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逆境胁迫对植物生理生化代谢的影响

摘要：干旱、盐碱和低温是强烈限制作物产量的三大非生物因素,其中干旱造成的损失最大, 其损失超过其他逆境造成损失的总和。对植物产生伤害的环境称为逆境，又称胁迫。常见的逆境有寒冷、干旱、高温、盐渍等。逆境会伤害植物，严重时会导致植物死亡。逆境对植物的伤害主要表现在细胞脱水、膜系统受破坏，酶活性受影响，从而导致细胞代谢紊乱。有些植物在长期的适应过程中形成了各种各样抵抗或适应逆境的本领，在生理上，以形成胁迫蛋白、增加渗透调节物质（如脯氨酸含量）、提高保护酶活性等方式提高细胞对各种逆境的抵抗能力。以小麦幼苗为材料，设置对照组，探究了干旱胁迫下脯氨酸（pro）、谷胱甘肽(GSG)、丙二醛(MDA)、H2O2的含量变化以及抗氧化酶(POD、PPO)活性的变化。结果表明：在干旱胁迫下，脯氨酸（pro）、谷胱甘肽(GSG)、丙二醛(MDA)、H2O2的含量相对于对照组均有较明显的上升趋势，POD和PPO活性也表现出较大水平的提高。

关键词：干旱胁迫,抗逆性，脯氨酸，丙二醛，样品，细胞膜透性，过氧化物酶活性，叶绿素，可溶性糖。谷胱甘肽；抗氧化酶；H2O2

引言：干旱是我国农业可持续发展面临的主要问题之一, 【1】干旱胁迫对植物的影响是一个复杂的生理生化过程，涉及到许多生物大分子和小分子植物细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是其最重要的功能之一。【2】研究表明，游离的脯氨酸在植物细胞抵抗非生物胁迫过程中扮演着越来越重要的角色，许多新的生理功能也逐渐被发现，近几年来有关脯氨酸的研究倍受科学工作者的关注【9-13】。干旱是一种最常见的胁迫，遇此逆境作物除进行气孔调节外，渗透词节也不夹为一种有效方法。原理是通过加强合成代谢，增加细胞内渗透物质浓度，降低渗透势，维持膨压和细胞正常生理功 能。脯氨酸作为水溶性最大的氮基酸(162．3g· (100g)。H 2O，25 oC)具有较强水合能力，是理想的渗透介质。作物遇旱时它的大量积累有助于细胞或组织持水，防止脱水，故可视为作物对干早环境的一种保护性适应。已经证明了在逆境条件下脯氨酸的积累来抵抗植物对非生物胁迫的伤害，植物体内的抗氧化酶系统也能将伤害细胞的活性氧控制在可忍耐水平内，通过各种过氧化酶的协同作用，可以把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧如O2-、H2O2、OH-等直接或间接地清除，防止了活性氧放大级联作用，保证了细胞内生命活动的正常进行。丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，对干旱也具有抵抗作用。GSH作为生物体内主要的还原态硫之一，在生物体抵抗各种胁迫(冷害、干旱、重金属、真菌等)的过程中起着重要的作用，其含量水平的高低与植物对各种环境胁迫的忍耐程度密切相关。近些年来，它在高等植物代谢过程中的生理作用，尤其是在植物抵御活性氧伤害过程中的作用及其与植物抗逆性关系的研究进展很快。前人研究进展植物在正常生长情况下

, 活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。当植物在逆境条件下( 如干旱胁迫) 生长时, 这种平衡被打破, 体内负责清除活性氧的抗氧化系统能力下降, 从而造成活性氧的大量积累, 并引发或加剧膜脂过氧化作用, 导致生物膜系统受损。过氧化物酶( POD) 、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物GSH(谷胱甘肽)等能够有效地清除这些自由基, 是酶促防御系统的重要组成成分。人们根据这一理论对干旱胁迫下的许多作物如小麦【3-4】、大豆【5】、辣椒【6】、胡杨【7】等逆境生理过程进行了研究。本实验切入点与其它作物相比, 小麦在干旱胁迫下具有独特的生存策略, 是一种公认抗逆性较强的作物, 利用干旱胁迫处理小麦幼苗, 测定其丙二醛( MDA) 含量、GSH含量、脯氨酸含量、H2O2含量及 PPO、 POD 活性变化, 探讨干旱胁迫对小麦幼苗膜脂过氧化及酶保护系统的影响, 为进一步明确大麦抗旱的生理机理提供一定理论依据。
植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，如高温、干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以至于植物细胞侵提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。

