转染技术原理及应用.doc

常规转染技术分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只连续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，经常用到一些报告系统如荧光蛋白，半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也也许作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其重要原理及应用特点见下表：转染方法原理应用特点磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染瞬时性转染不合用于原代细胞操作简便但反复性差有些细胞不合用DEAE-右旋糖苷法带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架互相作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可反复但对细胞有一定的毒副作用转染时需除血清电穿孔法高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入稳定转染瞬时性转染所有细胞合用性广但细胞致死率高，DNA和细胞用量大， 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件病毒介导法通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等逆转录病毒特定宿主细胞但携带基因不能太大细胞需处分裂期需考虑安全因素腺病毒通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中瞬时转染特定宿主细胞可用于难转染的细胞需考虑安全因素阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染所有细胞合用性广，转染效率高，反复性好，但转染时需除血清。转染效果随细胞类型变化大Biolistic颗粒传递法将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达瞬时性转染可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞显微注射法用显微操作将DNA直接注入靶细胞核稳定转染瞬时性转染转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞（各种转染方法的比较）除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其合用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，并且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有助于细胞定位，因此与BPEI相比应当转染效率高一些。但最近研究表白BPEI的分枝度高有助于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物具有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种具有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。影响转染实验的因素 转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学实验中，其应用越来越广泛。影响转染效率的因素有很多，细胞株自身的特性和活性，细胞培养条件，转染的DNA或RNA的质量，转染方法，转染试剂的选择等。常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只连续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，经常用到一些报告系统如荧光蛋白， - 半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也也许作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染效率受多种因素影响，重要因素有下面几个：1转染试剂不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验规定和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒、方便、便宜的转染试剂。2细胞状态一般低的细胞代数（50）能保证基因型不变。最适合转染的细胞是通过几次传代后达成指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。也就是说同一种系的细胞株，在各实验室不同培养条件下，其生物学性状发生不同限度的改变，导致其转染特性也发生变化。因此，假如发现转染效率减少，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。3转染方法不同转染试剂有不同的转染方法，但大多大同小异。转染时应跟据具体转染试剂推荐的方法，但也要注意，因不同实验室培养的细胞性质不同，质粒定量差异，操作手法上的差异等，其转染效果也许不同，应根据实验室的具体条件来拟定最佳转染条件。（1）细胞培养物健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染试剂都会有专门的说明。推荐在转染前24小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增长对外源DNA摄入的也许。一定要避免细菌，支原体或真菌的污染。（2）细胞密度细胞密度对转染效率有一定的影响。不同的转染试剂，规定转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率减少，乃至表达水平偏低。因此假如选用新的细胞系或者新的转染试剂，最佳可以进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，涉及适当的接种量和培养时间等等。阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，有的规定细胞90%汇片；而有些多胺或者非脂质体的配方则规定在40%-80%之间，总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果。不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择可以在较低铺板密度下进行转染的试剂。一般转染时贴壁细胞密度为50%-90%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书。（3）血清血清一度曾被认为会减少转染效率，老一代的转染方法往往规定转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染，但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。但是转染产品配方几经革新后的今天，对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至尚有助于提高转染效率，如阳离子聚合物等，血清的存在会影响DNA转染复合物的形成，但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基或PBS来稀释DNA和转染试剂就可以了，在转染过程中是可以使用血清的。但是要特别注意：对于RNA转染，如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。胎牛血清（FCS）经常用到，便宜一点的有马或牛血清。通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响细胞生长，因此也会影响转染效率。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。（4）抗生素细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染，但是这些添加剂也许对转染导致麻烦。比如青霉素和链霉素，就是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但有些转染试剂增长了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这也许间接导致细胞死亡，导致转染效率低。目前转染试剂由于全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的完全培养基来操作，非常方便，省去了污染等麻烦。（5）氮磷（N/P）比N/P比是转染效率的关键（为了换算方便，一般以DNA/转染试剂质量比表达），在一定比例范围内转染效率随N/P比成比例增高，之后达成平值，但毒性也随之而增长，因此在实验之前应根据推荐比例，拟定本实验的最佳转染比例。（6）DNA质量DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，假如DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行，但对GenEscort系列转染试剂影响不大。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达成两倍2CsCl梯度离心以上的纯度效果，使您不必为DNA质量操心。此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证抱负的转染效果。但假如使用GenEscort转染试剂，一般不需要这么高的DNA质量规定。当使用GenEscort转染试剂时，即使采用传统的酚氯仿沉淀方法纯化质粒，仍然可达成非常好的转染效果，但所用的质粒量比试剂盒纯化方法的DNA用量大一些。4载体构建转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR产物，寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还规定特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响。假如基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。转染技术的要点及转染试剂对的选择转染技术的要点及转染试剂对的选择转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。以下就向大家介绍一些转染的技术要点及市面上重要的转染试剂类型的选择。常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只连续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-96小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，经常用到一些报告系统如荧光蛋白，半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也也许作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染效率收多种因素影响，重要因素有下面几个：1. 细胞培养物健康的细胞培养物是成功转染的基础。不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。低的细胞代数（50）能保证基因型不变。高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染试剂都会有专门的说明。推荐在转染前24小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增长对外源DNA摄入的也许。一定要避免细菌，支原体或真菌的污染。2. 血清大多数培养基在使用前需要加血清。胎牛血清（FCS）经常用到，便宜一点的有马或牛血清。通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。因此在转染前建议先测(转右)试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。3. 载体构建转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR产物，寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还规定特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响。假如基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。4. DNA质量DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，假如DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达成两倍2x CsCl梯度离心以上的纯度效果，使您不必为DNA质量操心。此外，对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证抱负的转染效果。5.转染技术转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其重要原理及应用特点见下：转染方法 原理 应用 特点 DEAE-右旋糖苷法带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架互相作用形成的复合物被细胞内吞 瞬时性转染 相对简便、结果可反复但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞 稳定转染，瞬时性转染 不合用于原代细胞，操作简便但反复性差，有些细胞不合用。电穿孔法高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入 稳定转染，瞬时性转染，所有细胞 合用性广但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件 阳离子性的脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染，所有细胞 合用性广，转染效率高，反复性好但转染时需除血清转染效果随细胞类型变化大 病毒介导法逆转录病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染，特定宿主细胞 可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等，但携带基因不能太大细胞需处分裂期，需考虑安全因素 ，腺病毒 瞬时转染，特定宿主细胞 可用于难转染的细胞，需考虑安全因素。 Biolistic 颗粒传递法将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达瞬时性转染 可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞 显微注射法用显微操作将DNA直接注入靶细胞核 稳定转染，瞬时性转染 转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