间质干细胞和急性肺损伤.pptx

Mesenchymal Stem Cells and Acute Lung Injury 间质干细胞及急性肺损伤间质干细胞和急性肺损伤第1页ARDS was first recognized in the 1960s1 as a clinical syndrome of severe acute respiratory failure presenting with hypoxemia and bilateral pulmonary infiltrates,most often in the setting of pneumonia,sepsis,or major trauma.lARDS最初在1960年，被人们认识为严重急性呼吸衰竭临床综合征；l血氧不足和双边肺浸润，通常继发于肺炎、败血症、或严重创伤；间质干细胞和急性肺损伤第2页distinction between(ALI)and ARDS relates to the severity of hypoxemia,with the former having a PaO2/FiO2 of less than 300,the latter with a PaO2/FiO2 of less than 200.lung endothelial injury,alveolar epithelial injury,the accumulation of protein-rich fluid、cellular debris in the alveolar spacel急性肺损伤(ALI)和ARDS区分主要指血氧不足严重程度，前者有PaO2/FIO2小于300;l后者PaO2/FIO2不足200;lALI/ARDS发病机制包括肺血管内皮损伤,肺泡上皮损伤,富含蛋白质液体增加和肺泡腔内细胞残骸.间质干细胞和急性肺损伤第3页流行病学流行病学l年,大约00名患者在美国发展为lALI/ARDS,预计有40%死亡率。l采取肺保护性通气时代,死亡率下降大约25%。l In,approximately 200,000 pts in the United States lALI/ARDS,with an estimated mortality of 40%.l In the era of lung protective ventilation,mortality has declined to approximately 25%.间质干细胞和急性肺损伤第4页l大量临床试验,药品治疗吸入表面活性剂（inhaled surfactant）、一氧化氮（nitric oxide）、前列环素（prostacyclins）,糖皮质激素（glucocorticoids）,抗氧化剂（antioxidants）,酮康唑（ketoconazole）并非ALI治疗标准；lALI肺泡病理生理，任何单一分子不可能逆转综合症过程，使临床获益；l reverse the course of this syndrome、provide substantial clinical benefit.间质干细胞和急性肺损伤第5页l细胞为基础疗法 cell-based therapies l能产生炎症分子 moleculesl调整炎症反应 modulate inflammatory cascades l增强修复 enhance repair l间充质干细胞可能是理想选择 Mesenchymal Stem lCells 间质干细胞和急性肺损伤第6页间充质干细胞间充质干细胞:普通属性普通属性l间充质干细胞(msc)lself-renewing isolated from bone marrow differentiate into muscle,bone,fat,fibroblasts,and cartilage.l能重建造血环境 reconstitute a hematopoietic environment,regenerate bone tissue，l起初被称为成纤维细胞集落形成单位，(CFU-F)。