琼脂糖凝胶电泳操作标准流程.doc

琼脂糖凝胶电泳操作标准流程一、 实验目的:琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术仅代表具备操作琼脂糖电泳的能力。二、 实验原理:琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA。影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA分子大小；2、琼脂糖浓度；3、DNA构想；4、所用的电压；5、琼脂糖种类；6、电泳缓冲液。核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA损伤不是很大，所以也比较适用。三、 材料、试剂及器具1、 材料：不同大小的基因组片段2、 试剂：Hind III digest DNA Marker（分子量标准）(TaKaRa)；D2000(TianGen)；琼脂糖；加样缓冲液（6x）：溴酚蓝；电泳缓冲液（1TAE）；溴化乙锭（EB）；3、 仪器及器具：（1）移液器、吸头、锥形瓶（2）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。（3）紫外透射仪、微波炉、电子天平四、 操作步骤1. 器具清洗：首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘（EB污染，需独立清洗）。清洗流程为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收，则还需用75%酒精对器具进行消毒。2. 配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶洗干净并加入少量纯水煮沸，然后量取一定量的电泳缓冲液（1TAE）至锥形瓶中，再称取相应量的琼脂糖倒入锥形瓶中，摇匀并用锡纸封口，最后放入微波炉煮，煮胶的过程中需注意安全，应适当摇匀，防止爆沸。煮好的凝胶需无气泡、色泽均匀。将煮好的凝胶放入65的水浴锅中，待凝胶冷却至65时，及时将凝胶倒入装好的干净模具中。待凝胶完全凝固后，将凝胶小心转移至4冰箱，冷冻30min，然后拔梳子。此时，凝胶需平整、不漏孔，可以用于电泳检测。3. 电泳准备：先将干净的电泳槽排放整齐并做好标记，然后把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极（注意：放凝胶前，需将胶托底部的凝胶抹干净，防止胶托在电泳槽中滑动；此时，可顺便观察凝胶是否漏孔），再往电泳槽中倒入一定量的电泳缓冲液（1TAE）至刚好将凝胶淹没。（注意保持桌面卫生，防止缓冲液洒到桌面）4. 上样：将样品、6溴酚蓝按3：1的比例混匀，轻甩后按照规定的顺序上样，上样顺序应与电泳槽上的标记一致，最后点上一定量的Ladder。（注意：上样时必须确保上样顺序正确无误，样品间不混淆，点样后的空管子先放在电泳槽旁边，用于核查；点样时不戳孔、不外漏、不溢出；点样时需小心枪头不要碰到凝胶，以免凝胶挪动，若凝胶已经挪动，需等样品完全沉到底部后，再固定凝胶）5. 电泳：确认已经正确上样后，双手盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽（注意：确认电极正确连接），设置电泳参数：电压：120V，电流：300mA，时间：30min（溴酚蓝跑至胶2/3为宜）；注意确认电极、电泳参数完全正确之后，最后按star键开始电泳。6. 染胶：电泳结束之后，带上PE手套，小心滑出凝胶，把凝胶转移到干净的PE手套上（注意：PE手套上应做好标记，确保样品、电泳槽、PE手套的标记是一致），小心地将凝胶放入相应标记的EB染胶盘中，盖上盖子染30min。其中，染胶盘放在EB暗房中，EB染液的配方为：100ml 1TAE+5ul EB染料。（注意：配制EB染液和染胶时需戴上乳胶手套、PE手套，必要时可戴上口罩，染胶时动作要轻，防止溅起EB染液；注意区分EB污染区与非污染区，防止EB污染区向非污染区扩散）7. 凝胶成像：带上PE手套，将凝胶从染胶盘中捞出，放在染胶时的那个PE手套上（注意：捞胶时需小心防止凝胶断裂、滑落，尽量把多余的EB染液甩干），将凝胶放入凝胶成像系统中，按照“Tanon凝胶成像系统操作规程”进行操作拍照。（注意：拍照时需严格区分EB污染区与非污染区，防止EB污染区污染电脑、键盘及鼠标），最后保存胶图信息至规定的文件夹内，命名规则为：日期+姓名+部门+电泳目的。五、 注意事项电泳中使用的溴化乙锭（EB）为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的EB暗房中操作，操作时戴上乳胶手套，必要时戴上PE手套和口罩 建议电泳条件：120V，加2L 6xloading buffer，上样5L，2000bp marker 5L制胶所需试剂量：小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE