化学染色省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

血液细胞化学染色血液细胞化学染色 检测方法与应用检测方法与应用 山东省立医院山东省立医院.张健张健第1页细胞化学染色概述细胞化学染色概述 w在组织化学基础上发展起来一个分支w细胞学与化学相结合形成w保持细胞形态基础上，在细胞原位依据化学反应原理w研究细胞化学成份性质，蛋白质、酶类、脂类、糖类、无机盐、核酸及金属w判别各种类型血液细胞，提升血液病诊疗及判别诊疗、疗效观察等第2页骨髓细胞检验惯用染色方法 w瑞氏染色（rights stain）w姬姆萨染色（Giemsa stain)w瑞氏姬姆萨复合染色（Wright Geimsa mixture staing）第3页w过氧化物酶染色（POX）w碱性磷酸酶（NAP）钙-钴法 与 偶氮偶联法 w糖原染色(PAS)又称（过碘酸-雪夫氏反应）w铁染色(普鲁士兰)第4页w氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色（AS-DCE）w-醋酸萘酚酯酶染色（-NAE加NaF）w醋酸AS-D萘酚酯酶染色（NASDAE）w醋酸AS萘酚酯酶染色 w-丁酸萘酚酯酶染色-NBE w-醋酸萘酚酯酶与氯化醋酸AS-D萘酚酯酶双染色w-丁酸萘酚酯酶与氯化醋酸AS-D萘酚酯酶双染色 第5页其它染色方法：wSBwACP染色w阿利新蓝染色w胶体铁染色wphi小体染色等等第6页骨髓细胞检验中临床应用 一、确定急性白血病类型：惯用POX、SB PAS、NAP、ACP、酯酶染色（.）第7页 二、一些血液病判别诊疗：w铁染色区分：缺铁性贫血OR非缺铁性贫血；wNAP判别：CML OR 类白反应、AA OR PNH、PV（真红）OR 继红（SE）；wPAS区 分：M6 OR MA、Gauchers disease OR Nieman-picks disease、骨髓转移腺癌细胞 OR 白血病细胞wACP区分：多毛细胞与淋巴细胞、T淋巴细胞与B淋巴细胞、Gauchers disease OR Nieman-picks disease第8页w 三、观察疗效、估计预后：wAA NAP积分增高，当病情好转OR CR时NAP积分降低甚至正常；wCML慢性期NAP显著降低OR为0分，CR过程NAP上升甚至正常；wIDA外铁消失、内铁百分率减低，当治疗有效时增加。w慢性疾病所致贫血，患者体内单核-巨噬细胞系统铁释放障碍、红细胞利用铁能力降低，铁储备增加，所以外铁增多、内铁减少。第9页细胞化学染色普通步骤细胞化学染色普通步骤 一、固定：保持细胞结构和成份，依据不一样成份选择适当固定液，可使蛋白质、酶类、脂类、糖类、无机盐、核酸及金属等成份变成不溶性物质，在染色过程中不脱落。惯用化学固定法，如：甲醛蒸气固定，标本浸入甲醇、乙醇、丙酮、甲醛等固定液，两种及以上混合液，如：10%甲醛甲醇液，甲醛丙酮液等 第10页 二、显色：w金属沉淀法、w偶氮偶联法、w联苯胺色素法、wSchiff反应、w普鲁士蓝反应、w脂溶染色法等等第11页 三、复染：显色后，为了进行对比染色方法，易观察，进行复染 细胞核复染（苏木素、甲基绿、中性红、沙黄、核固红）细胞浆复染（伊红、刚果红、藻红、光绿、坚固绿）第12页基本染色方法瑞氏染色w瑞氏染色（rights stain）w染色原理：瑞氏染料中含有美蓝和伊红二种染料，前者为碱性，后者为酸性，它们与细胞内各种物质含有不一样亲和力，而使其显现出不一样色调，方便于辩认。