非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓...刺激雏鸡脾脏的转录组学分析_吴绿怡.pdf

54卷南 方 农 业 学 报 774非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫刺激雏鸡脾脏的转录组学分析吴绿怡，刘思勤，廖艳鹏，任超*（天津农学院动物科学与动物医学学院/天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津300384）摘要：【目的】探究非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫（NRTUAs）感染雏鸡脾脏的转录组学变化，明确NRTUAs对雏鸡脾脏先天性免疫的调节效果，为研发家禽抗弓形虫疫苗提供理论依据。【方法】分别以NRTUAs和磷酸盐缓冲液（PBS）感染14日龄雏鸡，感染后第3 d采集脾脏组织样品进行转录组测序，筛选出NRTUAs组与PBS组间的差异表达基因（DEGs），然后进行GO功能注释、KEGG信号通路富集及蛋白调控网络分析，并通过实时荧光定量PCR验证转录组测序的准确性。【结果】与PBS组相比，从感染NRTUAs的雏鸡脾脏中筛选出499个DEGs（286个为上调DEGs，213个为下调DEGs），且NRTUAs组中上调表达的DEGs多于下调表达的DEGs。GO功能注释分析发现，DEGs注释在生物过程（Biological process，BP）、细胞组分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）三大类别的58个功能条目上，主要涉及端粒蛋白定位建立正调控、蛋白稳定、含伴侣蛋白T复合物、内质网腔、内质网、内质网膜组成部分、纺锤中央区及未折叠蛋白结合等功能条目；KEGG信号通路富集分析显示，DEGs主要富集在内质网蛋白加工通路、RNA转运、细胞周期、钙信号通路、黏着斑、细胞衰老、神经活性配体受体相互作用、细胞因子细胞因子受体相互作用通路及氨基酸生物合成等通路中；蛋白互作网络分析结果表明，DEGs编码蛋白PLK1、CCNB1、CDK1、CDC20、CCNA2和NDC1均在细胞周期通路上调表达。实时荧光定量PCR验证结果显示，只有2个DEGs（CXCL12和VPREB3）呈上调表达，其余8个DEGs呈下调表达，与转录组测序结果基本一致。【结论】感染NRTUAs后雏鸡脾脏免疫相关基因表达上调，且多数DEGs富集在内质网蛋白合成与细胞周期等相关信号通路上，脾脏细胞活动明显增强，即通过加快建立细胞连接及启动先天性免疫反应而积极对抗弓形虫入侵。关键词：非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫；雏鸡；转录组学；脾脏；免疫中图分类号：S852.729文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）03-0774-10收稿日期：2023-01-11基金项目：国家自然科学基金项目（31902277）通讯作者：任超（1986-），https:/orcid.org/0000-0002-1994-6876，博士，主要从事兽医免疫学与寄生虫学研究工作，E-mail：第一作者：吴绿怡（1998-），https:/orcid.org/0009-0005-6113-2490，研究方向为禽寄生虫病学与家禽免疫学，E-mail：南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（3）：774-783ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.03.013Transcriptome analysis of chick spleens stimulated bynonreplicating Toxoplasma uracil auxotrophsWU L-yi，LIU Si-qin，LIAO Yan-peng，REN Chao*（College ofAnimal Science and Veterinary Medicine，TianjinAgricultural University/Tianjin Key Laboratory ofAgricul-turalAnimal Breeding and Healthy Husbandry，Tianjin 300384，China）Abstract：【Objective】The purpose of the study was to explore the transcriptomic changes of chick spleens infectedby nonreplicating Toxoplasma uracil auxotrophs（NRTUAs），to clarify the regulatory effect of NRTUAs on the innate im-munity in chick spleens，so as to provide theoretical basis for the development of anti-Toxoplasma gondii vaccine in poul-try.