分子生物学课件整理.doc

注：根据课件内容简单整理，为了方便大家理解，内容较多;如果仅仅为了考试，可以根据自己的需要进行内容的删减。Lecture 1. Introduction1. What is Molecular Biology?Molecular biology seeks to explain the relationships between the structure and function of biological molecules and how these relationships contribute to the operation and control of biochemical processes. Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA replication, recombination and translocation.分子生物学的研究内容Major content of molecular biology Structure and Function of nucleic acid conformation and function of DNA conformation and function of RNA mRNA tRNArRNA ribozyme antisence RNA microRNA RNA interfrence人们开发出：RNAi、RNAa、ncRNA、SiRNA、microRNA、Antisene RNA、SatellileRNA、TelomereRNA、lincRNA、InCRNA、PiRNA、qiRNA、endoSiRNA等等，其他还有RNA结合蛋白(RNPs)、RNA酶等成百上千种RNA相关的新成员，组成了一个庞大的RNA新世界 这些RNA不仅在基因-蛋白质的合成中发挥重要作用，它更调节和管理着基因的转录、表达、表型等几乎所有的功能。在细胞增殖、分化、生长、凋亡、生殖、发育、遗传、损伤、修复、炎症、感染、防治等一切生命活动中发挥着重要作用； RNA还是生命起源的“先驱，近年来研究证明，RNA比DNA更古老，它是地球上最早出现的生命形式；它可以携带遗传信息，能自我复制，自我进化，自我编译，又具有催化分子功能-,以后才有了DNA和蛋白质，才有了今天的生物世界。 RNA更是人类生命健康的维护者，它不仅调节和管理着人类的一切生命活动，而且它还是防治许多重大的疾病和开发新药物的靶分子和预警分子，并可直接和间接的发挥防治疾病的作用。Functional Genomics As the Human Genome Project has mostly determined the genetic sequence, the next step is functional genomics, which will reveal each genes functions and controls Human Genome Diversity Project Environmental Genome Project Pharmacogenomics Comparative GenomicsArtificial life人工生命是通过人工模拟生命系统,来研究生命的领域。人工生命的概念，包括两个方面内容1.属于计算机科学领域的虚拟生命系统，涉及计算机软件工程与人工智能技术，以及2.基因工程技术人工改造生物的工程生物系统，涉及合成生物学技术。 分子生物学与医学人体发育调控和人体功能调控的分子生物学基础发育、分化与衰老的分子生物学基础细胞增殖调控的分子生物学基础神经、内分泌和免疫调控的分子生物学基础 基因与疾病疾病的分子机理 致病基因的克隆 复杂疾病的分子基础基因诊断基因治疗Lecture 2 structure and function of gene第一节 基因的概念及其发展一 基因（gene）（一）基因的概念的产生和发展2、Morgan 基因的物质载体是染色体3、G.Beadle & R.Tatum 基因是决定蛋白质一级结构的遗传物质单位 5、O. Avery 基因的化学本质是DNA6、Jacob & Monod 基因是在特定的遗传调控系统的调节下和控制下表达其功能的遗传物质单位7、现代的基因概念 基因是核酸分子中储存遗传信息的遗传单位，是指储存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息所必需的全部核苷酸序列二、基因组（genomic） The genome is the entirety of an organisms hereditary information. It is encoded either in DNA or, for many types of virus, in RNA. The genome includes both the genes and the non-coding sequences of the DNA 细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。 人类基因组包含24条染色体以及线粒体上的全部的遗传物质。第二节 真核生物基因组一、基因分类1、结构基因（strutual gene） 可被转录形成mRNA并进而翻译位多肽链，构成各种结构蛋白的基因2、调节基因（regulatory gene） 可调节、控制结构基因表达的基因。其突变可能会影响一个或多个结构基因的功能，导致一个（或多个）蛋白质的改变。3、rRNA基因和tRNA基因二、基因的结构 enhancer pr omoter e xon 5UTR, 3UTR intron（一）编码区1 、外显子（exon） 2、内含子（intron）GTAG规则： 内含子多是以GT开始，并以AG结尾一个基因的内含子可以是另一个基因的外显子。