这些细胞随即被称为骨髓基质细胞,并最终被命名为间充质干细胞。间质干细胞和急性肺损伤第7页l最近一项研究表明，依然不知道间充质干细胞是否来自中胚层,或者神经上皮,或来自不一样起源发展阶段。l普遍认为间充质干细胞不但能够从骨髓中分离，一样也能够在脂肪,脐带血,胎盘组织、肌腱和骨骼肌分离。间质干细胞和急性肺损伤第8页l国际上细胞治疗提出标准：1.粘附整形能力；l2.能够表示CD105、CD73 CD90；不能表示CD45、CD34、CD14 CD11b,lCD79a、CD19和人类白细胞抗原(HLA)II；l3.体外能分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞能力。l 间质干细胞和急性肺损伤第9页l基于分化能力，研究人员已经研究了这些细胞可能修复受损肌肉、骨骼能力。l然而，间充质干细胞拥有各种其它性能。间质干细胞和急性肺损伤第10页l1.间充质干细胞能够产生各种各样分子,包含造血因子,l趋化因子和血管生成素。l2.因为间充质干细胞存在骨髓中，他们有强大免疫调整作用。l3.间充质干细胞能够基因治疗载体,并帮助诱导l同种异体骨髓移植耐受性。l4.间充质干细胞被发觉对疾病潜伏期模型中有利效果，比如从克罗恩病创伤性脑损伤。l5.在过去十年中,一些调查人员汇报，动物模型中l间充质干细胞能够减轻一些不一样类型肺部疾病。间质干细胞和急性肺损伤第11页间充质干细胞在肺部疾病间充质干细胞在肺部疾病l在博来霉素暴露小鼠肺纤维化模型。l分离小鼠干细胞而且静脉注射，随即7天博来霉素诱导小鼠肺损伤，能够在博来霉素诱导肺损伤区域发觉外源性间充质干细胞存在，而且这些细胞含有上皮细胞特征，博来霉素肺损伤小鼠后马上采取干细胞治疗显著降低l肺内胶原蛋白沉积，降低基质蛋白酶2和9表示。间质干细胞和急性肺损伤第12页l在肺移植中 抗炎作用程度效果是处于惊人较低水平，随即报道中干细胞能够阻断博来霉素诱导增加白介素1(IL)产生。l博来霉素处理小鼠前之前是否存在白消安诱导骨髓抑制，骨髓抑制增加了初始损伤和降低生存率。间质干细胞和急性肺损伤第13页l受到绿色荧光蛋白(GFP)标识间充质干细胞治疗博来霉素受伤后6小时小鼠，改进了生存率，与绿色荧光蛋白(GFP)标识间充质干细胞能够表示成纤维细胞、肌纤维细胞以及I型和II型肺泡上皮细胞相关.间质干细胞和急性肺损伤第14页l一样试验，来自脐带干细胞，静脉注射入博来霉素小鼠诱导小鼠体内，2周后在肺部发炎部分发觉干细胞存在，干细胞能够降低胶原蛋白及细胞信号转导分子Smad2浓度，表明这些细胞已经含有抗纤维化属性。间质干细胞和急性肺损伤第15页l在支气管肺发育不良动物模型中，长久氧过多暴露老鼠气管内注入干细胞，发觉能够显著降低细胞凋亡、髓过氧化物酶活性和胶原沉积，以及炎性分子il-6、肿瘤坏死因子(TNF)。另外,少数细胞分化成II型肺泡上皮细胞。l一样试验也提醒能够提升存活率及运动耐量改进,和降低肺泡和肺血管损伤,以及肺动脉高压。l类似试验间充质干细胞气管内给药，能够降低野百合碱诱导大鼠肺动脉高压,改进血管内皮功效。间质干细胞和急性肺损伤第16页l在由辐射引发老鼠肺气肿模型中，报道称,间充质干细胞降低肺气肿形成，另外干细胞能够分化成II型肺泡上皮细胞。