【Method】14-day-old chickens were infected with NRTUAs and phosphate buffer saline（PBS）respectively.3 d afterinfection，spleen tissue samples were collected for transcriptome sequencing，and differentially expressed genes（DEGs）between NRTUAs and PBS groups were screened.Then GO functional annotation，KEGG signaling pathway enrichmentand protein regulatory network analysis were performed.The accuracy of transcriptome sequencing was verified by real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】Compared with PBS group，there were 499 DEGs（286 were up-regulatedDEGs and 213 were down-regulated DEGs）screened from the chick spleens infected with NRTUAs，and the NRTUAsgroup had more up-regulated DEGs than down-regulated DEGs.GO functional annotation analysis found that DEGs was3期7750引言【研究意义】弓形虫病是常见的人畜共患寄生虫病。自1939年首次报道鸡感染弓形虫以来，在全球范围内陆续发现大规模感染鸡群的病例（Dubey，2010）。鸡作为弓形虫重要的中间宿主，在一些人类感染率较高的地区常作为哨兵动物用于土壤弓形虫包囊监测，尤其是长期在户外活动的散养鸡群习惯从地面啄食，极易接触并感染弓形虫，而存在通过食物链感染人类的风险（Dubey et al.，1998；Fernandes etal.，2016；柳立新等，2022）。至今，除了可防止绵羊流产的疫苗Toxovax外，尚未研发出能有效预防人类及家禽感染弓形虫的疫苗（Innes et al.，2019）。非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫（NonreplicatingToxoplasmauracil auxotrophs，NRTUAs）即同时敲除乳清酸核苷-5-单磷酸脱羧酶基因（Orotidine-5-monophosphate decarboxylase，ompdc）和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因（Uridine phosphorylase，up），可有效阻断弓形虫嘧啶合成与补救途径。NRTUAs在缺失尿嘧啶的细胞中无法增殖，且在小鼠体内会被快速清除，是一种较安全的疫苗株（Fox and Bzik，2002）。因此，探讨NATUAs对鸡的免疫调节效果，可为禽用抗弓形虫疫苗的开发及临床应用提供理论依据。【前人研究进展】NRTUAs在哺乳动物体内无法增殖，但可入侵哺乳动物细胞并形成纳虫泡（Fox et al.，2013，2017）。作为一种潜在的免疫调节剂，NRTUAs已丧失毒力，无致病性，即使在不产生IFN-或缺乏T细胞、B细胞和NK细胞的免疫缺陷动物中也能安全耐受，不会造成肝功能损伤（Fox and Bzik，2010；Bairdet al.，2013a）。单次低剂量接种NRTUAs可迅速产生一种CD8+T细胞依赖的终生保护性免疫，对抗弓形虫的再次入侵（Gigley et al.，2009）。弓形虫优先入侵髓样细胞，如树突状细胞和单核/巨噬细胞，接种NRTUAs后同样可观察到髓样细胞的优先靶向性，且被NRTUAs入侵的髓样细胞表现为免疫激活状态。小鼠在接种NRTUAs后通过抗原递呈细胞刺激保护性的CD8+T细胞依赖性免疫和体液免疫，提高宿主免疫力，从而发挥NRTUAs抗弓形虫感染的作用（Sanders et al.，2015）。此外，NRTUAs可能是一种可用于癌症治疗的安全疫苗。接种NRTUAs后，卵巢癌小鼠、黑色素瘤小鼠和胰腺癌小鼠的血清IL-12p40和IL-12p70均显著增加（Baird et al.，2013b）。NRTUAs治疗IL-12p40或IL-12p35基因敲除小鼠时则失去抗肿瘤作用，表明NRTUAs激活髓样细胞产生IL-12是抗肿瘤反应的关键（Bahwal et al.，2022）。综上所述，NRTUAs是潜在的优秀抗弓形虫疫苗株。【本研究切入点】至今，有关弓形虫感染小鼠、猪、猫等哺乳动物的转录组学研究已有较多报道（Cong et al.，2018；He et al.