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2016-20 17学年第 1 学期文 献 综 述名 称 高效液相色谱法手性固定相分手性药物研究进展专 业 2016级药物化学 学 号 161320217 姓 名 李松子 导 师 柯美荣 指导老师 林子俺 时 间 2016年12月19日 高效液相色谱法手性固定相分手性药物研究进展摘要手性（chirality)是指化合物的分子式和结构式 相同，因分子空间排列不同导致两个分子互为镜像和实物的现象。手性药物（chiral drug)是指药物分子结构中引人手性中心后得到的一对互为实物与镜像的对映异构体（enantiomer) 这些对映构体的理化性质基本相似，仅旋光性质有所差别。目前在约2000种常用药物中有近500种药物以外消旋体的形式存在。外消旋体药物中可能只有一种对 映异构体有药效，其镜像分子却有毒副作用或药效相反或无药效：如左旋巴比妥酸盐抑制神经活动而右旋巴比妥酸盐却兴奋神经；右旋甲状腺素钠可降低血脂而左旋甲状腺素钠对心脏有毒副作用；抗菌药左旋氧氣沙星的药效高于其右旋体数倍对映异构体也对香料化学和农业化学方面有重要作用：如S-型的香芹酮有香菜味,而R-型却具有荷兰薄荷香味； 农药溴氰菊酯的8个异构体中，（3R,1R,S）异构体的杀虫活性是（3S, lS，R)的70多倍。手性药物的分离分析在生物和化学领域一直是研究热点。色谱法利用固定相与外消旋体之间的作用力不同使流动相洗脱时各组分保留时间不同而实现分离的目的。色谱法以其优良的识别能力成为目前应用最广泛的手性拆分方法，尤其在性药物的分离分析和纯度检测等方面。常用的手性色谱分离技术包括高效液相色谱法（HPLC)、气相色谱法（GC)、毛细管电色谱法（CEC)等根据侍分离化合物的分子结构选择合适的手性色谱非常重要。在用HPLC法分离手性物质时，可以通过改变色谱柱的流动相和固定相来改变改善HPLC的分离效果。根据手性固定相的不同来源，可分为天然、半合成和全合成三大类。本文介绍国内外近几年手性固定相拆分手性药物的研究进展，包括几种经典类型及一些新型手性固定相。固定相可分为几种经典的固定相：环糊精类手性固定相、多糖类手性固定相、Pirkle 型手性固定相、蛋白质类手性固定相。根据添加剂的性质可将手性流动相添加剂(CMPA)分为4类：配基交换型手性添加剂、手性离子型配合剂、环型葡聚糖添加剂以及基于其他作用的手性流动相添加剂。1.几种经典手性固定相的手性药物拆分1.1 环糊精类手性固定相 环糊精（CD）手性固定相分为化学键合固定相及物理涂覆固定相。化学键合固定相是将CD 或其衍生物通过共价键键合至硅球表面，这类固定相具有耐溶剂且高柱效等优点。环糊精物理涂覆是利用硅胶吸附特性，将CD 或其衍生物直接涂覆至裸露的硅球表面，是一种较为简单且有效的固定相制作方法，但由于这种方法多用于正相高效液相色谱，因此这方面的研究工作较少，这里主要介绍化学键合手性固定相。Nikolic 等使用中性-CD 化学键合固定相对药物有效成分S-氯吡格雷和会引起不良反应的R-氯吡格雷实现良好分离，并进行了方法学验证。由于天然CD 的手性识别能力有限，无法满足大量不同结构手性药物的分离，因此多种多样的衍生化CD被应用于手性分离。沈静茹等以双6-氧（3-间硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4 单酯）-4-CD 键合全多孔硅胶基质为高效液相色谱固定相，以正相和反相模式对药物扑尔敏进行了手性分离。Rao 等使用高效液相色谱反相模式及二甲基-CD 键合固定相对舍曲林手性对映体及5 种相关手性物质进行了分离及方法学验证，此方法足以对舍曲林进行质量控制和纯度检测。