杜洛克和二花脸猪耳软骨组织的差异比较分析_张震.pdf

3期743杜洛克和二花脸猪耳软骨组织的差异比较分析张震1，伍仲平2，邓雅鑫1，唐军旺1，李慧1，蔡妙灵1，王丽萍1*，季久秀3*（1桂林医学院智能医学与生物技术学院，广西桂林541199；2仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州510225；3临沂大学农林科学学院，山东临沂276000）摘要：【目的】比较杜洛克和二花脸猪耳软骨组织的差异，为揭示猪外耳面积变异的分子机制提供参考。【方法】采集100日龄全同胞雄性杜洛克（n=5）和二花脸（n=5）猪外耳软骨组织进行石蜡切片及HE染色和Masson三色染色，对比两者结构上的区别；体外分离培养耳软骨细胞，使用CCK8法检测其增殖能力；联合转录组测序，比较二花脸（n=3）和杜洛克（n=3）耳软骨组织中基因表达的差异，筛选影响软骨生长相关的基因并使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行验证。【结果】HE染色和Masson三色染色结果显示，与杜洛克相比，二花脸耳软骨细胞形成更多的由28个细胞组成的同源细胞群，软骨组织中含有更多的弹性纤维。细胞增殖检测试验表明，二花脸耳软骨细胞在体外培养36、48和60 h后增殖速率显著大于杜洛克（PA）为因果突变。Duan等（2013）进一步研究表明PPARD G32E突变是一个功能缺失突变，该突变改变了PPARD蛋白的亚细胞定位和翻译后修饰水平，从而降低其对靶基因的转录激活能力。PPARD激活后加速软骨干细胞的凋亡，并刺激软骨细胞的终末分化（Zhang et al.，2017）。Li等（2012）在白色杜洛克与二花脸杂交F2代群体中利用微卫星标记鉴别到HMGA2基因为5号染色体上影响二花脸外耳面积的重要基因。高迁移率蛋白HMGA2是一种转录调节因子，可显著促进软骨细胞的增殖（Richter et al.，2009，2011），通过下调间充质细胞中的Osterix表达参与骨生成（Negishi et al.，2022）。Liang等（2019）在大白东北民猪杂交群体和北京黑猪群体中还发现WIF1基因c.1167CG是5号染色体上另一个与猪耳大小相关的重要突变。WIF1蛋白是一种Wnt信号通路抑制剂，其通过与Wnt蛋白结合，从而阻断Wnt信号传导途径（Hsieh et al.，1999）。WIF1蛋白N末端包含WIF结构域和5个表皮生长因子样（Epidermal growth factor-like，EGF）重复序列，与骨细胞合成代谢相关（Krause and Gregory，2012），特别是抑制成骨细胞分化（Morimoto et al.，2017）。此外，MSRB3、LEMD3和GRIP1等基因也被报道与猪外耳面积变异相关（Chen et al.，2018；Xu et al.，2020）。【本研究切入点】影响杜洛克和二花脸外耳大小的主效基因或突变位点虽已部分阐明，但杜洛克son trichrome stainings revealed that compared to Duroc，Erhualian ear chondrocytes formed more isogenous groups con-sisting of 2-8 cells，and the cartilage tissues contained more elastic fibers.The cell proliferation ability testing demon-strated that the proliferation rate of Erhualian ear chondrocytes was significantly higher than that of Duroc after 36，48，and 60 h of in vitro culture（PA位点进行基因型判定。另一部分软骨组织放入液氮中速冻，用于后期组织RNA提取。1.2耳软骨组织的切片及染色取出置于4%中性多聚甲醛中固定72 h的耳软骨，流水冲洗4 h后用剪刀将软骨修整成正方形小块进行切片。于酒精中逐级脱水后置于二甲苯中进行组织透明，浸蜡包埋后切片，切片厚度为5 m。切片经HE染色后用中性树脂封固。Masson三色染色法依次经Weigert苏木素、Masson、磷钼酸、苯胺蓝和冰醋酸处理后，用中性树脂封片，在显微镜（NikonECLIPSE Ti）下进行观察拍照。1.3耳软骨细胞的分离培养和生长曲线测定使用型胶原酶（北京索莱宝科技有限公司）法消化100日龄杜洛克和二花脸耳软骨组织获得细胞（伍仲平等，2015），细胞培养于含有20%胎牛血清（Oricell）、1青链霉素的DMEM/F12（Gibco）完全培养基中，待细胞密度达80%左右进行传代，使用细胞计数板以104个细胞将杜洛克和二花脸耳软骨细胞接种至12孔板中。使用CCK8细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）分别在接种后第24、36、48和60 h检测耳软骨细胞的OD值（450 nm），并于培养36 h后在显微镜（Nikon E200）下观察细胞形态并拍照。