l所以干细胞在肺部疾病模型中有治疗作用，因为他们抗炎特征,他们会尤其适合用于急性肺损伤。l 间质干细胞和急性肺损伤第17页干细胞在急性肺损伤和脓毒症动物模干细胞在急性肺损伤和脓毒症动物模型：有利证据型：有利证据l脂多糖(LPS)被广泛用于急性肺损伤动物模型。l经过气道给予脂多糖，48小时候诱发产生大量中性粒细胞聚集到达峰值，与微血管通透性增加相关。l一些调查人员已经研究了在脂多糖诱导急性肺损伤中，干细胞作用。l研究表明，经鼻腔注入脂多糖，干细胞4小时后在外周血中显著增加。间质干细胞和急性肺损伤第18页l他们经过向受到辐照骨髓抑制小鼠，经过骨髓重建鼻内植入免疫荧光标识干细胞，3周后在肺部发觉大量免疫荧光标识干细胞。l其中一些细胞表示细胞角蛋白,上皮细胞标识,而其它细胞表示CD34,内皮细胞标识。间质干细胞和急性肺损伤第19页l这些结果表明内源性干细胞可能在脂多糖诱导急性炎症反应修复中起着主要作用。l一些试验中，低于致死剂量辐照引发骨髓抑制，鼻腔内脂多糖产生类似组织学损伤和支气管肺泡灌洗(BAL)中性细胞增多，一周后产生肺气肿表现。这些病变能够经过骨髓重建修复，表明缺乏内源性干细胞可能会破坏正常修复过程。间质干细胞和急性肺损伤第20页l在脂多糖植入气管内小鼠体内，静脉注射干细胞30分钟，3天后能够发觉显著降低肺泡灌洗液中总细胞和中性粒细胞计数。组织学分析证实显著降低炎症浸润,小叶间隔增厚,间质水肿。l另外使用荧光标识干细胞,研究人员表明许多标识细胞在损伤肺部发觉。间质干细胞和急性肺损伤第21页l腹腔内注射脂多糖1毫克/千克(使用剂量造成最小死亡率),1小时后静脉注入干细胞细胞或成纤维细胞。l组织学分析显示,干细胞,而不是成纤维细胞,能够显著降低肺部中性粒细胞在6、24和48小时后。间质干细胞和急性肺损伤第22页l间充质干细胞小鼠气管内给药，随即4小时5毫克/千克脂多糖气管内给药，（能够产生显著死亡率剂量）l干细胞治疗后小鼠改进生存l相对于PBS-治疗后老鼠:l80%和42%在48小时内,l80%对18%在72小时。间质干细胞和急性肺损伤第23页l干细胞降低肺损伤严重程度经过肺l水含量、湿/干比和BAL蛋白质浓度衡量。l在48小时内组织学分析显示更少出血和水肿。l无活性干细胞和成纤维细胞没有复制这种效果，表明未分化,有活性干细胞能够改进脂多糖诱导急性肺损伤。间质干细胞和急性肺损伤第24页l在肠杆菌肺炎模型中，这项工作得到深入证实l大肠杆菌诱导小鼠肺炎中。4个小时后,这些小鼠气管内注入干细胞、PBS,或成纤维细胞。l经过BAL中性粒细胞计数衡量，干细胞显著降低了肺部炎症。间质干细胞和急性肺损伤第25页l最近研究了盲肠结扎和穿刺(CLP)脓毒症小鼠模型。l6个小时后，干细胞或盐水输注静脉注射。全部小鼠天天都有广谱抗生素治疗。间质干细胞和急性肺损伤第26页l调查人员发觉，干细胞治疗后小鼠肺泡灌洗液细胞计数和白蛋白降低。l组织学证实28小时后降低炎症性肺部浸润,间质水肿。l干细胞治疗好处并不局限于肺部，因为干细胞治疗小鼠肾脏细胞凋亡降低,改进血清肌酐。l脓毒症造成严重全身性损伤,动物模型28小时45%死亡率。干细胞治疗改进死亡率降低50%。间质干细胞和急性肺损伤第27页l给予静脉注射(IV)干细胞或控制细胞(热-l死亡细胞或皮肤成纤维细胞)前24小时或1小时后脓毒症小鼠模型中，天天广谱抗生素治疗。l4天后显示干细胞治疗后显著生存率，干细胞治疗后老鼠也有降低血清肌酐和肾小管损伤评分,改进肝脏糖原存放,并降低转氨酶,淀粉酶、和脾细胞凋亡。表明多系统性有益。l大部分这些效应观察，是在小鼠接收干细胞治疗前24小时。