目前研究较多的还有帽形（capped）CD，其中CD 和其他主体超分子化合物（如冠醚、杯芳烃等）偶联起来，形成一种具有多重识别位点的主体化合物，其中两种主体超分子的协同效应增加了对客体分子的识别，表现出优秀的手性识别能力和分离选择性。Zhao 等合成利福霉素帽形（- 3（- 2-O-环糊精）-2-羟基丙氧基）-丙基甲键合手性固定相（RCD-HPS），其具有两个手性结合位点：利福霉素和-CD，对于华法林等几种芳香位置异构体的手性药物显示出良好的分离能力。1.2多糖类手性固定相 多糖类手性固定相是将多糖键合至硅胶上，通过在羟基上连接各种不同取代基团，得到具有不同手性识别能力的HPLC 固定相。多糖含有众多的可能作用位点，其手性识别能力被归因到具有手性的碳水化合物单体及其螺旋形二级结构。目前，多糖类手性固定相是HPLC 手性分离中应用最为广泛的一类固定相。Peng 等在反相HPLC 模式下，利用200 余种外消旋体手性药物，检测了20 多种多糖衍生化手性固定相的分离能力。Antonina 等利用多糖手性固定相分离了特康唑、联苯苄唑等10 种抗真菌手性药物对映体，并根据改变键合有不同类型多糖的HPLC 色谱柱、色谱分离温度、药物主要成分、流动相添加剂等条件，观察出手性对映体经分离洗脱顺序的逆转。Mohamed等使用纤维素手性柱对血浆及药物制剂中的克仑特罗进行了分离及鉴定，通过方法学验证证实该HPLC 方法对该药物具有高度专一性，可以用于药物质量控制及治疗药物监测。Kazoka 等对两种吡拉西坦衍生物使用6 种多糖手性固定相进行了分离，并寻找出了手性识别能力较高的多糖固定相。通常，在HPLC 分离手性药物时，在流动相中加入少量的添加剂，可以改变分离效果。Mosiashvili 等系统研究了在极性有机流动相、多糖类手性柱作为固定相时，添加酸性或碱性添加剂对几种碱性药物手性分离的影响。1.3Pirkle 型手性固定相 Pirkle 型手性固定相是将单分子层的手性有机分子通过适宜的连接基团键合到硅胶载体上制得的，因而被称之为“刷型”或“束型”。由于良好的载样能力，Pirkle 型固定相非常适用于临床前少量药物的HPLC 手性分离制备。过去几年，Pirkle 型Whelk-01 手性固定相在药物开发早期解决手性分离工作，在所有商业可得的Pirkle 手性柱中，研究显示只有Whelk-O 1 型对特殊的活性药物显示出了手性异构体分离能力。Thomas等发明了柱耦合方法，提高了Whelk-O 1 手性柱的分离效率及应用范围。William 等使用4 种Pirkle 型手性固定相分离一种新型的苯吗喃类药物，结果显示，仅有Whelk-O 1 手性固定相能够达到较好分离效果。Karol 等使用点击化学的方法合成Pirkle-阴离子交换混合型手性固定相，在正相、反相等液相色谱条件下，均基线分离了洛芬类药物。1.4蛋白质类手性固定相 蛋白质是由氨基酸为单位组成的具有复杂三维结构的生物大分子，所有蛋白质都具有识别手性分子的潜力。蛋白质类手性固定相的优点是在反相液相色谱法中可以用水作为流动相，虽然具有良好的手性选择能力，但较差的稳定性和较小的载样量限制了此类固定相的应用。牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、-酸性糖蛋白（AGP）是主要用于手性分离的蛋白质，它们通过多种方法被固定在二氧化硅基质上，制成HPLC 固定相。Stewart 等将BSA 固定在琼脂糖基质上，作为手性固定相进行液相分离。Mallik 等通过巯基将蛋白质及其他配体固定化在二氧化硅填料上制成固定相，其中HAS 作为被键合的模型蛋白在HPLC 中显示出高亲和力，对手性药物华法林和布洛芬实现了良好分离。由于青霉胺紫外吸收强度较弱，Bhushan 等以茚三酮作为可逆的标记试剂，利用AGP 手性固定相进行分离，优化出了最佳分离条件（分离度超过2）并进行了制备。