaseand the ENCORI,miRDB,and miRWalk databases to predict microRNAs(miRNAs)that interacted with differentiallyexpressed circRNAs and messenger RNAs(mRNAs),the circRNA-miRNA-mRNA axis was constructed.We retrievedmiRNAs related to MDS in PubMed and further obtained competing endogenous RNA(ceRNA)networks related to MDSby taking intersections.Results Through analysis,128 differentially expressed circRNAs were identified,48 highlyexpressed,and 80 low expressed.Among differentially expressed circRNAs with multiple differences10,3 wereupregulated and 11 were downregulated.Through analysis,101 differentially expressed mRNA were identified,with9 upregulated and 92 downregulated.Intersecting with the MDS related miRNAs retrieved by PubMed,we furtherobtained the MDS related ceRNA network,namely circRNA(has_circ_0061137)-miRNA(has-miR-16-5p)-mRNA(RUBCNL,TBC1D9,SLC16A6)and circRNA(has_circ_0061137)-miRNA(has-miR-125b-5p)-mRNA(CCR5,SLC16A6,IRF4),all of which were downregulated.Conclusion The ceRNA networks revealed in this study may help elucidate thecircRNA mechanism in MDS.DOI：10.7507/1002-0179.202303031基金项目：兰州市科技计划项目（2020-ZD-76）通信作者：席亚明，Email：华西医学 2023 年 7 月第 38 卷第 7 期 1053 http:/www.wcjm.org【Key words】Bioinformatics;myelodysplastic syndrome;circular RNA;competing endogenous RNA骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）是一组异质性显著的髓系克隆性恶性疾病，其特征是无效造血、难治性外周血细胞进行性减少、进展为急性髓系白血病的风险增加和总生存率差1。MDS 在儿童期和青少年期发病并不常见，但随着年龄的增长而发病率逐年上升2。环状 RNA（circular RNA,circRNA）是借助高通量测序探索到的新型 RNA3。作为非编码 RNA，不具有 5帽和3自由末端，通过一种名为“反向剪接”的剪接机制从信使 RNA（messenger RNA,mRNA）的前体以闭环形式导出，已成 RNA 生物学的研究热点4-5。在多种癌症中，circRNA 调节重要的细胞过程，包括增殖、侵袭和转移，circRNA 可以作为竞争性内源 RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）发挥作用，ceRNA 充当编码 RNA 和非编码 RNA 之间的沟通桥梁，与微 RNA（microRNA,miRNA）竞争，从而形成跨转录组的调控网络即 circRNA-miRNA-mRNA 轴6-7。近年来，circRNA 及其 ceRNA 网络在MDS 发生发展中的作用引起了人们的关注，本研究旨在通过生物信息学分析，筛选出差异表达的circRNA 及 mRNA，构建 ceRNA 网络，探索circRNA 在 MDS 中的重要作用。1 材料与方法1.1 数据集的获取和预处理在 GEO（Gene Expression Omnibus）中选取GSE163386 数据集（5 例 MDS 患者，5 例急性髓系白血病患者和 4 例对照患者的骨髓样本）和GSE94591 数据集（4 例健康对照者和 6 例急性髓系白血病患者）8，因 GSE163386 数据集中的对照组为脾功能亢进、血小板减少以及白细胞减少的患者，且上述 2 个数据集的平台注释文件一致，遂本研究将上述 2 个数据集合并，在 R 4.2.1 环境下，将GSE163386 数据集中的 5 例 MDS 患者的表达谱芯片数据、GSE94591 数据集中的 4 例健康对照者表达谱芯片数据进行合并，并处理合并后的数据集，最后得到 circRNA 的完整表达矩阵。对 GSE81173数据集（6 例健康对照者和 12 例 MDS 患者）进行处理，得到 mRNA 的完整表达矩阵。1.2 基于 limma 包进行差异分析在 R 4.2.1 环境下，选择 limma 包差异分析差异表达 circRNA、mRNA 表达矩阵，以校正 P10为 circRNA 的筛选条件，最后根据 circBase 数据库对得到的 circRNA 进行标准化命名转化。于表达矩阵找到 MDS 组与健康对照组中 circRNA 对应的表达量并用 pheatmap 包绘制聚类热图。1.3 ceRNA 网络的构建利用人类 circRNA 信息数据库 circBank 预测与上述差异倍数10 的差异表达 circRNA 相互作用的 miRNA，进一步利用 ENCORI、miRDB、miRWalk数据库预测与上述差异表达 mRNA 相互作用的miRNA，取二者交集，利用 Cytoscape 3.9.1 绘制circRNA-miRNA-mRNA 轴的网络图。以“myelodysplastic syndrome”为关键词，于 PubMed中检索得到与 MDS 有关的 miRNA，取交集进一步得到 MDS 相关的 ceRNA 网络。2 结果2.1 MDS 中差异表达 circRNA 的筛选结果通过分析 circRNA 表达矩阵，得到差异表达circRNA 共 5 397 个，筛选后得到较显著差异表达circRNA 共 128 个，其中 MDS 患者组高表达的circRNA 有 48 个，MDS 患者组低表达的 circRNA有 80 个。以差异倍数10 再次处理数据，结果显示3 个表达上调（表 1），11 个表达下调（表 2）。MDS组与健康对照组 circRNA 表达量的聚类热图见图 1。通过分析 mRNA 表达矩阵，得到差异表达 mRNA共 19 254 个，筛选后得到较显著差异表达 mRNA共 101 个，MDS 组中 9 个表达上调，92 个表达下调。2.2 ceRNA 网络的构建结果通过 circBank 预测的与差异表达 circRNA 相互作用的 miRNA 有 582 个，进一步通过 ENCORI、miRDB、miRWalk 数据库预测的与差异表达 mRNA相互作用的 miRNA 有 348 个，取交集得到均上调的 miRNA 有 1 个，均下调的 miRNA 有 72 个，构建circRNA-miRNA-mRNA 轴（图 2）。构建的 circRNA-miRNA-mRNA 轴由 11 个 circRNA、73 个 miRNA、37 个 mRNA 组成。与 PubMed 检索得到的 MDS 相关 miRNA 取交集进一步得到 MDS 相关的 ceRNA网络，即 circRNA（has_circ_0061137）-miRNA（has-miR-16-5p）-mRNA（RUBCNL、TBC1D9、SLC16A6）和 circRNA（has_circ_0061137）-miRNA（has-miR-125b-5p）-mRNA（CCR5、SLC16A6、IRF4），这些网络均为下调表达。1054 West China Medical Journal,Jul.2023,Vol.38,No.7 http:/www.wcjm.org3 讨论circRNA 是一种具有生物活性的核酸分子，以闭环 RNA 的形式存在，与 mRNA 不同，circRNA缺少聚腺苷酸化的尾部9。尽管一些 circRNA 具有蛋白质编码潜力，但常常被归类为非编码 RNA10。近年来，越来越多的研究揭示了 circRNA 在不同生物学过程中的重要作用，特别是在肺癌11、膀胱癌12、胃癌13、肝癌14等不同癌症的发病机制、疾病进展过程以及癌细胞迁移中有着重要作用，这提示circRNA 作为分子诊断生物标志物具有潜在意义。MDS 是一种克隆性疾病，circRNA 在 MDS 中发挥重要作用。本研究通过处理 GEO 数据库得到GSE163386 和 GSE94591 这 2 个 circRNA 数据集，并结合 GSE81173 这 1 个 mRNA 数据集，构建 circRNA-miRNA-mRNA 轴，由 11 个 circRNA、73 个 miRNA、37 个 mRNA 组成。既往文献报道，miR-16-5p 和miR-125b-5p 为 MDS 的生物标志物15。本研究进一表 1 骨髓增生异常综合征中高表达差异倍数 10 倍以上的环状RNA环状 RNA基因名称差异倍数P 值hsa_circ_0061265NONE23.517 20.006 4hsa_circ_0000144SLAMF616.074 40.009 4hsa_circ_0000517RPPH110.159 30.000 6该表按照差异倍数大小进行排序表 2 骨髓增生异常综合征中低表达差异倍数 10 倍以上的环状RNA环状 RNA基因名称差异倍数P 值hsa_circ_0043278TADA2A27.493 50.003 7hsa_circ_0060055EIF620.012 30.000 9hsa_circ_0000977NOL1015.105 30.001 0hsa_circ_0061137DIDO114.957 70.000 3hsa_circ_0017109NID114.933 60.000 1hsa_circ_0018004PDSS112.931 80.000 7hsa_circ_0054970SLC1A411.878 40.000 1hsa_circ_0008896PPAPDC1A11.212 60.000 2hsa_circ_0045862TNRC6C10.631 80.000 2hsa_circ_0003854PER210.521 20.000 1hsa_circ_0034762MAPKBP110.034 20.000 6该表按照差异倍数大小进行排序Typehsa_circ_0043278hsa_circ_0034762hsa_circ_0017109hsa_circ_0045862hsa_circ_0008896hsa_circ_0018004hsa_circ_0061137hsa_circ_0060055hsa_circ_0000977hsa_circ_0003854hsa_circ_0054970hsa_circ_0000517hsa_circ_0061265hsa_circ_00001441.51.00.500.51.01.5TypeNTGSM2478980GSM2478979GSM2478978GSM2478981GSM4978127GSM4978125GSM4978126GSM4978128GSM4978129图 1 环状 RNA 聚类热图T 代表骨髓增生异常综合征组；N 代表健康对照组。