1.4mRNA测序和数据处理将冻于液氮中的耳软骨组织经研磨后加入TRIzol试剂（ThermoFisher Scientific），使用氯仿异丙醇提取总RNA。确认样本RNA完整系数RIN值7.0，纯度值（28S/18S）1.0后，用于cDNA文库制备。于HiSeq 4000测序仪上进行测序，每个样本得到约25107条 Clean reads。BWA比对到猪参考基因组Sscrofa 11.1版本后，使用每百万碱基对转录序列的每千碱基读取数（Reads per kilobase per millionmapped reads，RPKM）标准化每个基因的表达量。利用DESeq2进行差异表达分析，Padj0.05、|log2FoldChange|1作为DEGs的阈值。在GeneCards（https:/www.genecards.org）进行基因信息和功能查询，使用基因本体（Gene ontology，GO）进行DEGs功能分析。Metascape（http:/metascape.org/）进行DEGs通路富集分析（Zhou et al.，2019），利用ggplot2绘制DEGs火山图、聚类热图和基因通路图。用String网站（https:/string-db.org/）分析DEGs编码蛋白的相互作用关系，combined score设定为0.4构建蛋白互作网络（Protein-protein interaction network，PPI）（Szklarczyk et al.，2021）。将String计算得到的PPI网络导入到Cytoscape3.8.0（http:/www.cytoscape.org/）中，使用CytoHubba插件计算基于拓扑和生物学属性的关键节点基因。1.5DEGs的实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证根据逆转录试剂盒（Takara）说明书方法将测序剩余的1 g总RNA逆转录成cDNA后，利用NCBIPrimer-BLAST（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）设计引物（表1）。使用生工生物工程（上海）股份有限公司合成的引物进行预试验，验证引物的有效性和特异性后进行正式试验。qRT-PCR在6个样本中检测9个基因的表达量，每个样本重复检测3次。反应体系20.0 L：cDNA 2.0 L、正向引物0.8 L、反向引物 0.8 L、2TB Green Fast qPCR Mix 10.0 L（TaKaRa）、DEPC ddH2O 6.4 L。于ABI 7900 Fast荧光定量分析仪（美国应用生物系统公司）上进行扩增。扩增程序：95 预变性30 s，95 5 s，退火和延伸30 s，进行40个循环，收集荧光数值。以ACTB为内参基因，采用标准曲线法计算8个基因相对于ACTB基因的表达量。使用GraphPad进行图形展示（https:/ 方 农 业 学 报 746小而竖立的耳型，同日龄的二花脸外耳面积远大于杜洛克（图1-A，直尺为参照物）。采集100日龄全同胞二花脸和杜洛克猪外耳软骨组织，提取表面皮肤DNA，利用PCR检测PPARD基因g.61339 GA位点进行品种鉴定，结果显示，杜洛克PPARD基因g.61339 GA突变位点等位基因型全为G，二花脸则全为A（图1-B），与预期相符，说明样品采集无误（Ren et al.，2011）。2.2杜洛克和二花脸耳软骨组织切片染色分析结果哺乳动物的耳软骨组织由细胞、基质和纤维构成。耳间质中含有大量交织分布的弹性纤维，具有较强的弹性（Visscher et al.，2019）。软骨细胞在软骨陷窝内（图2中*所示）生长和分裂的同时不断地向细胞外分泌基质，使软骨体积从内部增大，耳廓软骨的这种生长方式被称为间质生长或软骨内生长（Myers and Ateshian，2014）。由一个软骨细胞分裂形成的多个相邻细胞组成同源细胞群（Ng et al.，2012）（图2中圆圈所示），同源细胞群包含在一个大的软骨陷窝内，里面又分成数个小的陷窝，内各含一个软骨细胞。为比较杜洛克和二花脸耳软骨组织的结构差异，对同日龄杜洛克和二花脸耳软骨组织进行石蜡切片并进行HE和Masson三色染色。HE染色结果（图2-A）显示：与杜洛克相比，二花脸软骨细胞分裂形成更多的由28个细胞组成的同源细胞群。软骨细胞向四周分泌以硫酸软骨素为主的细胞外基质，硫酸软骨素是弹性纤维的重要组成部分。二花脸软骨组织同源细胞群附近着色更深，提示二花脸软骨组织内硫酸软骨素和弹性纤维含量高于杜洛克。进一步采用Masson三色染色对软骨进行染色，结果如图2-B所示，二花脸耳软骨组织中具有更多处于分裂状态的细胞，杜洛克大软骨陷窝主要以2个细胞组成，二花脸大软骨陷窝内主要由3个以上细胞组成。此外，二花脸组织中含有大量弹性纤维（图2中浅紫色条状所示），杜洛克中弹性纤维含量较少，具有较多被染色液染成绿色的胶原纤维（图2中箭头所示）。