，2019；Warunek et al.，2021；Wang etal.，2022a），但弓形虫感染家禽的转录组学研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过转录组测序技术分析NRTUAs感染对雏鸡脾脏转录组学的影响，挖掘重要信号通路及差异表达基因（Differentially expressedgenes，DEGs），明确NRTUAs对雏鸡先天性免疫的调节效果，为研发家禽抗弓形虫疫苗提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1日龄罗曼蛋鸡购自天津市进华养殖场，健康状况良好。预试验检测蛋鸡各器官的荷虫量以确定是否感染弓形虫，计算结果显示各处理组鸡只脾脏荷虫量均为零，即未感染过弓形虫，可进行后续试验（任超等，2021）。NRTUAs虫株和Vero细胞均由中国农业大学国家动物原虫实验室保存并提供。annotated on 58 functional items in three major categories of biological process（BP），cellular component（CC）and mo-lecular function（MF）.They mainly involved functional entries of positive regulation of establishment of protein localiza-tion to telomere，protein stabilization，chaperonin-containing T-complex，endoplasmic reticulum lumen，endoplasmicreticulum，integral component of endoplasmic reticulum membrane，spindle midzone and unfolded protein binding.KEGGsignaling pathway enrichment analysis showed that DEGs were mainly enriched in endoplasmic reticulum protein proces-sing pathway in endoplasmic reticulum，RNA transport，cell cycle，calcium signaling pathway，focal adhesion，cellularsenescence，neuroactive ligand-receptor interaction，cytokine-cytokine receptor interaction pathway and amino acidbiosynthesis pathways.The results of protein interaction network analysis showed that the expression of DEGs codingproteins PLK1，CCNB1，CDK1，CDC20，CCNA2 and NDC1 were up-regulated in the cell cycle pathway.Real-timefluorescence quantitative PCR verification results showed that 2 DEGs（CXCL12 and VPREB3）were up-regulated，andthe other 8 DEGs were down-regulated，which basically conformed with the transcriptome sequencing results.【Conclu-sion】The expression of immune-related genes is up-regulated in chick spleens infected with NRTUAs，and most of DEGsare enriched in the related signaling pathways of endoplasmic reticulum protein synthesis and cell cycle.The activity ofspleen cells is greatly enhanced，which is to accelerate the establishment of cell connections and initiate the innate im-mune response to actively fight against the invasion of T.gondii.Key words：nonreplicating Toxoplasma uracil auxotrophs；chick；transcriptomics；spleen；immunityFoundation items：National Natural Science Foundation of China（31902277）吴绿怡等：非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫刺激雏鸡脾脏的转录组学分析54卷南 方 农 业 学 报 7761.2NRTUAs培养与收集通过在Vero细胞中连续传代以维持NRTUAs的速殖子。