细菌DNA提取方法综述.doc

. 细菌DNA提取方法综述姓名：刘燕 学号：1430170088 班级:周二班摘要： 高效稳定的细菌基因组 DNA 提取方法对后续分子生物学的研究有着重要的意义。不同的方法提取的 DNA 产量和纯度等方面有差异，会对后续步骤产生很大影响。本文综述了目前广泛使用的 DNA 提取方法。关键词：细菌、基因组DNA、提取方法 现代分子生物学技术如 DNA 重组技术(又称基因工程)、分子克隆技术、PCR 技术等，为进一步认识生命活动的本质，更好地利用其规律为人类服务提供了重要手段(马尧等, 2005)。但是，DNA 分离是成功利用这些技术的第一步，也是非常重要的一步，可以说 DNA 质量的好坏直接决定了后续实验的成败。1 基因组DNA提取方法不同，对细菌DNA降解程度的影响也不同，因此，从细菌中提取基因组DNA的潜在困难较大。 目前国内外很多学者都在积极探索并研究各种高效的细菌基因组DNA提取方法， 本文就近10年来国内外有关细菌基因组DNA的提取方法进行综述。21 DNA细菌提取方法 综合国内外文献，大致将细菌基因组DNA取提方法分为3大类： 机械法、化学法和酶法。机械法包括冻融法、超声波法和玻璃珠法等; 化学法包括加入SDS 和苯酚等; 酶法包括加入裂解酶、蛋白酶 K 和溶解酶等。3 1.1机械法 液氮冷冻研磨破碎细胞壁的方法通常用于植物总基因组 DNA 的提取破碎细胞的物理方法。对于不同的样品，需要根据具体的实际情况对超声条件进行优化。超声波法常与其他方法结合使用， 如与复合螯合剂( 脱氧胆酸钠 +PEG +Chelex 100) 等结合使用。微珠振荡法也是常被研究者们采用的一种 DNA 提取方法。赵文怡等10比较不同方法破除金黄色葡萄球菌细胞壁时，发现玻璃微珠法可以有效破坏金黄色葡萄球菌的细胞壁， 所提取的基因组 DNA 可以作为模板用于 PCR 试验。3 1.2 化学法 化学法主要是指通过添加化学试剂使细胞裂解从而释放出 DNA，所用化学药品主要有 SDS 和苯酚等。1）DNA-SDS）传统抽提法（酚氯仿法）：先用（十二烷基硫酸钠）溶解破坏细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并沉淀蛋白质；然后用蛋白酶K水解消化 蛋白质，特别是与DNA 结合的组蛋白，使DNA得以释放； 再用有机溶剂去除蛋白质和其他细胞组分；最后用乙醇沉淀核酸。2）加热煮沸法：通过加热煮沸使菌体破裂、蛋白热变性沉淀并释放DNA。3）Chelex-l00抽提法： 离子螯合剂Chelex-100悬液在100碱性环境(pH10-11)条件下，导致细胞膜破裂，DNA变性和释放， 同时能通过结合金属离子，防止所提取的DNA降解。 4）改良DNA抽提方法：即几种提取方法的结合或条件的优化， 有改进溶菌酶法、SDS-NaOH法、SDS-酶裂解法、SDS-CTAB法SDS-PVP法和Chelex-l00煮沸法等。5) 试剂盒抽提法：利用新型硅基材料Hi-bind的可逆结合特点，联合迷你柱旋转分离技术，将细菌DNA 结 合 到 柱 上 ， 再 用 无 菌 去 离 子 水 洗 脱DNA。 主要有离心柱法、真空泵法等，也有报道采用自动化操作提取细菌基因组DNA.9 1.3酶法 目前广泛使用的酶法是溶菌酶法。溶菌酶能切断肽聚糖中 N- 乙酰葡萄糖胺和 N- 乙酰胞壁酸之间的 - 1， 4 糖苷键， 破坏肽聚糖支架， 从而细菌细胞在内部渗透压的作用下胀裂而死亡。赵文怡等比较了不同方法破除金黄色葡萄球菌细胞壁的结果， 发现溶菌酶法用时最长， 且效率最低。而刘敏等通过比较几种不同的细菌 DNA 提取方法提取金黄色葡萄球菌DNA 得出结论， 溶菌酶能有效地降解金黄色葡萄球菌细胞壁，且用溶菌酶破壁后提取的 DNA 适于 PCR 试验。32几种细菌DNA 提取方法的优劣 传统提取方法（酚-氯仿抽提法）及改良方法虽然效率较高，但费时费力，操作中需要多次离心，步骤繁琐，增加了样品污染的可能性，且提取过程中易造成 DNA损失。加入酚类物质或 SDS会严重干扰后续 PCR反应，且所用试剂有一定毒性，大量使用有害健康，易造成环境污染，不适合常规使用。 加热煮沸法操作简单、提取时间短，但加热过程中菌体破裂比例极少，且煮沸过程中部分 DNA降解，致使 DNA 提取效率很低。 同时因革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，加热不能使其破裂，故无法提取基因组 DNA ，这是该方法的另一大缺陷。 Chelex-100 煮沸法被认为是目前抽提革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌基因组 DNA 最为简便快捷的方法 4，且成本较低，但其所提 DNA 纯度比酚 - 氯仿抽提法低， 提取的 DNA 保存时间也有待验证，故该法只可用于短期研究。碱裂解法5 是一种简便的细菌基因组DNA提取方法，但该法需使用强碱，对 DNA 具有一定的腐蚀性。 