引物PrimerCOL2A1-FCOL2A1-RMMP3-FMMP3-RBGLAP-FBGLAP-RGDF5-FGDF5-RDKK1-FDKK1-RWNT10B-FWNT10B-RAXIN2-FAXIN2-RHMGA2-FHMGA2-RACTB-FACTB-R序列Sequence5-CAGGATGGGCAGAGGTATAATG-35-GAGGCAGTCTTTCAGGTCTTC-35-GTGGCAGTTTGCTCAAGTTATC-35-GGTTGTAGTAGTCTTCCAGGTATTT-35-CTCACACTGCTTGCCCTACT-35-CCGCATCATACCTGCACCTT-35-CAACACCATCACCAGCTTTATTG-35-CTTCTCCAGGGCGCTAATG-35-AGCGTTGTTACTGTGGAGAAG-35-TCTCTGACAGGTGTGAAGTCTA-35-AGTTCTCTCGGGATTTCTTGG-35-CTTGCATTTCCGCTTCAGATT-35-CTTTCCTGGAGAGGGAGAAATG-35-TGCTTTGGCTACTCGTAAAGT-35-AAATGGCCACAGCAAGTCGT-35-TGCAGTGTCTTCTCCCTTCAA-35-GACTACCTCCTGTCTGCTGAG-35-GGTTTCTGTGCCTCACTCCC-3扩增基因名称Amplified gene nameCOL2A1MMP3BGLAPGDF5DKK1WNT10BAXIN2HMGA2ACTB扩增片段（bp）Amplified fragment123971059792122110152114退火温度（）Annealing temperature585860615857586060表 1引物列表Table 1List of primers图 1100日龄杜洛克与二花脸外耳形态（A）及其PPARDg.61339 GA位点测序结果（B）Fig.1100-day-old Duroc and Erhualian external ear morpho-logy（A）and PPARD g.61339 GA site sequencingresults（B）村洛克 Duroc二花脸 ErhualianABAB3期7472.3杜洛克和二花脸耳软骨细胞的生长曲线分析结果使用酶法体外分离杜洛克和二花脸耳软骨细胞进行培养，耳软骨细胞在培养36 h后大部分均呈现典型的软骨细胞形态（梭状），贴壁较牢，但二花脸耳软骨细胞数量多于杜洛克（图3-A），提示二花脸耳软骨细胞生长更旺盛。进一步使用CCK8细胞增殖检测试剂盒对培养24、36、48和60 h后的细胞进行密度检测，结果显示二花脸耳软骨细胞在体外培养36、48和60 h时细胞数量显著多于杜洛克（P0.05，下同），增殖速率大于杜洛克（图3-B），说明二花脸耳软骨细胞增殖能力强于杜洛克。2.4杜洛克和二花脸耳软骨组织转录组差异表达分析结果为了解杜洛克和二花脸耳软骨组织基因表达的差异，采集杜洛克（n=3）和二花脸（n=3）耳软骨组织进行转录组测序，每个样本均获得超过25107条的Clean reads，经与参考基因组比对后进行差异表达分析，共筛选得到251个DEGs，其中杜洛克较二花脸上调基因165个，下调基因86个（图4和图5）。GO功能注释结果显示，杜洛克较二花脸高表达的基因最显著富集的前5个生物学过程为：骨骼系统发育（GO：0001501，skeletal system development，P=9.1810-6）、细胞外基质组成（GO：0030198，extracel-lular matrix organization，P=3.7210-5）、胶原纤维组成（GO：0030199，collagen fibril organization，P=1.1010-3）、昼夜节律（GO：0007623，circadian rhythm，P=1.9510-3）和声音感知（GO：0007605，sensory percep-tion of sound，P=7.2310-3），说明杜洛克耳软骨侧重于成骨分化，胶原纤维组成与二花脸耳软骨存在差异，与切片染色结果相符（图6-A）。二花脸较杜洛克高表达的基因最显著富集的前5个生物学过程为：细胞对维甲酸应答（GO：0071300，cellular response toretinoic acid，P=8.84 10-6）、Wnt 信 号 通 路（GO：0016055，Wnt signaling pathway，P=1.0110-4）、Wnt信号通路的负调控（GO：0030178，negative regula-tion of Wnt signaling pathway，P=9.4810-4）、经典Wnt信号通路的负调控（GO：0090090，negative regula-tion of canonical Wnt signaling pathway，P=2.2210-3）和血管生成（GO：0001525，angiogenesis，P=2.66 10-3）（图6-B）。表明二花脸耳软骨细胞内Wnt信号通路与杜洛克存在差异。