外显子的数量是描述基因结构特征的重要指标。三 、调控元件（acting elements）（二）前导区： 位于编码区的上游，相当于mRNA5端的非编码区（三）调节区： 包括启动子、增强子等基因编码区的两侧，也称侧翼序列顺式调控元件（cis-acting elements） ：与结构基因表达调控相关。能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。反式调控元件（trans-acting elements）:一些可以通过结合顺式元件而调节基因转录活性的蛋白因子。（一）启动子（promoter） 启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。在基因表达的调控中，转录的起始是个关键。常常某个基因是否应当表达决定于在特定的启动子起始过程。2 启动子的类型(1)一类是RNA聚合酶可以直接识别的启动子 这类启动子应当总是能被转录。 但实际上也不都如此，外来蛋白质可对其有影响，即该蛋白质可直接阻断启动子，也可间接作用于邻近的DNA结构，使聚合酶不能和启动子结合 (2)另一类启动子在和聚合酶结合时需要有蛋白质辅助因子的存在。这种蛋白质因子能够识别与该启动子顺序相邻或甚至重叠的DNA顺序。3 启动子的共同顺序 真核生物基因启动子 位于RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下,-35区“AATGTGTGGAAT”， -10区“TTGACATATATT”。-10序列又称为Pribnow盒(原核生物)。是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序真核生物基因启动子TATA box （Goldberg-Hogness box）： 位于-35bp处，序列为TATA（A/T）A（T/A）是RNA聚合酶的结合部位 CAAT盒：在转录起始位点上游70-80bp处 保守的共同顺序：GCCTCAATCT。RNA聚合酶可以识别这一顺序。启动子中的10和-35序列是RNA聚合酶所结合和作用必需的顺序 1RNA聚合酶能和-35和-10序列中的碱基和DNA主 链中的磷酸基相接触;2离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱;3最重要的是，破坏启动子功能的突变中有75%都是改变了共同顺序中的碱基，其余25%亦为离共同顺序较近的。-35和-10序列相距约20bp，即大致是双螺旋绕两圈的长度。因为这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，可见此酶是结合在双螺旋的一面。可以想像，它能感觉到每个结合区的沟底中碱基所产生的特异形状。（三）增强子（enhancer )位于结构基因附近，能够增强该基因转录活性的一段DNA顺序称为增强子(enhancer)。 增强子是另一类顺式作用的DNA片段，可使基因转录的速率大大提高。增强子的类型组织和细胞专一性增强子许多增强子的增强效应有很高的组织细胞专一性，只有在特定的转录因子(蛋白质)参与下，才能发挥其功能。诱导性增强子这种增强子的活性通常要有特定的启动子参与。例如，金属硫蛋白基因可以在多种组织细胞中转录，又可受类固醇激素、锌、镉和生长因子等的诱导而提高转录水平。 增强子的特点 增强子可提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用，通常距离l4kb，个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。增强子作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒置就不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同的。增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现其活性。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。增强子必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。 例如，人类胰岛素基因5端上游约250个核苷酸处有一组织特异性增强子。在胰岛素p细胞中有一种特异性蛋白因子，可以作用于这个区域，以增强胰岛素基因的转录。在其他组织细胞中没有这种蛋白因子，所以也就没有此作用。 大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列，即(G)TGGATATAT(G)，是产生增强效应时所必需的。 许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。 增强子的作用机理增强子中有Z-DNA结构，这种结构的双链间距离大于B-DNA，与蛋白质的亲和力更高一些，有利于转录。增强子中有DNA水解酶容易切断的部位，可与一些转录因子蛋白形成复合物，促进转录。增强子可与核基质结合形成结构体，促进转录。3沉默子（Silencer ）Silencers are control regions of DNA that, like enhancers, may be located thousands of base pairs away from the gene they control. However, when transcription factors bind to them, expression of the gene they control is repressed. 