第13页w细胞核中核蛋白中强碱性物质与瑞氏染料中酸性染料伊红有亲和力，故染成红色；核蛋白中还有少许弱酸性蛋白及其氨基，它又与瑞氏染料中美蓝起作用，故细胞核呈紫红色w较幼稚细胞胞浆和细胞核核仁含有酸性物质，与瑞氏染料中碱性染料美蓝有亲和力，故染成蓝色w当酸碱物质各半时，则染成红蓝色或灰红色，即所谓嗜多色性。第14页试剂配制w瑞氏染料 1.0gw甲醇 600mlw将瑞氏染料置于清洁研钵内，加少许甲醇（也能够加入10ml甘油，充分研磨使染料研成细粉末易溶解）充分研磨染料，加入甲醇溶解，倒入棕色玻璃瓶中，未溶解染料再加少许甲醇研磨，直到染料溶完，600ml甲醇全部用完为止。第15页 磷酸盐缓冲液（PH6.46.8）w 磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3gw 磷酸氢二钠（Na2HPO4)0.2g w 蒸馏水 加至 1000ml 配好后校正PH值，备用 第16页w染色方法：w(1)将已编号涂片平放于染色架上。最好不要在涂膜两端用蜡笔划线，以免遗漏应染之物，尤其是涂片头、尾、及两侧部。w(2)滴加瑞氏染液。多少依标本所占面积大小及涂片厚薄程度而定，普通为48滴，至染液将标本完全盖住为止。固定细胞12分钟。w(3)按染液：缓冲液为1：1或1：2百分比，滴加缓冲液，用吸耳球往返轻轻吹之，使之混匀。第17页w(4)染色时间须视何种标本、涂膜厚薄，有核细胞多少、何种细胞及室温等而定，普通染色1020分钟。w(5)用自来水冲洗涂片上染液。要轻轻摇动涂片，使染液沉渣浮起冲走，切勿先倾去染液再用水冲，不然，涂片上许多染料将沉淀于涂膜上。冲洗时间不可过长，水冲力亦不可太大，以防脱色或涂膜脱落。冲洗后标本竖置在片架上，在空气中自然干燥，或用洁净吸水纸吸干。w(6)镜检。第18页 染色注意事项w(1)染色涂片冲洗后，应自然干燥或风干。w(2)染液量需充分，勿使染液蒸发干燥，以防染料从容于涂片上。w(3)若细胞着色浅淡，可待标本干燥后重染；若细胞着色太浓或沉淀物过多时，可待标本干燥后，滴加瑞氏染液数滴（利用其中甲醇褪色），后冲洗、晾干即可。第19页姬姆萨染色（Giemsa stain)w染液主要含伊红、美蓝两种成份，染色原理与瑞氏染色相同 w2.试剂配制w 姬氏染料 0.5gw 甘 油 33.0mlw 甲醇 33.0ml 将染料粉未全部溶于33.0ml甘油中，加热至55.660oC，连续90120分钟，再加入33.0ml甲醇，摇匀后置棕色瓶中，放置数天，过滤后即可应用 第20页w染色方法w(1)将标本涂膜用甲醇固定分钟。w(2)再置于稀释过染液（10ml缓冲液加1ml染液，或30滴缓冲液加染液3滴）中，染色1040分钟。w(3)取出涂片，用自来水冲冼，自然干燥即可。w(4)镜检。第21页瑞氏姬姆萨复合染色w染色原理：混合染色法优点是，瑞氏染液对胞浆着色好，姬姆萨染液则对核着色好，二法合并，可兼得二者之优点 细胞 学检验中，惯用二者进行复合染色，使其相互补充，有利于显微镜下细胞区分 第22页惯用染色方法及临床应用一、过氧化物酶染色（一、过氧化物酶染色（POX）w原理：粒细胞及部分单核细胞浆内POX酶水解H2O2释放新生态氧氧化无色联苯胺为氧化联苯胺+亚硝基铁氰化钠棕黑色颗粒定位POX酶活性所在 第23页 试剂：w1.Washburn氏染色液配制法 联苯胺 0.3g 95%乙醇 99ml 36%亚硝基铁氰化钠 1ml(360mg溶1ml)棕色瓶内可保留10个月左右w 2稀双氧水（需临用前新鲜配制需临用前新鲜配制）1%过氧化氢液 1滴 蒸馏水 5ml 第24页 操作：w1.