Vero细胞接种至添加2%胎牛血清（FBS）的DMEM完全培养基中，置于37、5%CO2恒温培养箱中培养，每隔24 h更换1次培养基。采用5 mL注射器数次抽取培养液使培养物分离，再用1 mL注射器小心破碎Vero细胞，使弓形虫速殖子释放至胞外，以5 m孔聚碳酸酯膜过滤去除Vero细胞，即获得纯化的速殖子（张晓，2018）。1.3NRTUAs感染雏鸡将1日龄雏鸡随机分为2组（NRTUAs组和PBS组），每组3羽，每组单独饲养，雏鸡可自由饮水进食；饲养至14日龄，鸡只状态良好，平均体重13510 g。NRTUAs组每只雏鸡颈部皮下注射0.2 mL的弓形虫速殖子悬液（5106个/mL），PBS组于颈部皮下注射等量的磷酸盐缓冲液（PBS）。每日监测雏鸡的临床症状，在感染后第3 d对各组雏鸡进行称重及剖检。1.4雏鸡脾脏组织转录组测序感染后第3 d采集NRTUAs组和PBS组雏鸡的脾脏，每组采集3份脾脏样品，且确保脾脏样品合格（不降解），干冰低温保存送至北京百迈客生物科技有限公司，通过Illumina NovaSeq 6000平台完成转录组测序，包括样品检测、cDNA文库构建、质检及上机测序。1.5雏鸡脾脏转录组序列组装及DEGs筛选脾脏组织总RNA为输入材料，质检合格后构建cDNA文库，基于边合成边测序（Sequencing by syn-thesis，SBS）获得的原始数据首先需要确保Reads质量，通过去除含有接头、低质量的Reads获得高质量的Clean reads，以保证后续分析的准确性。使用HI-SAT2（v2.0.4）分别将各样品的Clean reads与指定参考基因组进行序列比对，评估转录组文库质量，再根据比对结果通过ASprofile进行可变剪接预测、基因结构优化分析及新基因发掘，最后根据基因在不同样品中的表达差异筛选出DEGs。1.6DEGs的GO功能注释、KEGG信号通路富集及蛋白调控网络分析通过BLAST和KOBAS 2.0分别对筛选获得的DEGs进行GO功能注释分析及KEGG信号通路富集分析，同时以HMMER在Pfam数据库中进行氨基酸序列比对分析，获得DEGs编码蛋白的注释信息。以FPKM为衡量转录本或基因表达水平指标计算基因表达量，采用Heatmap进行聚类分析，再以DEGseq2（v1.6.3）分析有生物学重复的DEGs样本。差异表达分析结果导入STRING数据库进行互作关系比对，最后将构建完成的蛋白互作网络数据导入Cytoscape进行可视化处理。1.7实时荧光定量PCR验证根据转录组测序筛选获得的DEGs，提取各组感染后第3 d的脾脏总RNA，检测合格后反转录合成cDNA，进行实时荧光定量PCR验证，扩增引物如表1所示。实时荧光定量PCR反应体系20.0 L：2qPCRMix 10.0 L，上、下游引物（2.5 mol/L）各1.0 L，cDNA模板1.0 L，Nuclease-Free Water 7.0 L。扩增程序：95 预变性30 s；95 15 s，60 30 s，进行40个循环；65 升温到95，每升温0.5 采集1次荧光信号，以鸡GAPDH基因为内参基因，通过2-Ct法换算目的基因相对表达量，采用t检验进行差异显著性分析，并以GraphPad Prism（v8.0.2）制图。2结果与分析2.1雏鸡脾脏转录组测序结果通过Illumina NovaSeq 6000完成6份雏鸡脾脏样品的转录组测序，过滤低质量的Reads后共获得40.02 G的Clean reads，每份样品的Clean reads均在5.89 G以上。NRTUAs组和PBS组Clean reads的Q20在98.00%以上、Q30在94.50%以上，且各样品的Clean reads与指定参考基因组的序列比对匹配率在83.80%86.60%，说明转录本数据可靠、质量高，可用于后续分析。2.2雏鸡脾脏DEGs筛选结果为发掘影响雏鸡感染NRTUAs后脾脏转录组的关键基因，通过与参考基因组Gallus_gallus.GCF_016700215.1.genome.fa进行比对，以Fold Change1.0且FDR0.05为筛选标准，结果在NRTUAs组与PBS组间共筛选到499个DEGs，其中286个DEGs呈上调表达、213个DEGs呈下调表达。对筛选出的DEGs进行层次聚类分析，结果表明，DEGs在PBS组和NRTUAs组中具有类似的功能或参与相同的生物学过程，如图1-A所示。由图1-B和图1-C可看出，DEGs在PBS组与NRTUAs组间的分布存在明显差异，NRTUAs组中上调表达的DEGs多于下调表达的DEGs；除已知名称的基因外，新基因Gallus_gal-lus_newGene_2767在上调DEGs中的表达量最高，而新基因Gallus_gallus_newGene_2572在下调DEGs中的表达量最高。