沉默子的特点(1) 可以在远距离作用于启动子(2) 对基因的阻遏作用没有方向的限制，即无论其位于启动子的上游或下游均可阻遏启动子的表达沉默子的作用机理沉默子介导产生的沉默是一种状态的变化,在此过程中,产生类似于异染色质的结构阻止转录因子与DNA的相互作用,使转录被抑制,沉默子作为异染色质形成中的失活中心参与沉默状态的建立和扩散沉默子含阻遏蛋白结合序列，阻遏蛋白与其结合后阻遏基因的转录。直接阻遏(directrepression) 沉默子结合蛋白与转录复合物中的成员结合后将其固定，使基础转录复合物无法形成而丧失活性 竞争(competition) 在一些基因中沉默子与增强子等正调控元件相邻或相重叠，阻遏蛋白结合后阻止激活蛋白与邻近正调控元件的结合从而阻遏转录淬灭 沉默子与增强子相邻，阻遏蛋白与沉默子结合后,虽不影响激活蛋白与DNA的结合能力,却通过蛋白之间的相互作用阻止激活蛋白与转录复合物的正确接触来抑制其活性某些沉默子中含有骨架结合位点保守序列 沉默子与蛋白结合,通过蛋白之间的相互作用形成DNA环后与启动子作用，破坏起始复合物而抑制转录;或者产生的DNA环发生了组蛋白的修饰和拓扑结构的变化,这种变化使关键的转录因子不能正确结合从而阻止转录也可能沉默子和核基质相互作用将转录单元固定于缺乏转录因子的亚显微结构4.绝缘子(insulator)绝缘子(insulator)长约几百个核苷酸对，是通常位于启动子同正调控元件(增强子)或负调控因子(为异染色质)之间的一种调控序列。绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。 绝缘子的功能有序地装置庞大的染色体DNA以及确保其中上万种基因每一种都能在时空上正确无误地表达。 绝缘子在这里起着关键的阻断作用,保护启动子的功能不受其它异常增强子或其它激发信号的有害影响防止基因免受邻近沉默信号的作用。这类沉默信号系来自细胞核的内环境中遍布的大量致密染色质的“扩张”或“溢出” 。绝缘子的这种功能可以维持染色质区域的分界以及保护基因座位的独立性。绝缘子的作用原理结构域边界模型(Domain boundary model,)绝缘子能使它所限定的染色质区域发生折叠成环,促使该区域内各种调节元件彼此相互作用,同时也阻止了不同区域调节元件之间互相影响。染色质形成环状结构域能对抗附近致密染色质结构的扩展。这样一来,绝缘子能防止位置效应也能得到合理的解释。“跟踪”模型(“Tracking” model):结合在增强子元件上的转录因子沿DNA链向它的目标启动子追逐。此时绝缘子的特异结合蛋白在中途阻挡转录因子,使其不能抵达启动子区域。转录诱捕模型(Transcription decoy model)在绝缘子与其特异结合蛋白结合所形成的复合物可成为捕捉增强子的笼子,将增强子复合物吸引到其中而使之失去功能。四、基因家族（gene family）（一）基因家族的概念1、基因家族：核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因。由同一祖先基因进化而来。2、假基因（pseudogene） 在多基因家族中，某些成员并不能表达出有功能的产物，这些基因称为假基因。 假基因与有功能的基因同源，原来可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或点突变等，使这一基因失去活性，成为无功能基因。 与相应的正常基因相比，假基因往往缺少正常基因的内含子，两侧有顺向重复序列。 人们推测，假基因的来源之一，可能是基因经过转录后生成的RNA前体通过剪接失去内含子形成mRNA，如果mRNA经反转录产cDNA，再整合到染色体DNA中去，便有可能成为假基因，因此该假基因是没有内含子的，在这个过程中，可能同时会发生缺失，倒位或点突变等变化，从而使假基因不能表达。（二）、基因家族大致可分为两类 1、一类是基因家族成簇地分布在某一条染色体上，它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质，如组蛋白基因家族就成簇地集中在第7号染色体长臂3区2带到3区6带区域内；2、另一类是一个基因家族的不同成员成簇地分布 在不同的染色体上，这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质，如珠蛋白基因家族五、重复序列：高度重复序列 中度重复顺序 单拷贝顺序 （一）高度重复序列 高度重复序列在基因组中重复频率高，可达百万(106)以上，因此复性速度很快。 在基因组中所占比例随种属而异，约占10-60，在人基因组中约占20。高度重复顺序又按其结构特点分为三种。1、倒位（反向）重复序列（inverted repeats） 反向重复序列由两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成。约占人基因组的5。2、卫星DNA 卫星DNA(satelliteDNA)是另一类高度重复序列，这类重复顺序的重复单位一般由2-10bp组成，成串排列。由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因而称为卫星DNA或随体DNA。在人细胞组中卫星DNA约占5-6。大卫星DNA（macrosatellite DNA）小卫星DNA（minisatellite DNA）微卫星DNA（microsatellite DNA）3、较复杂的重复单位组成的重复顺序 这种重复顺序为灵长类所独有。用限制性内切酶Hind消化非洲绿猴DNA，可以得到重复单位为172bp的高度重复顺序，这种顺序大部份由交替变化的嘌呤和嘧啶组成。有人把这类称为卫星DNA。而人的卫星DNA更为复杂，含有多顺序家族。4、高度重复顺序的功能参与复制水平的调节反向序列常存在于DNA复制起点区的附近。另外，许多反向重复序列是一些蛋白质（包括酶）和DNA的结合位点。