图 2100日龄杜洛克与二花脸外耳软骨组织切片HE染色图（A）和Masson三色染色图（B）Fig.2HEstaining（A）andMassontrichromestaining（B）ofcartilagetissuesectionsof100-day-oldDurocandErhualianexternalears*指示软骨陷窝，圆圈指示同源细胞群，指示弹性纤维，箭头指示胶原纤维。放大倍数：400倍*indicated cartilage lacuna，circle indicated isogenous group，indicated elastic fiber，arrow indicated collagen fiber.Magnification：400 times杜洛克 Duroc二花脸 ErhualianAB张震等：杜洛克和二花脸猪耳软骨组织的差异比较分析54卷南 方 农 业 学 报 7482.5DEGs互作网络分析结果通过构建基因互作网络对DEGs进一步分析，发现251个DEGs中的27.89%（70个）位于同一个网络内（图7-A），STRING数据库显示此网络最显著富集的组织为软骨（P=0.0048），体现了明显的组织特异性。使用Cytoscape将上调基因和下调基因分别构建基因网络并进行节点基因分析，发现杜洛克较二花脸上调基因主要集中于以COL2A1为中心的网络内（图7-B），与富集的胶原纤维组成这一生物学过程相对应。与二花脸耳软骨中富含的弹性纤维相比，杜洛克耳软骨中含有更多的胶原纤维，胶原纤维会随年龄的增长交联日益增多，组织逐渐硬化。弹性纤维的弹性蛋白则通过分子间赖氨酸残基形成共价键进行相互交联，使得分子构型变化产生弹性（Irvine etal.，2018），这可能是二花脸耳软骨较杜洛克更具弹性的原因之一。二花脸猪耳软骨高量表达的基因集中于以DKK1、DKK2、DKK3、WIF1和FZD4等为中心的Wnt信号抑制通路和CYP7A1为中心的脂质代谢相关通路（图7-C）。Wnt信号通路是参与骨发育重要的信图 3杜洛克和二花脸耳软骨细胞形态和增殖曲线图Fig.3Chondrocytes morphology and proliferation curve ofDuroc and Erhualian ear cartilage细胞放大倍数：100倍；*表示差异显著（P0.05）Cell magnification：100 times；*indicated significant difference（P0.05）图 4二花脸与杜洛克耳软骨组织DEGs的火山图Fig.4Volcano plot of DEGs between Erhualian and Duroc ear cartilage tissuesAB43210OD值 OD value24364860时间（h）Time杜洛克 Duroc二花脸 Erhualian*-5-4-3-2-1012345log2Fold Change-lg Padj3525155杜洛克 Duroc二花脸 Erhualian3期749图 5二花脸与杜洛克耳软骨组织DEGs的聚类热图Fig.5Cluster heatmap of DEGs between Erhualian and Duroc ear cartilage tissues二花脸-3Erhualian-3杜洛克-1Duroc-1杜洛克-2Duroc-2杜洛克-3Duroc-3二花脸-2Erhualian-2二花脸-1Erhualian-1GroupGroup杜洛克 Duroc二花脸 Erhualian210-1-2张震等：杜洛克和二花脸猪耳软骨组织的差异比较分析54卷南 方 农 业 学 报 750图 6二花脸与杜洛克耳软骨组织DEGs富集的生物学过程Fig.6Biological processes enrichment plot of DEGs between Erhualian and Duroc ear cartilage tissuesAB246810lg P数量Count5432234567lg P数量Count543246823456细胞分化GO：0030154-cell differentiation细胞外基质组成GO：0030198-extracellutar matrix organization细胞黏附GO：0007155-cell adhesion骨骼系统发育GO：C001501-skeletal system development听觉感知GO：0007605-sensory perception of sound胶原纤维组成GO：0030199-collagen fibril organization昼夜节律GO：0007623-circadian rhythm视觉感知GO：0007601visual perception软骨发育GO：0051216-cartilage development骨发育GO：0060348-bone develapment相机型眼的发育GO：0043010-camera-type eye