新鲜涂片上加上0.3%联苯胺酒精溶液10滴染一分钟。w2.不将联苯胺液倾去，即加等量稀双氧水染四分钟。w3.用水冲洗，用95%乙醇脱色。w4.用瑞氏染色液复染10-20分钟，水洗干后镜检。第25页 结果判断：w阳性-胞浆内有兰黑色颗粒 标准：（-）无颗粒 （+/-）颗粒细小而分布松 （+）颗粒粗，局灶 （+）颗粒粗大，分布密 （+）颗粒粗大，成团 （+）颗粒分布整个细胞注意：计数100只原始细胞 （单、早幼粒不计在内）第26页 正常细胞反应：正常细胞反应：w粒细胞系列：原粒（普通，少数出现少许颗粒），早幼粒以下（+，越成熟越+）EO（+）；B（）w单核：/弱+，细小弥散颗粒w其它：淋巴、幼红、浆、组织细胞、巨核、血小板（）；巨噬细胞可+第27页临床意义：临床意义：w急粒（分化好原始粒细胞阳性，颗粒粗大而局灶分布；分化差可阴性）wALL（阴性；如+可能为原粒细胞）wM5（阴性/弱阳性）wM3（+）wM6（原粒或单，阳性或弱阳性；原、幼红，阴性）w恶组（阴性）第28页碱性磷酸酶碱性磷酸酶（NAP）钙）钙-钴法钴法 与与 偶氮偶联法偶氮偶联法 w钙钙-钴法：钴法：成熟中性粒细胞胞质内碱性磷酸酶碱性条件下水解B-甘油磷酸钠磷酸钠+硝酸钙磷酸钙+硝酸钴+硫化氨硫化钴（棕黑色）定位于酶活性处。第29页w偶偶氮氮偶偶联联法法：成熟中性粒细胞胞质内碱性磷酸酶PH9.6下水解-磷酸萘酚钠-萘酚+重氮盐偶氮偶联形成偶氮色素沉淀定位酶活性所在第30页 试剂：w1、10%固定液：甲醛10ml甲醇90ml混合置4c冰箱保留w 2、缓冲液：0.05M2氨基-2甲基-1，3丙二醇（2.625gH2O500ml）w 3、基质液：-磷酸萘酚钠35mg，溶于0.05M缓冲液液35ml，再加入重氮盐固牢兰B或RR35mg溶解w4、苏木紫染液w5、可 用 0.1M巴 比 妥 钠 9.85ml、0.1NHCL0.15ml、1%MgSO4.7H2O1ml、PH9.6代替丙二醇第31页 方法：w1、新鲜固定30秒（4）水洗w2、放入基质液中30分钟37后，水洗5分钟w3、置苏木紫2分钟水洗后凉干 镜检 第32页结果：w阳性-呈棕黑色或黑色颗粒于浆内 标准：（-）浆内无色 （+）浆内少颗粒1/2以下 （+）浆内散在中量颗粒1/23/4 （+）有丰富颗粒3/4以上 （+）丰富密布颗粒 全注意：用新鲜血片为好，观察100只中性成熟粒细胞 第33页 正常值：w钙-钴法：751分（3070）w偶氮偶联法3570分第34页w临床意义：生理性：新生儿婴幼儿、儿童成人老年人 应激状态、妊辰（分娩时高峰）增高 病理性：w、感染：细菌性感染增高“球菌杆菌”“急性慢性”，病毒感染无显著改变w、类白血病反应 NAP积分显著增高w、慢粒慢性期（无感染者）NAP积分显著降低“0分”，CR期恢复正常，加速期和急变期NAP积分增高。能够作为CML疗效及预后一个指标。第35页w、急性白血病：急粒NAP积分减低、急淋NAP积分普通增高（能够判别急粒或急淋）、急单时NAP积分普通减低，也可正常或增高。w、AA时NAP积分显著增高，CR时正常、PNH时NAP积分减低（能够与AA判别）、MDS时NAP积分减低（能够与AA判别）w、PV（真性红细胞增多症）NAP积分增高，继发性红细胞增多症NAP积分无显著改变（有利于二者判别）第36页w、其它：CLL、MF、ET（原发性血小板增多）、原始神经细胞瘤、骨髓转移癌和红血病等疾病NAP积分增高；M6、绿色瘤、镰状细胞性贫血等疾病NAP积分减低；恶组NAP积分减低，反应性组织细胞增多NAP积分显著增高。