参与基因表达调控DNA的重复顺序可以转录到核内不均一RNA分子中，而有些反向重复顺序可以形成发夹结构，这对稳定RNA分子，免遭分解有重要作用参与转位作用几乎所有转位因子的末端都包括反向重复顺序，长度由几个bp到1400bp。由于这种顺序可以形成回文结构，因此在转位作用中即能连接非同源的基因，又可以被参与转位的特异酶所识别。与进化有关 不同种属的高度重复顺序的核苷酸序列不同，具有种属特异性，但相近种属又有相似性。如人的卫星DNA长度仅差1个碱基（前者为171bp，后者为172bp），而且碱基序列有65是相同的，这表明它们来自共同的祖先。在进化中某些特殊区段保守的，而其他区域的碱基序列则累积着变化。 同一种属中不同个体的高度重复顺序的重复次数不一样，这可以作为每一个体的特征，即DNA指纹。（二）中度重复顺序中度重复序列大致指在真核基因组中重复数十至数万（105）次的重复顺序。其复性速度快于单拷贝顺序，但慢于高度重复顺序。少数在基因组中成串排列在一个区域，大多数与单拷贝基因间隔排列。依据重复顺序的长度，中度重复顺序可分为两种类型。（1）短分散片段（short interspersed repeated segments, SINES）这类重复顺序的平均长度约为300bp（500bp），它们与平均长度约为1000bp的单拷贝顺序间隔排列。拷贝数可达10万左右。如Alu家族，Hinf家族等属于这种类型的中度重复序列（2）长分散片段（Long interspersed repeated segments, LINES）这类重复顺序的长度大于1000bp，平均长度为3500-5000bp，它们与平均长度为13000bp（个别长几万bp）的单拷贝顺序间隔排列。也有的实验显示人基因组中所有LINES之间的平均距离为2.2kb,拷贝数一般在1万左右，如Kpn家族等。中度重复顺序在基因组中所占比例在不同种属之间差异很大，一般约占10-40，在人约为12。这些顺序大多不编码蛋白质。这些非编码的中度重复顺序的功能可能类似于高度重复顺序。在结构基因之间，基因簇中，以及内含子内都可以见到这些短的和长的中度重复顺序。如HLA基因，rRNA基因，tRNA基因,组蛋白基因,免疫球蛋白基因等。中度重复顺序一般具有种属特异性；在适当的情况下，可以应用它们作为探针区分不同种哺乳动物细胞的DNA。下面介绍几种典型的中度重复顺序。Alu家族是哺乳动物包括人基因组中含量最丰富的一种中度重复顺序家族，在单倍体人基因组中重复达30万-50万次，约占人基因组的3-6。Alu家族每个成员的长度约300bp，由于每个单位长度中有一个限制性内切酶Alu的切点（AGCT）从而将其切成长130和170bp的两段，因而定名为Alu序列（或Alu家族）。Alu序列分散在整个人体或其他哺乳动物基因组中，在间隔DNA，内含子中都发现有Alu序列，平均每5kbDNA就有一个Alu顺序。Kpn家族是中度重复顺序中仅次于Alu家族的第二大家族。用限制性内切酶Kpn消化人类及其它灵长类动物的DNA，在电泳谱上可以看到4个不同长度的片段，分别为1.2,1.5,1.8和1.9kb，这就是所谓的Kpn家族。Kpn家族成员顺序比Alu家族更长（如人Kpn顺序长6.4kb），而且更加不均一，呈散在分布，属于中度重复顺序的长分散片段型。尽管不同长度类型的Kpn家族（称为亚类，subfamily）之间同源性比较小，不能互相杂交，但它们的3端有广泛的同源性。Kpn家族的拷贝数约为30004800个，占人体基因组的1,与散在分布的Alu家族相似，Kpn家族中至少有一部份也是通过Kpn顺序的RNA转录产物的cDNA拷贝的重新插入到人基因组DNA中而产生的。Hinf家族：这一家族以319bp长度的串联重复存在于人体基因组中。用限制性内切酶Hinf消化人体DNA，可以分离到这一片段。Hinf家族在单位基因组内约有50 100个拷贝，分散在不同的区域。319bp单位可以再分成两个亚单位，分别为172bp和147bp,它们之间有70%的同源性。rRNA基因：在原核生物如大肠杆菌基因组中，rRNA基因一共是七套；在真核生物中rRNA基因的重复次数更多。在真核生物基因组中18S和28S,rRNA基因是在同一转录单位中，低等的真核生物如酵母中，5SrRNA也和18S,28SrRNA在同一转录单位中；而在高等生物中，5SrRNA是单独转录的，而且其在基因组中的重复次数高于18S和28S基因。和一般的中度重复顺序不一样，各重复单位中的rRNA基因都是相同的。rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因组中，这样的区域称为rDNA，如染色体的核仁组织区（nucleolus organizer region）即为rDNA区。（三）单拷贝顺序单拷贝顺序在单倍体基因组中只出现一次或数次，因而复性速度很慢。单拷贝顺序在基因组中占50-80，如人基因组中，大约有60-65的顺序属于这一类。单拷贝顺序中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质。六、真核生物基因组的特点1.真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的（即双倍体,diploid），即有两份同源的基因组。2.真核细胞基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。3.存在重复序列，重复次数可达百万次以上。4.基因组中不编码的区域多于编码区域。5.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的。6.基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小重叠基因有以下几种情况（1）一个基因完全在另一个基因里面。如基因和是两个不同基因，而包含在基因内。同样，基因在基因内。（2）部分重叠。（3）两个基因只有一个碱基重叠。八、原核生物基因组的结构和功能（1）基因组通常仅由一条环状双链DNA 分子组成。