1 材料与方法
1.1 种子发芽率的测定的材料培养和处理
品种为晴3或鲁玉13的玉米种子或小麦种子（购于西山种子公司），用0.1%HgCL2消毒10min后，用蒸馏水漂洗干净，再用蒸馏水于26℃下吸胀12h后即可用于实验。
1.2 主要试剂：0.1% HgCl2 ，TTC，3%磺基水杨酸（SSA），冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8) ，0.6%TBA（用0.6% TCA配制）， PBS (pH=6.8，内含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2 [用20%(v/v) H2SO4配制] ，PBS, （pH=5.8,内含0.１mmol/ LEDTA, 1%PVP）， POD反应混合液（10　mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解），PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙酸，PBS (pH=7.7) ，4 mM DTNB (用0.1M pH=6.8PBS现配)。主要仪器：分光光度仪，离心机，试管，微量加样器，研钵等。
1.3 余下实验材料培养和处理
小麦种子吸胀12h，在湿润滤纸上培养7天，正常组即对照组继续正常培养，干旱组即实验组再干旱处理五天后用于实验。

2方法
2.1 种子发芽率的测定
所采用的种子发芽率的测定方法是曙红染色法和TTC染色法。凡是有生命活力的种子胚部，在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生命活力的种子胚则无此反应。当TTC渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH2或NADPH2）上的氢还原时，便由无色的TTC变为红色的TTF【8】。用曙红染色的，凡是全部着色或胚已着色的种子表示失去了生活力,播后不能发芽，生活力强的种子是不会着色的,因为活细胞具有半透性膜,可防止染料分子通过而不着色，死亡细胞,其壁膜失去半透性,染料分子易进入,使原生质着色。

各取50粒吸胀的小麦种子→沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验：其中50个半粒进行TTC染色（30℃水浴 20 min）; 另50个半粒进行曙红染色（室温染色10 min）。根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。
2.2 脯氨酸含量的测定
用茚三酮法测定脯氨酸含量，在酸性条件下，茚三酮与脯氨酸反应生成红色化合物，在520nm下有最大吸收值。【13】分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 3% SSA洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。上清液各2 mL →分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂→煮沸15 min→冷却后→5000 rpm离心10 min →分别测定A520。
2.3 MDA含量
用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量【18】。
分别取0.1 g实验组和对照组→加入3 mL 50mM PBS (pH=7.8)和少许石英砂→充分研磨→用2 mL PBS洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。
测定：分别取上清液各2 mL →加入0.6%TBA（用0.6% TCA配制） 2 mL→煮沸12 min→冷却后→5000 rpm离心10 min →分别测定OD450和OD532.
计算公式：OD450=C1×85.4
OD532= C1×7.4+155000×C2
求解方程得：C1/（mmol/L）=11.71 OD450
C2/（mol/L）=6.45 OD532- 0.56OD450,式中，C1为可溶性糖的浓度，C2为MDA的浓度。
2.4 抗氧化酶活性的测定
用愈创木酚法测定POD活性，用邻苯二酚法测定PPO活性。在有过氧化氢存在的条件下过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量其含量，进而计算POD的活性。多酚氧化酶能使邻苯二酚氧化生成醌，用比色法测量其产物的形成，进而计算出PPO的活性。
POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）3.00 ml，加入酶液100 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应3 min时的A470。
PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.8 ml，加入酶液0.2 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应 2 min时的A410。
计算公式：POD activities = (mmol.g-1FWmin-1)
PPO activities = (U.g-1FW)
2.5 H2O2含量测定
H2O2提取：分别取0.5 g实验组和对照组→加入3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，内含1mM HA)和少许石英砂→充分研磨→用2 mL PBS洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。

测定：分别取上清液各3 mL →加入0.1%Ti(SO4)2 [用20%(v/v) H2SO4配制] 1 mL→摇匀→ 5000 rpm离心10 min → OD410
计算公式：H2O2 content = (mmol.g-1FW)

3、 结果与分析。
3.1种子发芽率的测定
分别计算两种方法的发芽率：
小麦：TTC法中， 35／50=70%；曙红染色法中，38／50=76%。

玉米：TTC法中， 36／50=72%；曙红染色法中，32／50=64%。
样品 TCC方法 署红染色法
50粒小麦种子 35粒具生命力 38粒具生命力
50粒玉米种子 36粒具生命力 32粒具生命力
3.2脯氨酸含量的测定
实验组：A520=0.088, 对照组：A520=0.060，
计算公式：Pro content=(mol.g-1FW)
其中，V显=6ml，V总=5ml，V用=2ml，520=3.24mol-1.cm-1,L=1cm,W=0.1g.
计算结果：实验组脯氨酸含量为4.074mol.g-1FW，对照组脯氨酸含量为2.777mol.g-1FW.

