MS培养基配方.doc

MS培养基母液的配制：
20×MS大量元素(1 L)：38 g KNO3，33 g NH4NO3，8.8 g CaCl2·2H2O，7.4 g MgSO4·7H2O，3.4 g KH2PO4。
200×MS微量元素(1 L)：0.166 g KI，1.24 g H3BO3，4.46 g MnSO4·4H2O，1.72 g ZnSO4·7H2O，0.05 g Na2MoO4·2H2O，0.005 g CuSO4·5H2O，0.005 g CoCl2·6H2O。
200×MS维生素和氨基酸(1 L)：20 g肌醇，0.1 g烟酸，0.1 g盐酸吡哆醇(VB6)，0.02 g盐酸硫胺素(thiamine hydrochloride, VB1)，0.4 g甘氨酸。
200×MS铁盐(1 L)：5.56 g FeSO4· 7H2O，7.46 g Na2EDTA· 2H2O，先溶于500 mL ddH2O，加热，调pH至5.5，定容至1 L。
注意：
配制大量元素母液时，为避免产生沉淀，要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用分析纯。化学药品先以少量重蒸馏水充分溶解后然后混合，混合时需注意边搅拌边混合。CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O 时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。
配制铁盐母液时，FeSO4和Na2-EDTA 应分别加热溶解后混合，并置于磁力搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20-30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。
使用上述配好的母液，按照稀释倍数，配制基础MS培养液：
1×MS大量元素，1×MS微量元素，1×MS维生素和氨基酸，1×MS铁盐，蔗糖30 g/L，定容后调节pH至5.8，高温高压灭菌。固体培养基含植物凝胶3.5 g/L或琼脂9 g/L。
另MS基本培养基可用Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (Sigma-Aldrich)快速配制。

播种方法：
将烟草种子在自然条件下进行浸种处理（无菌水中浸泡100h），自然晾干后依次用酒精（70%）和汞（0.1%）进行消毒处理，最后用无菌水洗涤3-5次，彻底清除残留于种子表面的汞。将消毒后的种子在无菌条件下播于MS固体培养基上，放入(25±2)℃的光照培养箱中培养。培养30d后取样测定。

配制培养液:
1.溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀
2.需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤
3.调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，一直到培养基的pH为5.8
4. 培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 mL或100 mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培养基，可分装25～30瓶。

高压灭菌 培养基的高压灭菌包括以下几个步骤。 第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。 第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶(以上物品都要用牛皮纸封口)，用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。 第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 ℃下，灭菌20 min。 灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用。