列为样本表达谱；行为标准命名的环状 RNA。红色为表达上调，蓝色为表达下调，白色为中等表达华西医学 2023 年 7 月第 38 卷第 7 期 1055 http:/www.wcjm.org 步得到 MDS 相关的 ceRNA 网络即 circRNA（has_circ_0061137）-miRNA（has-miR-16-5p）-mRNA（RUBCNL、TBC1D9、SLC16A6）和 circRNA（has_circ_0061137）-miRNA（has-miR-125b-5p）-mRNA（CCR5、SLC16A6、IRF4），这些网络均为下调。circRNA 在癌症发展和某些类型的病理反应中发挥着重要作用，充当 miRNA 海绵来调节基因表达，形成 circRNA-miRNA-mRNA 轴，也称为ceRNA 网络16。RUBCNL 是一种蛋白质编码基因，也被称为 PACER、C13orf18 以及 KIAA0226，与RUBCNL 相关的疾病包括宫颈癌和子宫原位癌。在营养丰富的条件下，RUBCNL 被哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体 1 介导的磷酸化灭活，当营养不足时，RUBCNL 被去磷酸化，这有利于其乙酰化，而乙酰化的 RUBCNL 显著增强同型融合和蛋白分选复合体的募集，最终导致体外和体内更有效的自噬体成熟和脂质代谢17。TBC1D9 也通过自噬发挥作用，是一种新型的自噬调节器，TBC1D9 通过钙离子依赖的泛素识别来控制 TANK 结合激酶 1 在异体自噬和有丝分裂过程中的激活18，而 TANK 结合激酶 1 活性失调通常不仅与传染性疾病有关，还与自身免疫性疾病和癌症有关，并且既往研究表明造血干细胞区室中缺失 ATG7 的小鼠具有 MDS 样表型19，因此自噬和线粒体功能障碍与 MDS 的发病机制有关。综上，circRNA（has_circ_0061137）-miRNA（has-miR-16-5p）-mRNA（RUBCNL、TBC1D9）可能是通过调节自噬，从而产生与 MDS发生发展之间的联系，而 SLC16A6 是一种蛋白质编码基因，别名为 MCT6、MCT7。SLC16A6 可以预测皮肤黑色素瘤的特异性生存20，但是尚未发现该基因与血液系统疾病之间的联系。IRF4 在 B 细胞的发育分化和淋巴细胞的增殖活化中起重要作用，敲除 IRF4 后，小鼠活化的淋巴细胞和浆细胞数量明显减少，血清免疫球蛋白水平显著下降，T 淋巴细胞的细胞毒作用或抗肿瘤作用减弱21。IRF4 在 MDS 中低表达，circRNA（has_circ_图 2 环状 RNA-微 RNA-信使 RNA 调控网络蓝色三角箭头表示环状 RNA，红色菱形表示微 RNA，紫色圆形表示信使 RNA，黑色箭头与线表示环状 RNA-微 RNA，灰色箭头与线表示微 RNA-信使 RNA，右下角为上调表达的竞争性内源 RNA 调控网络，其余均为下调表达 1056 West China Medical Journal,Jul.2023,Vol.38,No.7 http:/www.wcjm.org0061137）-miRNA（has-miR-125b-5p）-mRNA（IRF4）轴通过诱导体液免疫和细胞免疫抑制，从而减弱机体抗肿瘤作用。CCR5 基因编码的蛋白是一种 G 蛋白偶联受体，见于不同种类的癌，主要作用于癌症进展的晚期事件（如肿瘤转移），CCR5/CCL5 轴具有促肿瘤效应，故 CCR5 低表达与更好的预后相关22。Zilio等23的研究也表明，癌症中低表达 CCR5 或者抑制CCR5 与更好的预后相关。此外，CCR5 在高危 MDS患者的 CD8+T 细胞中增加，因此低表达 CCR5 的MDS 患者可能提示有更好的预后，circRNA（has_circ_0061137）-miRNA（has-miR-125b-5p）-mRNA（CCR5）轴调节的 MDS 患者可能预后良好，但这还需要临床研究进一步验证。综上所述，本研究通过检索 GEO 数据库中MDS 相关数据集，进行差异分析处理，从而构建circRNA-miRNA-mRNA 网络，以期探索 circRNA在人类 MDS 的早期产生、发展演变过程中发挥的作用。circRNA（has_circ_0061137）-miRNA（has-miR-16-5p）-mRNA（RUBCNL、TBC1D9）可能是通过调节自噬，从而产生与 MDS 发生发展之间的联系。circRNA（has_circ_0061137）-miRNA（has-miR-125b-5p）-mRNA（IRF4）轴可能抑制体液免疫和细胞免疫，从而减弱其抗肿瘤作用。circRNA（has_circ_0061137）-miRNA（has-miR-125b-5p）-mRNA（CCR5）轴调节的 MDS 患者可能预后良好。然而，本研究中所有工作的具体展开全盘依托于 GEO 数据库，探讨 circRNA 在 MDS 的发展演变过程中的分子机制仍需更进一步的研究来验证。利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。参考文献Frumm SM,Shimony S,Stone RM,et al.Why do we not havemore drugs 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