development对机械刺激的响应GO：0009612-response to mechanical stimulus眼发育GO：0001654-eye development软骨细胞增殖的正调控GO：1902732-positive regulstion of chondrocyte proliferation神经上皮细胞分化GO：0060563-neuroepihelial cell differentiation对维生素K的响应GO：0032571-response to vitamin K肽基赖氨酸氧化GO：0018057-peptidyl-lysine oxidalion儿茶酚胺代谢过程GO：0006584-catecholamine metabolic process天冬氨酸代谢过程GO：0006531-aspartate metabolic process蛋白聚糖代谢过程GO：0006029-proteoglycan metabolic processWnt信号通路GO：0016055-Wnt signaling pathway基因表达的正调控GO：0010628positive regulation of gene expression对维甲酸的细胞应答GO：0071300-cellular response to retinoic acid血管生成GO：0001525angiogenesis经典Wnt信号通路的负调控GO：0090090-negative regulation of canonical Wnt signaling pathway-炎症反应的正调控GO：0050729-positive regulation of inflammatory response胆固醇稳态GO：0042632-cholesterol homeostasis上皮细胞增殖GO：0030855-epithelial cell differentiationWnt值号通路的正调控GO：0030178-negative regulation of Wnt signaling pathway受体活性的负调控GO：2000272-negative regulation of receptor activity骨的形态生成GO：0060349-bone morphogenesis上皮细胞增殖的正调控GO：0050679-positive regulation of epithelial cell proliferation脂肪细胞分化的正调控GO：0045600-positive regulation of fat cell differentiation牙形成GO：0042476-odontogenesis-蛋白质不稳定GO：0031648-protein destabilization骨的矿化GO：0030282-bone mineralizationWnt信号通路的正调控GO：0030177-positive regulation of Wnt signaling pathway昼夜节律GO：0007623-circadian rhythm年龄相关行为衰退的调节GO：0090647-modulation of age-related behavioral decline中耳的形态发生GO：0042474-middle ear morphogenesis成骨细胞的增殖GO：0033687-osteoblast proliferation-胚胎上皮细胞的形态发生GO：0016331-morphogenesis of embryonic epithelium3期751号通路之一（Maeda et al.，2019），与成骨细胞分化和多种骨骼疾病相关（Kubota et al.，2009；Huybrechtset al.，2020）。研究表明DDK1可保持软骨细胞分裂、促进细胞外基质的分泌和抑制软骨细胞肥大（Leijten et al.，2012），WIF1抑制成骨细胞分化、碱性磷酸酶的活性和组织矿化（Martnez-Gil et al.，2022）。ABCA1可促进软骨细胞的胆固醇外流，从而避免脂质沉积，对软骨细胞具有保护作用（王婧等，2021），提示Wnt信号抑制后二花脸软骨细胞成骨分化能力减弱，增殖能力增强（马玉新和祝颂松，2013）。2.6DEGs的qRT-PCR验证结果为验证上述结果，选取8个基因设计引物进行qRT-PCR验证，这些基因与胶原纤维组成、成骨发育及Wnt信号通路有关（表2）。结果显示，COL2A1、MMP3、BGLAP和GDF5在杜洛克耳软骨组织中的表达量显著或极显著（P0.01，下同）高于二花脸，DKK1、WNT10B、AXIN2和HMGA2则在二花脸耳软骨组织中的表达量显著或极显著高于杜洛克（图8）。3讨论本研究通过比较100日龄杜洛克和二花脸耳软骨组织基因表达差异，发现杜洛克耳软骨组织相较于二花脸更侧重于成骨分化。杜洛克耳软骨中高量表达的基质金属蛋白酶3（MMP3）对软骨基质具有降解作用；骨-羧谷氨酸蛋白（BGLAP）与钙和羟基磷灰石结合，促进骨的矿化；生长分化因子5（GDF5）则通过与NOG相互作用促进软骨分化。