间质干细胞和急性肺损伤第28页干细胞在急性肺损伤和脓毒症动物模干细胞在急性肺损伤和脓毒症动物模型型:潜在机制潜在机制l在过去几年里,调查人员检验了干细胞怎样发挥他们治疗效果在急性肺损伤和脓毒症模型中,而且发觉越来越多潜在机制。l第一位考虑原因为肺泡水肿液管理和去除。间质干细胞和急性肺损伤第29页内皮渗透性、上皮通透性和肺泡液体内皮渗透性、上皮通透性和肺泡液体间隙间隙l在肺泡水肿形成经过肺泡内皮蛋白质通透性增加，以及上皮屏障破坏，肺泡液体去除率下降。l最近几组报道,干细胞能够降低急性肺损伤内皮通透性。肺泡灌洗液中白蛋白和蛋白质含量通惯用作肺内皮通透性指标。间质干细胞和急性肺损伤第30页l研究发觉在脂多糖注入气管内3天后肺泡灌洗液中白蛋白、总蛋白和免疫球蛋白M(IgM)增加。肺损伤后干细胞静脉注射30分钟，能够减轻蛋白含量。l血管生成素可能维持血管内皮细胞处于静止状态，同时能够被证实能降低渗透性,促进内皮细胞存活。间质干细胞和急性肺损伤第31页l在未损伤老鼠中干细胞能够深入促进血管生成素降低BAL蛋白,白蛋白,IgM水平l由此推断干细胞静脉注射入肺循环中，能够促使血管生成素在血管内皮细胞中起作用，降低炎性细胞浸润,降低血浆蛋白漏到肺泡腔。间质干细胞和急性肺损伤第32页l最近报道,静脉输液干细胞注入脓毒症小鼠体内28小时能够降低肺泡灌洗液中白蛋白，表明干细胞细胞降低脓毒症内皮通透性l一些学者一些学者在相关肺炎模型中深入检测了干细胞效果，他们报道称,老鼠给与大肠杆菌气管内注射，18小时后肺泡灌洗液中白蛋白显著增加，不过损伤后4小时，气管内注射干细胞(但不包含成纤维细胞)，能够白蛋白显著降低。间质干细胞和急性肺损伤第33页l正如前面指出,测量肺泡灌洗液蛋白质能够评定肺血管内皮通透性、上皮通透性,肺水含量。l肺泡上皮细胞通常形成一个比内皮细胞更紧密屏障,急性肺损伤中失去完整性含有主要意义。l一些试验试图研究干细胞对肺泡上皮细胞影响。间质干细胞和急性肺损伤第34页l当暴露在强效炎性细胞因子(IL-1b,TNF-a,和干扰素(IFN),上皮细胞层蛋白质渗透率增加大约500%。不过当植入同种异体干细胞，蛋白质渗透性降低到控制水平。l这些发觉表明在急性肺损伤炎症反应中干细胞提升关键肺泡上皮屏障功效 间质干细胞和急性肺损伤第35页l肺泡液体去除率是肺上皮细胞去除任何原因肺泡液体,肺水肿能力。lALI/ARDS中通常是肺泡液体去除率受损与恶化结果。l很多情况下能够降低肺泡液体去除率,包含高潮气量、细菌,和促炎细胞因子l 研究发觉发觉气管内注入干细胞在急性肺损伤4小时后降低多出肺水。间质干细胞和急性肺损伤第36页l一个体外肺灌注试验，用来测试干细胞在急性肺损伤中效果。l在这个模型中,脂多糖造成肺泡液体去除率显著降低,从每小时大约20%到靠近每小时0%。l成纤维细胞滴注肺受伤1小时后，肺泡液体去除率没有影响。然而,滴注人类干细胞后肺泡液体去除率至基线水平。间质干细胞和急性肺损伤第37页l所以,得出结论干细胞似乎改进内皮/l上皮通透性和以及肺泡液体去除率。间质干细胞和急性肺损伤第38页移植移植l干细胞最初注意到分化为骨,脂肪,肌肉,和l软骨，研究人员发觉在1990年代末,在一定条件下,这些细胞能够发展为一个非中层表型。l标识干细胞融入博来霉素损伤后肺组织，表现出肺泡二型肺细胞形态学和分子特征。间质干细胞和急性肺损伤第39页l静脉注射脂多糖和静脉注入干细胞24小时后，大量标识干细胞在肺实质被发觉。l然而,2周后,极少有标识细胞存在,这表明大量存在干细胞在急性肺损伤中只是一个短暂现象。间质干细胞和急性肺损伤第40页l对小鼠每日雾化脂多糖7天,第一天灌注入干细胞。其中一些动物中,细胞能够表示Ang-1，输液后14天,标识细胞出现在肺内，不过这些细胞没有深入特征。