表一 Pro正常组和实验组的A520和Pro content

干旱胁迫
正常
A520=0.088
Procontent=4.074(mmol.g-1FW)
A520=0.060
Procontent =2.777(mmol.g-1FW)

由上表可知，干旱胁迫下，脯氨酸的量是正常值的1.47倍，由此可以得到，干旱胁迫会造成脯氨酸的积累。但是，植物合成、累积及代谢是一个受非生物胁迫的一个过程，因此，脯氨酸的积累可能是生物受胁迫的一个信号。当植物处于干旱条件下时，为了保护植物对干旱逆境的反应，在干旱胁迫下，脯氨酸的质量分数会急剧上升。而脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，这表明它具有易于水合的趋势或具有较强的水合能力。它的增加可能是植物对干旱胁迫的一种保护性反应。3.3、MDA含量

测得的结果如下表所示：

OD450
OD532
实验组
1.500A
0.454A

对照组
0.380A
0.201A
计算公式：OD450=C1×85.4
OD532= C1×7.4+155000×C2
求解方程得：C1/（mmol/L）=11.71 OD450
C2/（mol/L）=6.45 OD532-0.56OD450,式中，C1为可溶性糖的浓度，C2为MDA的浓度。

最后计算得出浓度如下表：

实验组
对照组
C1/（mmol/L）
17.565
4.446
C2/（mol/L）
2.088
1.084

由上表可知，干旱胁迫下，丙二醛的浓度是正常情况下得2倍，因此，在干旱胁迫也会造成MDA的积累，MDA的最大特点是对细胞质膜和细胞中的许多物质均有很强的破坏作用，因此，植物组织可能是通过产生并积累MDA等对细胞有害物质，进而破坏植物组织，使植物在逆境坏境中生长不好。
3.4、抗氧化酶的测定
POD活性： 实验组为85.51 U.g-1FW，对照组为40.73 U.g-1FW.
PPO活性： 实验组为4.385×10-4 mmol.g-1FWmin-1，
对照组为4.002×10-4 mmol.g-1FWmin-1。

表三 正常组和实验PPO和POD不同时间所测得值PPO和POD

正常
干旱胁迫
PPO A410=0.115（1 min20S）
PPO A410=0.126（1 min20S）
POD A470= 1.16（1min20S）
POD A470=2.457（1 min20 s）
PPO activities =4320(U.g-1FW)
PPO activities = 4737(U.g-1FW)
PODactivities=807.4(mol.g-1FWmin-1)
PODactivities=1710.2(mol.g-1FWmin-1)

以上数据是通过以下方程计算而得
POD activities =
(mmol.g-1FWmin-1)
PP tivities =
(U.g-1FW)

由上表可知，在干旱胁迫下，也会造成PPO和POD的积累。抗氧化酶的主要作用是消除ROS对植物的伤害，使抗氧化酶与ROS处于一个动态平衡。在干旱胁迫下，抗氧化酶总体增加，说明，这一个动态平衡体系被打破，使植物不能消除ROS对自身的伤害，因而，逆境下植物生长不好。
3.5、 H2O2 的测定

表五 正常组和实验组H2O2的A410和H2O2 content

正常
干旱胁迫
A410=0.623
A410=1.781
H2O2content=10.09(mmol.g-1FW)
H2O2 content=28.86(mmol.g-1FW)

以上H2O2 content是通过以下公式计算而得：
H2O2content =
(mmol.g-1FW)

由上表可知，干旱胁迫下，也会造成过氧化氢的积累。过氧化氢是体内重要的代谢产物，其积累对细胞具有氧化破坏作用，其含量的高低，一定程度上反映了CAT活性的高低。因此，在干旱胁迫下，有可能是CAT酶活性降低，造成过氧化氢在植物体内的积累，从而破坏了细胞的氧化作用，使植物不利于在逆境中生长。

4 小结与讨论
从实验中我们可以看到在干旱胁迫处理下，引起的一系列生理生化指标的差异性变化，相比于未作处理的小麦,经过干旱胁迫处理的小麦色素浓度明显增大，电导率大，过氧化物酶的活性较低，MDA含量减少。

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【5】王晓琴;玉米幼苗对水分胁迫的生理反应及其与品种抗旱性的关系研究[D];四川农业大学;2002年。
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