w、应用肾上腺糖皮质激素、雌激素、ACTH（促肾上腺皮质激素）等NAP积分增高。标本新鲜（防止酶活性减低）、操作过程中最好做一份阳性对照（AA或感染）第37页糖原染色糖原染色(PAS)（高碘酸（高碘酸-雪夫氏反应）雪夫氏反应）原理：wSchiff反应（细胞内含有乙二醇基糖类被过碘酸氧化双醛基+Schiff无色品红醛化反应紫红色化合物定位糖所在，可显示糖原、粘多糖、粘蛋白等多糖类），依据糖含量多少不一样，呈粗细不等红色颗粒、块状物或均匀红色。第38页w试剂:w1.固定液-甲醇或95%乙醇w2.过碘酸溶液:过碘酸0.5g+1/5M醋酸钠5ml+蒸馏水45mlw3.雪夫氏液:将200ml蒸馏水煮沸,缓缓加入碱性品红(碱性品红,指示剂)1.0g,待冷却至50C(60C)时加入1NHCL20ml,待冷却至25 0c(20C)时加入2g偏重亚硫酸钠,马上加盖使其溶解,放暗处(冰箱)过夜,取出时呈淡黄或淡红色,次日加活性碳1g(300mg起吸附作用),摇匀后过滤即可，置冰箱保留w4、偏重亚硫酸钠溶液配制（含S02溶液）：取10%亚硫酸氢钠5ml，加H20至100 ml（临用前配）w5、苏木紫液 第39页w操作：w1、涂片用甲醇固定5分钟，水洗w2、放入过碘酸溶液中氧化10分钟（暗处），水洗待干w3、置雪夫氏液内染45分钟（暗处），冬天37C，用水冲洗w4、用苏木紫复染1分钟，水洗待干 镜检第40页 结果判定：结果判定：w阳性-胞浆内呈红色颗粒、块状及弥漫状红色物质 第41页 正常正常细胞胞结果：果：w、粒系：原粒多呈（-），早幼粒以下随成熟阳性强度逐步加强，成熟阶段强阳性。Eo细胞颗粒（-）颗粒间胞浆弥漫性红色。BS细胞（阳性，颗粒紫红、大小不一）（-）无色 （）浆呈粉红色无颗粒 （+）浆呈淡红细颗粒 （+）浆红少颗粒 （+）浆暗红多颗粒 （+）浆紫红颗粒密第42页 2、淋系：淋巴大多数（-），少数为（+（-）浆无色（）浆呈淡红色无颗粒（+）浆呈淡红细颗粒（10个）（+）浆红弥漫（+）浆内有较粗颗粒或少数大块红色颗粒（+）有较多粗颗粒，并有大块红色物质 3、红系：幼红细胞及成熟红细胞均（-）。4、巨系、血小板均（+）5、单系、浆、网状细胞均大多（-）第43页w临床意义：临床意义：w1、红系：红血病与红白血病时幼红细胞（阳性），强度强，阳性率高、成熟红细胞也可阳性。其它类型白血病或慢性白血病红系为（阴性）。IDA、珠蛋白生成障碍性贫血、MDS时幼红细胞可阳性。MA、AA、溶血性贫血时（阴性）w2、白细胞系列：ALL原始淋巴多为（阳性），红色颗粒、块状于核周环状排列。急粒，原粒细胞大多为（阴性）、少数细小颗粒阳性。急单，原单细胞阳性反应多为细颗粒弥散分布，胞浆边缘颗粒较粗大。3、其它：淋巴瘤及CLL均（阳性）。R-S细胞大多（阴性），少数若阳性。Gaucher细胞（阳性），Nieman-pick细胞（空泡中心为阴性）。骨髓转移腺癌细胞为强阳性。第44页铁染色铁染色(普鲁士兰反应普鲁士兰反应)原理：原理：w骨髓中以含铁血黄素形式贮存铁为细胞外铁；幼红细胞内铁颗粒为细胞内铁，为铁粒幼细胞。