在强碱性及一定温度条件下能迅速破碎细胞膜和核膜，使核酸酶变性，并释放 DNA ，此时 DNA 的一级结构相对完整，此方法在细菌质粒DNA 提取中应用较多。 SDS 裂解法及溶菌酶法一般需要复杂的裂解液体系，并借助蛋白酶 K 和 RNA 酶获得高质量的抽提产物，且部分药品及相关酶试剂价格昂贵6。 CTAB 抽提法常用于植物和部分革兰氏阴性菌中。 试剂盒法提取的 DNA 效率和产量相对较高、质量稳定、易标准化，但试剂盒价格昂贵，使用次数有限， 不适用于大量样本的基因组 DNA 提取。不同厂家和生产批次的试剂盒也有差异， 分别偏重于细胞、病毒、细菌的基因组 DNA 提取，对不同类型的样品效果也不相同。3 同一文献对不同方法提取效果和效率的比 较夏涵等7用加热煮沸法、酚 - 氯仿法、 Chelex-100 法及试剂盒法比较细菌基因组 DNA 提取产量和 OD 260 /OD 280 值，发现试剂盒法提取效果最好，Chelex-100 和酚 - 氯仿抽提法效果次之，沸水浴法效果最差， 4 种方法除沸水浴法均可扩增出 3 种细菌的目的基因片断，且效果较好，没有出现杂带和拖带现象。 姚红等8用酚 - 氯仿抽提法、 DNA 试剂盒抽提法、沸水浴法、溶菌酶裂解法、 SDS 裂解法对同种细菌基因组 DNA 提取得率进行比较， 发现溶菌酶 - 盐析法提取效率最高，酚 - 氯仿抽提法提取效率次之， 碱裂解煮沸法和溶菌酶煮沸法提取效率较低，加热煮沸法提取效率最低。4 细菌 DNA 提取的建议 1 ）实验研究时根据不同细菌，选择和建立不同提取方法，获得高纯度、高质量模板 DNA ； 2 ）提取过程中应多做几组平行样，以保证 DNA提取得率及质量的准确性； 3 ）用乙醇洗涤后无法看到 DNA 沉淀时，可加入醋酸铵，出现沉淀后再用乙醇洗涤； 4 ）在细菌基因组 DNA 提取过程中，某些物理、化学因素也会影响 DNA 的提取效率或后续实验的准确性，因此在提取细菌 DNA 的过程中应将这些物质净化处理， 尽量减小提取过程中引进的物质对后续实验研究的不利影响； 5 ）提取的细菌基因组 DNA 用乙醇多次洗涤，去除杂质后再保存备用。5 结论与讨论 比较文献后发现， 大部分文献都采用改良方法和试剂盒法提取 DNA ，以提高 DNA 得率，但相同方法在不同文献中得到的细菌基因组 DNA 得率相差较大，没有可比性。 综合比较各文献 DNA提取得率和同一文献或实验室中使用不同的提取方法可知 ,改良后的传统法提取得率较高,Chelex-100和试剂盒法次之，加热煮沸法最低。 目前，有效、快速、经济地提取高纯度、高质量的细菌基因组 DNA ,仍是分子生物学研究的基本问题。 本文针对近几年国内外的各种 DNA 提取方法进行阐述比较后发现：简化实验步骤，用非有机溶剂法代替传统的有机溶剂法以减少污染，采用各种固体吸附剂有效去除 PCR 反应抑制剂以及降低成本，已成为提取细菌基因组 DNA 的发展趋势。参考文献：1 熊明华,朱继荣,王光利,等.一种快速经济提取革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌基因组 DNA 的方法J.基因组学与应用生物学,2016年，第35 卷，第2 期，第 385-390页.2郝敏,刘占英,杨天舒,等.细菌基因组 DNA 提取方法概述J.生物学通报 ,2014年,第49卷,第3期.3高慧琴,刘凌.PCR-DGGE技术中不同 DNA 提取方法综述J. 安徽农业科学， Journal of Anhui AgriSci2011， 39( 1) :52，102 .4Cheng H. R., Jiang N. Extremely Rapid Extraction of DNA from Bacteria an Yeasts.Biotechnol Lctt,2006,28(1):5559.5周双清,黄小龙,黄东益等. Chelex-100快速提取放线菌DNA作为 PCR扩增模板.生物技术通报,2010,(2):123125. 6 余道军,童文娟,陈岳明等.临床标本细菌基因组 DNA提取方法探讨.中国微生态学杂志,2007,19(6):519.7夏涵,府伟灵,陈鸣.快速提取细菌 DNA方法的研究.现代预防医学,2005,32(5):571573.8姚虹,吕治,苏建荣.不同方法提取阴道加德纳菌细菌基因组 DNA的比较.中国实验诊断学, 2011,15(1):123125.9 Stormer M., Kleesiek K., Dreier J. High-volume extraction of nucleic acids by magnetic bead technology forultrasensitive detection of bacteria in blood component. Clin Chem, 2007,53(1):104105.10赵文怡，高强，谯娜娜，等 玻璃微珠法提取葡萄球菌基因组 DNA 的研究J 现代食品科技，2010( 2) : 154 1566 / 6