（2）具有操纵子结构，即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（regulatorygene）即调节子（regulon）所调控。（3）在大多数情况下，结构基因在细菌基因组中都是单拷贝，但是编码rRNA的基因rDNA往往是多拷贝的,这样可能有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。（4）和病毒的基因组相似，不编码的DNA部份所占比例比真核细胞基因组少得多。（5）具有编码同工酶的同基因（isogene）例如，在大肠杆菌基因组中有两个编码分支酸（chorismicacid）变位酶的基因，两个编码乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。（6）和病毒基因组不同的是，在细菌基因组中编码顺序一般不会重叠，即不会出现基因重叠现象。 （7）在DNA分子中具有各种功能的识别区域如复制起始区OriC，复制终止区TerC,转录启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺序。（8）在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA聚合酶从DNA链上脱落。例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区，这就是转录终止子的结构。终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。而弱终止子尽管也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有终止蛋白参与才能使转录终止。Lecture 3 DNA replication第一节 DNA的复制一、DNA复制的基本特点（一）复制的起始点和方向复制起始点：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(origin of replication)常用ori或o表示复制子： replicon DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元复制叉：在复制开始时，复制起始点出呈现一叉形结构，称为复制叉（replication fork ）1、复制起始点： DNA复制起始点有结构上的特殊性。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。大肠杆菌染色体DNA复制起始点Oric由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)，其中有9个核苷酸或13个核苷酸组成的保守序列，这些部位是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置2、DNA复制的方向(1)定点开始双向复制：这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式，从一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条链，形成一个复制泡。(2)定点开始单向复制：质粒colE1是个典型的例子，复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制(3)两点开始单向复制：腺病毒DNA的复制是从两个起点开始的，形成两个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。二、复制的基本方式 (一)DNA的半保留复制(semiconservative replication)（二）半不连续复制前导链(leading strand)：在以35方向的母链为模板时，复制合成出一条53方向的前导链，前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的，因此前导链的合成是连续进行的随从链(lagging strand)：另一条母链DNA是53方向，它作为模板时，复制合成许多条53方向的短链，叫做随从链，随从链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的。随从链只能先以片段的形式合成，这些片段就叫做岗崎片段(Okazaki fragments)，原核生物岗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般10000核苷酸。最后再将多个岗崎片段连接成一条完整的链。由于前导链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制三、复制过程（一）DNA复制的起始阶段1、DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质解链酶(helicase)：解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。 大肠杆菌中DnaB蛋白就有解链酶活性，与随从链的模板DNA结合，沿53方向移动，还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿35方向移动。.单链结合蛋白：(single strand binding proteins, SSBP) 它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用。 引发体的形成DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由Dna B. Dna C和单链结合蛋白组成。