Akapo 等使用AGP 手性固定相对福莫特罗的4 种立体异构体进行了HPLC分析方法的建立和验证。2.基于不同手性流动相添加剂(CMPA)的分离方法2.1配基交换型手性添加剂(CLEC)在CLEC中，手性配基多为光学活性氨基酸(AA)或其衍生物，其光学纯度高，易与过渡金属配位。其拆分机理是2：手性配基和二价金属离子形成螯合物，以适当的浓度分布于流动相中，被拆分的溶质消旋体也称选择靶，手性配基与选择靶基于对映异构体的选择性，与金属离子共同形成消旋异构体的配合物，然后在正相或反相色谱柱上完成其拆分过程。常见的手性配基有：L-2-异丙基一4-N-辛基-二乙烯基三胺(L-2-isopropyl-4-N-octyl-diethylenetriamine)，L-脯氨酸-N-辛基氨(L-Pro-N-octy-1amide)，L-脯氨酸(L-Pro)，L-精氨酸(L-Arg)，L-组氨酸(L-His)，L-氧甲基组氨酸(L-His-O-CH3)，L苯丙氨酸(L-Phe)，L-天门冬氨酸(L-Asp)等。配位螯合的金属离子有：zn2+，Ni2+，cd2+，Cu2+等。早在1979年Lindner等首先用L-2-iso-propyl-4-N-octyl-diethylene triamineZn2+添加于流动相，用离子交换柱分离了未衍生化氨基酸对映体。近年来，王金朝等以L-氨基酸和锌离子作为手性流动相添加剂，用于直接拆分扁桃酸和邻氯扁桃酸，该法简便快速，并可以用于其他类似羟基酸对映体的拆分。在配位螯合金属离子中以Cl2+应用最多，王荣等研究得较为系统。他们用HPLCCMP法对甲状腺素对映体(D-,L-T4)进行了分离，使用L-脯氨酸作为手性添加剂，在流动相中加入Cu2+使之形成螯合物。该方法分离条件简单，重现性好。在此基础上，他们又用正相HPLCCLEC，建立了甲状腺片中甲状腺素对映体(L-,D-T4)的拆分方法，通过流动相中添加L脯氨酸、醋酸铜及三乙胺对甲状腺片中甲状腺素对映体进行测定。在所建立的色谱条件下，甲状腺素L-,D-两种异构体得到基线分离，并测定了甲状腺片中的L-，D-T4的含量，结果显示同一厂家不同批号甲状腺片含量不同。该法简便、快速、准确、成本低，可作为样品的检测及药品质量控制方法。他们还用相同的方法和手性试液对人血清中D-,L-T4进行了测定，该法用于测定甲状腺机能亢进(甲亢)、甲状腺机能减退(甲低)患者血清中的D-,L-T4的浓度，可为临床用药提供理论依据，对疾病的治疗起到了积极的作用。王荣等运用已建立的配位体交换液相色谱方法，以新型配位添加剂(R，R)酒石酸-单-N-辛胺(TAMOA)为研究对象，将有关文献进行了总结，对配位金属离子手性添加剂拆分药物对映体的机理及影响因素进行了讨论。2.2手性离子型配合剂(CIPC)CIPC添加剂是在离子对HPLC基础上发展起来的。有机酸或碱能与离子对试剂在流动相中反应生成低极性不解离的离子对，其中的正相离子对色谱广泛用于手性药物分离，其基本原理是：在低极性的有机流动相中，对映体分子与手性离子对试剂之间产生静电、氢键或疏水性反应生成非对映体离子对。两种非对映体离子对具有不同的稳定性，并且在有机相与吸附固定相间的分配行为也有差异，因而得以分离。Bowman发现了酒石酸衍生物对对映体的手性识别作用，Prelogu利用这一原理使氨基醇类对映体用液液分配色谱成功地作了拆分(含烷基酒石酸酯的有机相和六氟磷酸盐离子的水相)。He等用(2R，3R)双正丙基酒石酸(DPT)作为手性流动添加剂，在HPLC硅胶柱上成功的分离了4种烷基托品酸酯对映体。2.3环型葡聚糖(CD)添加剂含有612个葡萄糖单元，以a-(1、4)连接而成的手性环糊精类化合物(CD)，其结构特征具有重要的色谱应有价值，将CD分子视为锥形筒体，筒腔内部呈相对疏水性，可容纳较低极性的分子或基团(也称客体)，筒口则由于CD分子的a-OH基呈顺时针向排列，可与客体的极性部分成氢键缔合，客体受体形成所谓包埋配合物，因而具有良好的手性识别特征。