2.3DEGs的GO功能注释分析结果GO功能注释分析发现，DEGs注释在生物过程（Biological process，BP）、细胞组分（Cellular compo-3期777nent，CC）和分子功能（Molecular function，MF）三大类别的58个功能条目上，注释到的DEGs数量471个，其中上调基因269个、下调基因202个。DEGs在生物过程的端粒蛋白定位建立正调控（Positive regula-tion of establishment of protein localization to telo-mere）和蛋白稳定（Protein stabilization）功能条目上显著富集；在细胞组分的含伴侣蛋白T-复合多肽（Chaperonin-containing T-complex）、内质网腔（En-基因名称GeneGAPDHIFNGCCL26GVINP1TNFRSF13BVPREB3GNLYRF1STAT1BATF3SERPINB1引物序列Primer sequenceF：5-CTGGGGCTCATCTGAAGGGT-3R：5-GGACGCTGGGATGATGTTCT-3F：5-AAGCTCCCGATGAACGACTTG-3R：5-TTGCATCTCCTCTGAGACTGGC-3F：5-AACTGCTGGATTCAGATGGCCTA-3R：5-CATTTGCTGCTGGTGATGTAGG-3F：5-GATGTCTTTGGGCAGGAGTGAG-3R：5-TTCCTCTCTAGCAGTGACCCTTG-3F：5-AAGGATCACCTGGTGGAAGC-3R：5-GCATATCCCGGTGTGAGAGG-3F：5-CTACCAAAGACCTCGTCCACAA-3R：5-GGCAGTGAGCAGAAATAGCGAC-3F：5-ATGGTTCAGCTGCGTGGGAT-3R：5-ACCCACAATCTTCTGCACCTTC-3F：5-ACAAAGGACCAGAAGAAGGAAAGG-3R：5-GAGTGCTGGTTAGTCGTTCTGCT-3F：5-TCACTTCCCATCATTGTCATCTCT-3R：5-AATTCTTGGGATCAGTAGACAGCA-3F：5-CGTCCTCACTCCAATGAACCC-3R：5-TCTCCTCCTTACCTTCTTATCGTCTT-3F：5-TTTATCAGCTATGGGCTTGTTGG-3R：5-TTTATCAGCTATGGGCTTGTTGG-3扩增长度（bp）Amplification length3081251061921868811012197144134退火温度（）Annealing temperature6060606060606060606060表 1实时荧光定量PCR扩增引物序列信息Table 1Real-time fluorescence quantitative PCR amplification primer sequence information图 1DEGs的聚类分析热图（A）、MA图（B）及火山图（C）Fig.1Cluster heatmap（A），MAplot（B）and volcano plot（C）of DEGs43210-1Significant上调 Up正常 Normal下调 Downlg FPKM-101234Significant上调 Up正常 Normal下调 DownABClog2Fold Change210-1-2-lg FDRlog2Fold Change20151050-202PBS-1PBS-2PBS-3NRTUAs-1NRTUAs-2NRTUAs-3吴绿怡等：非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫刺激雏鸡脾脏的转录组学分析54卷南 方 农 业 学 报 778doplasmic reticulum lumen）、内质网（Endoplasmicreticulum）、内质网膜组成部分（Integral componentof endoplasmic reticulum membrane）、纺锤中央区（Spindle midzone）等功能条目，以及在分子功能中的未折叠蛋白结合（Unfolded protein binding）功能条目上也显著富集（图2）。2.4DEGs的KEGG信号通路富集分析结果KEGG信号通路富集分析发现，DEGs富集在细胞过程（Celluar processes）、环境信息处理（Environ-mental information processing）、遗传信息处理（Ge-netic information processing）、人类疾病（Human di-seases）、代谢（Metabolism）及生物系统（Organismalsystems）六大类别的148条信号通路上，排名前9的信号通路分别是内质网蛋白加工通路（Protein pro-cessing in endoplasmic reticulum）、RNA转运（RNAtransport）、细胞周期（Cell cycle）、钙信号通路（Cal-cium signaling pathway）、黏着斑（Focal adhesion）、细胞衰老（Cellular