引物酶(primase) 它是一种特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在DNA复制起始处做为引物。RNA引物的3OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置引发体(primosome) 高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3OH末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。（二）DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子1、DNA的聚合反应和DNA聚合酶DNA聚合酶（DNA polymerse ）： DNA pol是由一条多肽链组成，分子量为109KD。酶分子中含有一个Zn+，是聚合活性必须的。 (1)DNA聚合酶的53聚合活性这是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸顺序，将互补的dNTP逐个加到引物RNA3-OH末端，并促进3-OH与dNTP的5-OH形成磷酸二酯键，酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用。 (2)DNA聚合酶的35外切核酸酶活性 这种酶活性的主要功能是从35方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸，这种功能称为校对功能，这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的。 (3)DNA聚合酶的53外切核酸酶活性 这种酶活性是从DNA链的5端向3末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除10个核苷酸。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用，对完成的DNA片段去除5端的RNA引物也是必须的。DNA pol并不是DNA复制过程中的主要酶，它的作用主要与DNA损伤后的修复有关。DNA聚合酶(DNA pol）分子量为120KD，每个细胞约有100个酶分子，但活性只有DNA pol的5%，它具有53聚合活性和35外切活性，而没有53外切活性，它的作用可能与DNA损伤修复有关。DNA聚合酶(DNA pol）这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶，它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体 DNA聚合酶全酶并不是单独起作用的，而是与引发体，解链酶等构成一个复制体。由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。DNA pol是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制2、与超螺旋松驰有关的酶拓扑异构酶(topoisomerase) 是一类改变DNA拓扑性质的酶。在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应，而在生物体内它们可能参与了DNA的复制与转录。在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。DNA复制完成后，拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋，使DNA缠绕、折叠，压缩以形成染色质。DNA拓扑异构酶有型和型，它们广泛存在于原核生物及真核生物中。拓扑异构酶(Topo)的主要作用将环状双链DNA的一条链切开一个口，切口处链的末端绕螺旋轴按照松驰超螺旋的方向转动，然后再将切口封起来。这就使DNA复制叉移动时所引起的前方DNA正超螺旋得到缓解，利于DNA复制叉继续向前打开。对环状单链DNA还有打结或解结作用，对环状双链DNA的环连或解连以及使环状单链DNA形成环状双链DNA都有作用拓扑异构酶(Topo)的主要作用是在大肠杆菌中发现的，曾被称为旋转酶(gyrase)，它们作用特点是切开环状双链DNA的两条链，分子中的部分经切口穿过而旋转，然后封闭切口。还可使DNA分子从超螺旋状态转变为松驰状态，此反应不需要ATP参与。DNA复制完成后，Topo在ATP参与下，DNA分子从松驰状态转变为负超螺旋。催化的拓扑异构化反应还有环连或解环连，以及打结或解结。DNA连接酶(DNA ligase) 作用：消耗ATP，将随从链中相邻的两个DNA片段连接起来催化同一模板DNA链上的两个相邻DNA片段的3端与5端间形成磷酸二酯键，把相邻的两段DNA连成完整的链（三）DNA复制的终止阶段DNA在复制过程中，合成出的前导链为一条连续的长链。随从链则是由合成出许多相邻的片段，在连接酶的催化下，连接成为一条长链。连接作用是在连接酶催化下进行的。DNA复制的过程延长:DNA-pol ( DDDP- )的5 3的聚合活性使核苷酸之间生成3，5磷酸二酯键模板 以DNA单链为模板底物 dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物 以小片段RNA为引物，在 RNA引物的 3 -OH末端上开始逐个添加dNTP 按碱基配对原则 （A = T G C）按5 3 方向 第二节 真核生物DNA复制的特点1.复制起始点及方向与原核生物不同，真核生物DNA复制有许多起始点，例如酵母S. cerevisiae的17号染色体约有400个起始点，因此，虽然真核生物DNA复制的速度(60核苷酸/每秒钟)比原核生物DNA复制的速