CD作为CMPA有一些重要性质：1)在溶液中CD的包埋作用不仅是立体择性的，而且是可逆的；2)复合物形成的速率常数与可控的扩散过程的速率常数通常为同一级，故在溶液中的平衡相对较快；3)在较大pH范围内cD分子是稳定的；4)CD具有耐光性，在通常用于色谱检测的全部紫外检测波长范围内无吸收；5)CD无毒性，并可根据溶质的结构特征分别选用cD的Ot，a，b，r同系物。作为手性CD流动相，波兰学者Deboeski等先作报道，用以拆分扁桃酸的对映体。他们选择了各种不同性质及不同取代位置的扁桃酸衍生物，研究了包埋配合物结构与对映异构体选择性的关系，发现扁桃酸-Cl衍生物与-CD所形成的配合物具有很高的对映体选择性（a=18)；反之，a-CD与扁桃酸及其衍生物的配合物的选择性较低。2.4动态手性固定相甲基化环糊精、(2R，3R)-双-正丁基酒石酸等可以少量强烈吸附于固体填充剂表面上，使伺定相表面手性化，形成的动态手性固定相在洗脱过程中与溶质分子相互作用，对映体因与覆盖于固定相表面的添加剂之间的作用力强弱而被分离。表面活性剂胆酸盐加到流动相中，形成由非胶束胆酸盐溶剂化的ODS和胆酸盐胶束吸附于ODS组成的非均态手性固定相，栾扬等采用手性流动相添加剂脱氧胆酸钠拆分1，1-双萘基-2，2-二氢磷酸盐手性化合物，方法简便，拆分效果及重现性好。2.5万古霉素类添加剂万古霉素是一种高效的手性选择试剂，已经有人成功地将万古霉素作为手性添加剂应用于CE和TLC的手性分析，并获得了很好的手性分离结果。Guo等以去甲万古霉素为手性流动相添加剂，拆分了(R)-，(S)-酮洛芬对映体，获得了良好的分离效果，所用的浓度小于万古霉素。叶晓霞等以丹酰化苯甘氨酸、丹酰化苯丙氨酸、丹酰化丝氨酸、丹酰化丙氨酸为模型化合物，通过对色谱柱类型、缓冲液类型、pH和盐浓度、万古霉素用量、甲醇用量、柱温等色谱参数进行考察，建立了以万古霉素为手性流动相添加剂在普通色谱柱上进行手性分析的色谱系统，并在该系统中成功地拆分了酮洛芬对映体。他们还以万古霉素为手性选择子，建立了酮洛芬对映体以手性柱法和CMPA法进行手性分析的方法。所建立的两种方法均可用于s-(+)-酮洛芬的光学纯度检测。此外，还有蛋白质复合物和手性诱导吸附。蛋白质类(BSA，a1-糖蛋白)作为手性添加剂，可以通过疏水性、静电、氢键和电荷转移等反应，形成蛋白质溶质复合物分离药物对映体。手性诱导吸附是利用诱导吸附原理，将手性诱导剂加到流动相中，与对映体分子共同竞争性地吸附到非手性固定相表面，发生立体反应形成不稳定的非对映体对复合物。展望总之，固定相与手性药物对映体发生手性识别作用，则一定有三点相互作用。随着计算机化学的不断发展，与传统方法相比，CSP 的设计达到了更高水平。组合方法与高通量合筛选已用于研制高选择性的具有手性识别能力的固定相。数据库结合扩展的自动筛选方法学，再配合多通道微流控HPLC，将提供一个真正高通量方法，以快速鉴别最有前景的CSP。用CSP 法分析分离外消旋手性药物是一种经济而有效的途径。HPLC手性流动相添加剂法拆分对映体操作简便，分析过程较少发生消旋化，添加剂选择的范围较宽，纯对映体易从柱后洗脱液中回收。但是，CMP仍存在一些缺点，如系统平衡时间较长，添加剂消耗较大，对一些难分离的对映体拆分效果不够理想。解决的办法有两种：一是寻找更有效的CMPA；二是考虑协同作用，组合使用CMPA。而要得到分离效率高、稳定性好、适用范围广的手性固定相，和合适的流动相则需要对手性固定相和流动相添加剂识别机理更深入的研究。 （注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）