senescence）、神经活性配体受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、细胞因子细胞因子受体相互作用通路（Cytokine-图 2DEGs的GO功能注释分析结果Fig.2GO functional analysis of DEGsCellular componentQ0.090.060.030204060051002040Molecular functionBiological processQ0.120.100.080.06Q0.120.080.04GO功能条目 GO termGO功能条目 GO termGO功能条目 GO term3期779cytokine receptor interaction）及氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids），且均为上调信号通路（图3）。其中，DEGs在内质网蛋白加工通路、氨基酸生物合成及细胞周期等3条KEGG信号通路中显著富集（图4）。2.5DEGs编码蛋白互作网络分析结果对DEGs编码蛋白与STRING数据库中的蛋白序列进行比对，并构建蛋白互作网络图。如图5所示，与PBS组相比，NRTUAs组中DEGs编码蛋白CDK1和CDC20的聚集系数最高，推测为NRTUAs刺激雏鸡脾脏免疫机制的重要蛋白节点。此外，DEGs编码蛋白对CDK1与CCNA2、CDK1与CCNB3及CDK1与CDC20均有所上调，且与邻接点间的连通性好，互作关系强，表明这些蛋白节点在NRTUAs刺激雏鸡脾脏后的蛋白互作网络中可能发挥重要作用。图 3DEGs的KEGG信号通路富集分析结果Fig.3KEGG signal pathway enrichment analysis of DEGs图 4DEGs在前20名KEGG信号通路上富集情况Fig.4Enrichment of DEGs in the top 20 KEGG signaling pathways010%20%Annctated genesCellular processesEnvironmental information processingGenctic infonmialion processingHuman diseasesMetabolismOrganismal systems510152025富集因子 Rich factorQ0.50.40.30.20.1DEGs number510152025SignificantUpDownKEGG信号通路 KEGG pathwayKEGG信号通路 KEGG pathway吴绿怡等：非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫刺激雏鸡脾脏的转录组学分析54卷南 方 农 业 学 报 7802.6DEGs的实时荧光定量PCR验证结果从筛选获得的DEGs中随机选取10个进行实时荧光定量PCR验证，结果显示：有2个DEGs呈上调表达，分别是趋化因子基质细胞衍生因子-1（CXCL12）和V-Set前B细胞替代物轻链3基因（VPREB3）；其余8个DEGs均呈下调表达，分别为趋化因子26（CCL26）、颗粒溶素基因（GNLY）、干扰素调控因子1（IRF1）、碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白3基因（BATF3）、丝氨酸蛋白酶抑制剂B1基因（SER-PINB1）、干扰素-基因（IFNG）、信号传导和转录激活因子1（STAT1）、肿瘤坏死因子受体13B基因（TNFRSF13B）及RNA聚合酶延长因子相关因子-2（EAF2）。实时荧光定量PCR检测结果与转录组测序结果基本一致（图6），进一步说明转录组测序是一种可靠的表达谱分析参考方法，发掘获得的DEGs具有较高可信度。图 5DEGs编码蛋白的互作网络图Fig.5Interaction network diagram of DEGs coding proteinsA：DEGs编码蛋白互作网络分析总体结果；B：Combined score0.7时DEGs编码蛋白互作网络分析结果A：The overall results of interaction network analysis of DEGs coding proteins；B：The results of interaction network analysis of DEGs codingproteins when combined score0.7图 6雏鸡脾脏部分DEGs的实时荧光定量PCR验证结果Fig.6Real-time fluorescence quantitative PCR validation ofDEGs in chick spleens3讨论弓形虫作为一种宿主类型广泛的机会性致病寄生虫，严重影响人类健康与畜牧业的可持续发展（Black and Boothroyd，2000）。目前，对于弓形虫病的防治尚无可应用于人类或禽类的疫苗，磺胺类药物虽然可用于预防和治疗弓形虫病，但毒副作用大且易产生耐药性（Redmond et al.，2010；Neville etal.，2015）。已有研究证实，通过敲除ompdc和up基因获得的NRTUAs具有良好的抗弓形虫效果，为弓形虫疫苗的研发提供了新方向（Fox and Bzik 2010；Dupont et al.