普鲁士蓝反应（三价铁离子+酸性亚铁氰化钾兰色亚铁氰化铁沉淀定位于含铁部位）第45页试剂：试剂：w1、亚铁氰化钾液：临用前配，称亚铁氰化钾5 g+H20 45ml+5ml浓HCLw2、酸性沙黄液：沙黄0.1g加水至100ml溶解，加醋酸0.1ml 第46页方法：方法：w1、甲醇固定10分钟后，水洗w2、置入亚铁氰化钾液中，用染缸置37水浴1小时，水洗 w3、复染沙黄液10-20分钟w镜检第47页 结果：结果：w红细胞淡红色，有铁颗粒呈兰色及绿色内铁w 外铁呈小珠或小团 第48页 判定标准：判定标准：内铁：油镜计数100只幼红细胞百分率w型：浆内有1-2只铁颗粒w型：3-5只w型：6-9 只w型：10个以上w环铁粒幼细胞：6个以上，围绕胞核二分之一以上。第49页 外铁：w（-）无铁颗粒w（+）少许颗粒w（+）较多颗粒及小珠w（+）很多铁粒、小珠、小块w（+）很多铁粒、很多小块成堆 第50页 正常结果：正常结果：w外铁（+至+）w内铁：15%-45%多数为I型，少数II型 第51页w临床意义：临床意义：w1、IDA外铁显著降低、消失，内铁减低，以I型为主。铁治疗有效，内外铁增加，可判断疗效。w2、铁粒幼细胞贫血：出现较多环形铁粒幼细胞，可见铁粒红细胞，为诊疗本病主要依据。w3、MDS：外铁丰富，铁粒幼细胞比值增高。RARS中环形铁粒幼细胞占15%以上。w4、非缺铁性贫血：溶贫、MA、AA和白血病等内外铁正常或增高。w5、感染、肝硬化、慢性肾炎、尿毒症、血色病及屡次输血后，外铁增高。第52页氯化醋酸氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色（萘酚酯酶染色（AS-DCE）w原理：细胞内氯化醋酸AS-D萘酚酯酶水解氯化醋酸AS-D萘酚形成AS-D萘酚+重氮盐偶氮偶联形成偶氮色素沉淀定位酶活性所在 第53页 试剂试剂：w1、固定液：10%甲醛甲醇液，4保留w2、基质液：w（1）4%付 品 红 0.025ml，4%亚 硝 酸 钠0.025ml混合于一尖底管中w（2）氯醋酸AS-D萘酚1mg+N二甲基甲酰胺0.5ml混合于另一尖底管中w（3）将M/15PPB(PH7.6)9.5ml加入（1）中w M/15PPB：M/15 KH2PO466ml-9.08g/L M/15 Na2HPO434ml-9.47g/Lw（4）将（2）和（1）混合，颜色为鲜红色w3、1%甲基绿或苏木紫 第54页 方法方法：w1、新鲜涂片置于10%甲醛甲醇液中4固定30秒水洗待干w 2、置基质液中，连盛器放入37水浴加温1小时，然后连盛器一起水洗10分钟，取出待干w 3、用1%甲基绿或苏木紫复染5分钟（5-8分钟）w 4、水洗10分钟干后镜检 第55页 结果结果：w胞浆呈鲜红色为阳性 第56页正常细胞正常细胞：w粒细胞+，活性不随成熟而增强；wEO（/+）；wB（+）；wM（-/个别+）；w淋巴、浆、幼红、巨核、血小板（）第57页 临床意义临床意义：w急粒（绝大多数原粒细胞+）、M3（+）、M5（）、M4（部分+）、ALL（）；w如ASDCE连续阳性病情恶化；wASDCE染色比POX染色特异性高（粒细胞酯酶染色）。第58页中性非特异性酯酶染色w原理：w血细胞中酯酶在PH中性条件下水解基质液底物中对应萘酚基萘酚基萘酚萘酚+重氮盐偶氮偶联形成偶氮色素沉淀定位酶活性所在 第59页依据基质液底物可有 1、-醋酸萘酚酯酶染色醋酸萘酚酯酶染色 （-NAE）PH中性中性 2、醋酸、醋酸AS-D萘酚酯酶染色萘酚酯酶染色 （NASDAE）PH中性中性 3、醋酸、醋酸AS萘酚酯酶染色萘酚酯酶染色 PH中性中性 第60页-醋酸萘酚酯酶染色（醋酸萘酚酯酶染色（-NAE加加NaF）坚）坚牢兰牢兰B 灰黑棕灰黑棕 PH中性中性w试剂试剂：w1、固定液：40%甲醛 