l总而言之,数据表明,干细胞能够分化为成熟肺细胞，在急性肺损伤可能发生在低水平,但不太可能产生有益效果。间质干细胞和急性肺损伤第41页免疫调整免疫调整l干细胞一直以来证实能够抑制记忆T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞,单核细胞分化和功效。l研究表明脓毒症模型中气管内注入干细胞能够使肺泡灌洗液中促炎细胞因子TNF-a和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)2水平降低。同时有一个对应增加抗炎细胞因子il-10、IL-1ra IL-13。间质干细胞和急性肺损伤第42页l这些研究结果表明,在急性肺损伤中，干细胞能够促使肺环境从促炎到抗炎转变。l研究表明静脉注射干细胞能够延缓l脂多糖诱导急性肺损伤中血清促炎因子IFN-g IL-1b MIP-1a,KC(引发小鼠相同器官)。l脓毒症小鼠动物模型中，能够静脉注射干细胞能够降低血清TNF-al和lL-6,但在受伤 24小时后增加Il-10。间质干细胞和急性肺损伤第43页l他们还发觉,干细胞治疗能够降低过氧物酶在脂多糖诱导小鼠脓毒症肝脏和肾脏中水平,表明l中性粒细胞入侵降低和器官损伤相关。l然后,他们进行了一系列试验来帮助说明分子信号驱动这些影响。l干细胞治疗能够改进缺乏成熟T细胞和B细胞基因敲除小鼠，以及NK细胞缺点老鼠生存率。间质干细胞和急性肺损伤第44页l接下来他们耗尽小鼠单核细胞和巨噬细胞l发觉干细胞治疗不再有效,这表明这些细胞经过干细胞治疗施加有益影响。l体外试验中脂多糖刺激小鼠动物模型，干细胞被证实l增加环氧酶表示和活性，其次是增加前列腺素E2(PGE2)水平。l干细胞与巨噬细胞一起培养,脂多糖模型中发觉增加il 10。l在一系列试验中,这种效果产生被证实依靠TLR4,MyD88 TLR4 NF-kB,TNF-a和TNF受体存在 间质干细胞和急性肺损伤第45页l在额外试验中,他们发觉,巨噬细胞反应l经过EP2 PGE2和EP4受体l由此得出结论脓毒症中重组巨噬细胞分泌il 10激活干细胞,这降低了中性粒细胞迁移而且在组织中帮助减轻组织损伤。间质干细胞和急性肺损伤第46页l据报道,脂多糖诱导脓毒症24小时后,小鼠静脉治疗，多能干细胞(伤后6小时)降低血清促炎细胞因子,il-6、IL-1b KC，和趋化因子配体5(CCL5)。l血清il-10也降低了,在原先试验中这种现象相反。l当前尚不清楚为何il 10在一个试验中l增加，在另一个试验中降低,这可能与技术差异，干细胞在损伤后注入时间相关。间质干细胞和急性肺损伤第47页抗菌效果抗菌效果l这一直令人迷惑是干细胞除了能够有效抗炎效果，然而却显著改进由细菌引发败血症小鼠生存率。l一些令人兴奋最近试验表明,这似乎是因为干细胞降低细菌负担能力。l试验发觉，脓毒症小鼠模型中静脉注射脂多糖6小时后，生存率极大改进。l他们比较损伤后28小时脾脏细菌菌落数,干细胞治疗后菌落数下降一个数量级别。间质干细胞和急性肺损伤第48页下一步他们分离了小鼠腹膜内和脾脏总细胞数量或CD11b1片段(单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞)，损伤后24小时。l他们发觉干细胞治疗后总细胞数和CD11b1分数增加了革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌噬菌作用能力。l额外试验表明,干细胞本身极少从事吞噬作用,表明他们必须间接调整宿主吞噬细胞能力 间质干细胞和急性肺损伤第49页l最近报道,干细胞含有额外抗菌性。l这些研究人员首先发觉,干细胞(比较l成纤维细胞)降低大肠杆菌体外生长。