二花脸外图 7差异表达基因的互作网络图（A）、上调基因中节点基因的互作网络图（B）和下调基因中节点基因的互作网络图（C）Fig.7Interactionnetworkofdifferentiallyexpressedgenes（A），interaction network of up-regulated node genes（B），interactionnetwork of down-regulated node genes（C）ABC张震等：杜洛克和二花脸猪耳软骨组织的差异比较分析54卷南 方 农 业 学 报 752耳软骨组织中Wnt信号通路抑制基因DKK1、DKK2、DKK3、WIF1和FZD4等高量表达，Wnt信号强度受到负调控。梁晶（2015）在大白和二花脸2个品种中也检测到WIF1的表达差异，提示Wnt信号通路在导致家猪外耳面积增大过程中发挥重要作用。另外，本研究还鉴别到另一个主效基因HMGA2表达量在二花脸耳软骨中高于杜洛克。HMGA2是一个保守蛋白，与人类身高和家猪体型大小相关（Chung et al.，2018），HMGA2可促进软骨细胞增殖（Negishi et al.，2022）。AXIN2（Dao et al.，2010）、WNT10B（Hu et al.，2022）基因则刺激二花脸外耳软骨的生长。这些结果为猪外耳面积变异的分子机制研究提供了线索。家猪外耳面积变异丰富，小耳型的有滇南小耳猪和五指山猪等，大耳型的有河套大耳猪和二花脸猪等，这不仅为遗传解析提供了良好材料，同时也是医用模型的重要来源（Lunney et al.，2021）。猪的耳软骨微观结构与人类非常接近，医学上软骨组织修复中的种子细胞要求取材方便，具有较强的增殖传代潜能，与载体材料接种后仍能维持较好的增殖活性（Chiu et al.，2017）。异体软骨细胞与自体软骨细胞、骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞等相比，具有来源广泛、不给病人带来额外创伤等优点。温叶飞（2004）对34周的关中黑猪耳软骨细胞进行分离培养，并对组织工程软骨体外构建的技术方法进行初步探索；Kamil等（2004）尝试使用猪耳软骨进行喉气管重建；伍仲平等（2016）在体外培养猪耳软骨细胞时，发现在10代以内未丧失软骨细胞特性且还含有少量的软骨前体细胞；周经（2020）分离猪耳软骨细胞接种于支架上使用3D打印技术进行软骨组织的重建。本研究发现二花脸较杜洛克耳软骨细胞中具有更多分裂旺盛的细胞，体外增殖能力也显著强于杜洛克，提示二花脸耳软骨细胞可作为组织工程种子细胞的潜在来源。4结论本研究通过组织化学染色、体外培养和转录组测序比较了杜洛克和二花脸外耳软骨的结构、细胞增殖情况和基因表达差异，发现二花脸耳软骨细胞具有更加旺盛的增殖分裂能力；杜洛克耳软骨更倾向于成骨分化，通过MMP3、BGLAP和GDF5等基因图 8与胶原纤维组成、成骨发育及Wnt信号通路相关基因的qRT-PCR验证结果Fig.8qRT-PCR validation results of genes related to collagen fiber composition，osteogenesis and Wnt signaling pathway*表示差异显著（P0.05），*表示差异极显著（P0.01）*indicated significant difference（P0.05），*indicated extremely significant difference（P0.01）表 2qRT-PCR验证的杜洛克和二花脸耳软骨组织的DEGS及其功能Table 2DEGS and their functions in cartilage tissues of Duroc and Erhualian verified by qRT-PCR基因 GeneCOL2A1MMP3BGLAPGDF5DDK1WNT10BAXIN2HMGA2基因功能 Gene function编码II型胶原的-1链，对骨骼的正常发育具有重要作用编码一种降解纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原III、IV、IX和X以及软骨蛋白聚糖的酶与钙和羟基磷灰石结合，参与骨的矿化通过与NOG的相互作用促进软骨分化该基因是Wnt信号通路的抑制剂，在骨形成中发挥重要作用，并有抗凋亡活性可加速骨生长促进骨生长，抑制软骨细胞肥大促进猪软骨细胞增殖相对表达量 Relative expression level2.52.01.51.00.50.0*杜洛克 Duroc二花脸 Erhualian基因 GeneCIL2A1MMP3BGLAPGDF5DKK1WNT10BAXIN2AMGA23期753诱导细胞外基质降解和成骨分化过程；二花脸耳软骨组织中Wnt信号通路受到负调控，通过HMGA2、WNT10B和AXIN2等基因促进二花脸耳软骨细胞的增殖及耳软骨的生长。致谢：感谢赣南医学院段艳宇副教授对本试验的指导和帮助，感谢南京农业大学李平华研究员和微猪信息科技有限公司张佳博士在试验材料收集过程中的帮助。