w2、基质液：-醋酸萘酚10mg溶解于50%丙酮水溶液1ml，再加入PH7.4磷酸缓冲液（0.05mol/L）50ml加50mg坚牢兰B混匀w3、NaF75mgw4、苏木紫染液或2%甲绿第61页 方法方法：w1、鲜涂片用甲醛蒸气固定5-10分钟，水洗干后w2、置入基质液中1小时（37水浴中）w3、连染色缸一同水冲洗2分钟，干后w4、用苏木紫复染1-2分钟或用2%甲绿复染 10分钟w5、水洗干后镜检（附）：氟化钠抑制试验-配二缸基质液，其中一缸加75mgNaF，二张涂片按上述在二缸内各自染色即可 第62页 结果结果：w（-）无素从容w（）淡黄灰色从容w（+）胞浆1/2区域出现灰黑或棕黑色沉淀w（+）胞浆3/4区域出现灰黑或棕黑色沉淀w（+）胞浆全部区域出现灰黑或棕黑色沉淀w（+）胞浆全部被深黑色团块沉淀充满，密度很高 wNAF抑制试验：抑制率=（抑制前-抑制后）/抑制前*100%第63页 正常细胞反应正常细胞反应：wM及组织细胞（+，NAF抑制）w粒（/个别+，NAF不抑制）w巨核血小板（+，NAF可能抑制）w幼红与淋巴（/个别+，NAF不抑制）w浆（）第64页 临床意义临床意义：wM5（原、幼、单都+，NAF抑制）、w急粒（/个别+，NAF不抑制）、wM3（、+、+/NAF不抑制）、wALL（，T细胞急淋可+/NAF不抑制）、wM4（部分+）、wM6（异常幼红可+）第65页-丁酸萘酚酯酶染色丁酸萘酚酯酶染色-NBE 原理原理：w细胞中-丁酸萘酚酯酶在PH碱性条件下水解基质液中-丁酸萘酚生成-萘酚+重氮盐偶联不溶性偶氮色素，定位于酶活性处 第66页 试剂试剂：w1、固定液：40%甲醛w2、基质液：0.1MPPB（PH8.0）10ML（KH2P0425ml-13.6g/L Na2HP04475ml-14.2g/L）-NBE5ul，丙酮0.25ml 重氮盐：坚牢兰B盐 15mg w3、NaF：15 mgw 4、苏木素或1%甲绿 第67页 方法方法：w1、新鲜涂片用甲醛蒸气固定 5-10分钟，水洗晾干w2、置基质液中1小时（37水浴中）w3、连同染色缸一同水洗2分钟，干后w4、用苏木素复染1-2分钟w5、水洗，干后，镜检（附：氟化钠抑制试验-配二缸基质液，其中一缸加15mgNaF，二张涂片按上述方法在二缸内各自染色即可）第68页 结果结果：w阳性反应为胞浆内出现兰色颗粒状沉淀。第69页 正常细胞反应正常细胞反应：w粒细胞系（）、wM（+，NAF抑制）、w组织细胞（+，NAF不抑制）、w少部分T淋巴、非T非B淋巴（不足点状+）、wB淋巴（）、w巨核、幼红、浆（/弱阳）第70页 临床意义：临床意义：w急粒（）wM5（原始 幼稚 单均+，NAF抑制）wALL（普通）w恶组（可+，NAF不抑制）w毛细胞白血病（弥漫细小颗粒+，NAF不抑制）第71页酯酶双染色酯酶双染色 w-醋醋酸酸萘萘酚酚酯酯酶酶与与氯氯化化醋醋酸酸AS-D萘萘酚酚酯酯酶酶双双染色染色w-丁酸萘酚酯酶与氯化醋酸丁酸萘酚酯酶与氯化醋酸AS-D萘酚酯酶双萘酚酯酶双染色染色 第72页其它染色方法wSBwACP染色w阿利新蓝染色w胶体铁染色wphi小体染色等等第73页第74页第75页第76页第77页第78页第79页第80页第81页第82页第83页第84页第85页第86页第87页第88页第89页第90页第91页第92页第93页第94页第95页第96页第97页第98页第99页第100页第101页第102页第103页第104页第105页第106页第107页第108页第109页第110页第111页第112页第113页第114页第115页 谢谢！谢谢！第116页