，2014；Fox et al.，2017）。感染NRTUAs的昆明小鼠均未出现死亡，且剖检后各器官无明显病变，与RH强毒株相比诱导的炎症反应较弱，表明NRTUAs的致病性低（任超等，2022）。鸡的脾脏既是白细胞的储存库，也是白细胞的活化部位，即脾脏的基因表达水平能反映其全身免疫功能（Deng etal.，2019），为此，本研究通过转录组测序技术分析NRTUAs感染雏鸡脾脏的转录组学变化，以明确NRTUAs对雏鸡先天性免疫的调节效果，为研发家禽抗弓形虫疫苗提供理论依据。本研究从NRTUAs组与PBS组间共筛选到499个VPREB3CXCL12CCL26GNLYIRF1BATF3SERPINB1IFNGGVINP1STAT1DEGs420-2-4-6-8log2Flod Change*AB转录组测序Transcriptome sequencing实时荧光定量PCRReal-time fluorescence quantitative PCR3期781DEGs，其中，VPREB3基因、EAF2基因、TNFRSF13B基因、碱性螺旋环螺旋家族成员a15（BHL-HA15）、LOC100858963（CHIR5A1）、LOC107049514（CHIR4B4）、序列相似的家族46成员C（FAM46C）、硫氧还蛋白5基因（TXNDC5）、IFN调节因子4（IRF4）、肌细胞增强因子-2B（MEF2B）、POU2级同源框关联因子1（POU2AF1）、溶质载体家族5成员6（SLC5A6）呈显著上调趋势，而白细胞介素1受体2型基因（IL-1R2）呈显著下调趋势，均为NRTUAs刺激雏鸡脾脏的关键基因。感染NRTUAs后雏鸡的免疫相关基因表达也有所上调，EAF2基因通过调节中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的免疫浸润水平而清除抗原（Han and Shen，2020）；SLC5A6介导细胞摄取生物素、泛酸和硫辛酸，间接影响酶活性，而有利于调动免疫细胞（Ozand et al.，1998）；IRF4参与鸡B细胞中的胞苷脱氨酶基因表达，推测IRF4是NRTUAs刺激雏鸡脾脏免疫反应的关键调控因子（Ying et al.，2013）；MEF2B基因上调表达可直接控制转录抑制因子B细胞淋巴瘤6蛋白，使生发中心的B细胞迅速增殖（Ying et al.，2013）；POU2AF1基因表达上调后雏鸡B细胞中的调节免疫球蛋白表达明显增强，而VPREB3基因可能是通过调节鸡B细胞中游离免疫球蛋白轻链（Immunoglobulin light chain，IgLC）的成熟和分泌来影响免疫进程（Pin et al.，2000；Rosnet etal.，2004；Zhou et al.，2016）。此外，LOC100858963是免疫球蛋白样受体5A1簇的同源物，LOC107049514是免疫球蛋白样受体4B4簇的同源物，二者与上述基因一同调控NRTUAs感染雏鸡脾脏的免疫机制。KEGG信号通路富集分析结果显示，TNFRSF13B基因主要富集在细胞因子细胞因子受体相互作用通路及肠道IgA生成信号通路中。TNFRSF13B控制浆细胞分化及天然IgA抗体的合成，并通过控制生发中心的B细胞功能来决定抗体亲和力（Tsuji et al.，2014；Platt et al.，2021）。TNFRSF13C和TNFSF13B与TNFRSF13B相互作用，启动信号转导，参与体液免疫及病理损伤过程，可能与激活雏鸡脾脏的抗弓形虫免疫有关（Maeda et al.，2014；Guiton et al.，2017；Guo et al.，2020；de Mattos Barbosa et al.，2021）。值得注意的是，感染NRTUAs后雏鸡脾脏的IL-1R2基因表达显著下调。IL-1R1和 IL1R2同为白细胞介素-1（IL-1）的受体，IL-1通过关联并激活JAK-STAT、NF-B、PI3K和JNK等信号通路，诱导IL-1、IL-6和IL-8等促炎细胞因子表达，在炎症反应和自身炎症性疾病中发挥重要作用（He et al.，2019）。IL-1R2在中性粒细胞、单核细胞和B细胞表面表达，与IL-1R1拮抗抑制IL-1活性（Truong et al.，2023）。在本研究中，IL1R2基因表达下调提示其对IL-1的抑制减弱，间接加快了NRTUAs刺激雏鸡脾脏的免疫进程。NRTUAs除了刺激雏鸡的免疫应答外，还加速了蛋白加工，表现为内质网蛋白加工通路显著富集了26个DEGs。TXNDC5基因在内质网蛋白加工通路中上调且表达量较高，是蛋白二硫异构酶家族的成员之一，在细胞的增殖、凋亡、迁移及抗氧化应激中发挥重要作用（Ma et al.，2020；Wang et al.，2022b）。FAM46C基因也可能参与诱导细胞凋亡，促使mRNA稳定性和基因表达增强（Truong et al.，2023）。在DEGs编码蛋白互作网络中，PLK1、CCNB1、CDK1、CDC20、CCNA2和NDC1蛋白均在细胞周期通路上调表达，说明在感染NRTUAs后雏鸡脾脏细胞活动明显增强，有利于加快建立细胞连接及启动先天