间质干细胞和急性肺损伤第50页l干细胞条件培养基对革兰氏阴性细菌生长没有影响,除非这些细胞原先被大肠杆菌细胞刺激,l表明这种诱导产生抗菌物质。l他们筛选细菌刺激干细胞培养基发觉大量人类(LL-37)。l合成LL-37降低大肠杆菌和铜绿色假单胞菌生长，当与LL-37抑制性抗体同时培养时,受刺激干细胞失去了抗菌活性。l当老鼠大肠杆菌气管内注射，然后用干细胞治疗4小时后,肺泡灌洗液显示超出一个数量级降低细菌。同时使用LL-37抗体，效果却显著下降。间质干细胞和急性肺损伤第51页l总来说,结果表明细胞对细菌起到直接作用和主动调整宿主噬菌作用能力。l未来试验应该帮助说明确实切细胞和分子路径噬菌作用,和可能识别额外直接抗菌效果。间质干细胞和急性肺损伤第52页其它可能机制其它可能机制l最近一些研究也揭示了干细胞和组织细胞之间全新互动机制。l一些研究者经过使用溴化乙锭改变DNA来减弱A549细胞线粒体功效。l随即这些细胞同干细胞一起培养后，A549细胞取得了线粒体功效，这些线粒体DNA同干细胞DNA相互匹配。l延时显微镜检提醒干细胞能够逐步向A549细胞细胞质扩展，而且经过这种扩展线粒体大量转运。然而这份汇报并未确定线粒体超微结构机制转移。间质干细胞和急性肺损伤第53页l最近显示体外骨髓间充质向心脏肌细胞线粒体转移。l电子显微镜显示了极薄结构称为纳米管，线粒体似乎经过纳米管转运。线粒体是否经过囊泡、纳米管或一些其它机制转运，观察发觉干细胞能经过直接转移他们线粒体，主动挽救缺乏免疫力细胞，l显示另一个潜在有益体内作用，因为线粒体缺点是许多器官损害模型共同特征。间质干细胞和急性肺损伤第54页l微泡被各种类型细胞释放,其中包含干细胞,同时微泡最近被认为是一个主要通信机制。l胚胎干细胞已被证实经过微囊泡重组造血祖细胞DNA。l间质干细胞似乎一样释放微泡。间质干细胞和急性肺损伤第55页l最近研究表明，间质干细胞能够诱导微泡增加肾小管上皮细胞在体外增殖,使得能够抵抗肾小管上皮细胞凋亡。l接下来研究表明，在严重免疫缺点小鼠,间质干细胞及微囊泡有类似保护作用，抵抗甘油所致急性肾损伤。l在体内及体外试验中，核糖核酸酶能够消除这种这种主动效果，提醒这种效应是由间质干细胞DNA所产生。l基因芯片分析显示，间质干细胞微泡与MRNA转录、增殖、免疫细胞监管相关，间质干细胞和急性肺损伤第56页l最近试验表明,间质干细胞所诱导微泡含有小分子核糖核酸。l微泡或线粒体转移详细在急性肺损伤模型中饰演角色，依然没有确定。间质干细胞和急性肺损伤第57页前瞻研究前瞻研究l对MSC生物学功效还有待发觉。l这些细胞经过令人印象深刻和不停增加机制发挥广泛效果。l未来工作将深入说明移植、免疫调整、抗菌效果,线粒体转移,遗传信息相关贡献。l一些额外基本问题依然存在。缺乏可靠细胞表面标识极大地限制了这些细胞体内研究。l没有专门提供干细胞基因敲除老鼠、没有详细干细胞开启因子或免疫组织化学l标识,怎样在体外骨髓寻找干细胞成为一个主要问题。间质干细胞和急性肺损伤第58页l一样主要是，旁分泌因子和细胞接触独立通路与细胞接触依赖机制关系在体内能够取得多少益处。l干细胞越来越多广泛应用于临床。当前干细胞正在研究用于急性心肌细胞梗塞,扩张性心肌病、克罗恩病、慢性阻塞性肺疾病、中风、多发性硬化症、移植物抗宿主病,急性I型糖尿病l糖尿病、糖尿病足溃疡、肝硬化和免疫重建综合症在人类免疫缺点病毒间质干细胞和急性肺损伤第59页l当前全部安全统计是令人放心。然而,还未有足够干细胞临床试验，应用于急性肺损伤或脓毒症,尽管本文中概述有前途工作。很可能这一点很快就会改变。l最近评述中，可能临床试验深入将被讨论发觉。间质干细胞和急性肺损伤第60页