参考文献：梁晶.2015.猪耳面积性状全基因组关联分析及主效基因探索 D.北京：中国农业科学院.Liang J.2015.Genome-wide association studies for porcine ear size and explora-tion of major genes D .Beijing：Chinese Academy of Agri-cultural Sciences.doi：10.7666/d.Y2787357.马玉新，祝颂松.2013.Wnt信号通路与软骨细胞增殖分化关系的研究现状 J.临床口腔医学杂志，29（11）：699-700.Ma Y X，Zhu S S.2013.Research status of the rela-tionship between Wnt signaling pathway and chondro-cyte proliferation and differentiation J.Journal of Clini-cal Stomatology，29（11）：699-700.doi：10.3969/j.issn.1003-1634.2013.11.026.王婧，薛松，马金忠.2021.细胞代谢与骨关节炎发生发展的研究进展 J.中国骨与关节杂志，10（12）：920-925.Wang J，Xue S，Ma J Z.2021.Research progress of cellmetabolism and osteoarthritis development J.ChineseJournal of Bone and Joint，10（12）：920-925.doi：10.3969/j.issn.2095-252X.2021.12.009.王小林，杨美蓉，王长琛，张晔，潘博.2018.综合征小耳畸形基因学研究进展 J.中国优生与遗传杂志，26（4）：9-11.Wang X L，Yang M R，Wang C C，Zhang Y，Pan B.2018.Advances in the etiology of microtia syndrome J.Chinese Journal of Birth Health&Heredity，26（4）：9-11.doi：10.13404/ki.cjbhh.2018.04.004.温叶飞.2004.耳廓软骨细胞生物学特性研究及组织工程软骨的体外构建初探 D.杨凌：西北农林科技大学.Wen Y F.2004.Biological characteristics of chondro-cytes from auricular cartilage and reconstruction of engi-neering cartilage in vitro D.Yangling：Northwest AFUniversity.伍仲平，张震，张慧，段艳宇.2016.猪耳廓软骨板细胞的体外传代培养 J.农业生物技术学报，24（6）：799-805.WuZ P，Zhang Z，Zhang H，Duan Y Y.2016.In vitro subcul-ture of cartilage cells of pig（Sus scrofa）auricle J.Jour-nal of Agricultural Biotechnology，24（6）：799-805.doi：10.3969/j.issn.1674-7968.2016.06.003.周经.2020.软骨脱细胞基质材料构建软骨组织的应用策略研究 D.北京：北京协和医学院.Zhou J.2020.Theapplication strategy for extra cellular matrix in tissue en-gineering D.Beijing：Peking Union Medical College.doi：10.27648/ki.gzxhu.2020.000233.Chen C Y，Liu C L，Xiong X W，Fang S M，Yang H，Zhang ZY，Ren J，Guo Y M，Huang L S.2018.Copy number varia-tion in the MSRB3 gene enlarges porcine ear size througha mechanism involving miR-584-5p J.Genetics Selec-tion Evolution，50（1）：72.doi：10.1186/s12711-018-0442-6.Chiu L L Y，Giardini-Rosa R，Weber J F，Cushing S L，Wald-man S D.2017.Comparisons of auricular cartilage tis-sues from different species J.The Annals of Otology，Rhinology，and Laryngology，126（12）：819-828.doi：10.1177/00034894177