蜡样芽孢杆菌高密度发酵条件与过程的优化.pdf

46JOURNALOFFOODSCIENCEANDBIOTECHOGYVol.42Issue82023研究论文蜡样芽孢杆菌高密度发酵条件与过程的优化胥聆铭12，朱莉3，詹晓北*1,2高泽鑫12，尹忠伟12（1.江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡2 1412 2：2.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122；3.无锡格莱克斯生物科技有限公司，江苏无锡2 1412 5）摘要：蜡样芽孢杆菌的生物量对其生物功能具有重要影响。为了提高蜡样芽孢杆菌的产量与芽孢率，通过单因素实验筛选出最适宜其生长的碳源与氮源，分别为质量比1:1复配的葡萄糖与水溶性淀粉和质量比1:1复配的大豆蛋白陈与酵母提取物。在此基础上，于7 L发酵罐中探究流加方式、pH、搅拌转速和通气量等因素对其生物量及芽孢率的影响。最优发酵条件为：在0 9 h之间，转速2 5 0 r/min，通气量3L/min，p H 恒定6.5;9 18 h时，转速升高至35 0 r/min，通气量升高至4.5 L/min，并以0.45 mL/min流量补加培养基浓缩液；18 h时，转速降低至15 0 r/min，通气量降低至2.2 5 L/min，p H 调高至7.5,停止补料至发酵结束。基于以上发酵策略，在18 h时，蜡样芽孢杆菌活菌数达2.2 x1010CFU/mL，是未优化前的4.8 8 倍；发酵结束时，芽孢率超过9 0%。本研究结果为蜡样芽孢杆菌的工业化应用提供了一定基础。关键词：蜡样芽孢杆菌：发酵策略：发酵优化：高密度发酵中图分类号：Q8155文章编号：16 7 3-16 8 9（2 0 2 3)0 8-0 0 46-0 88DOl:10.3969/j.issn.1673-1689.2023.08.006Optimization of High Cell Density Fermentation Conditionsand Process of Bacillus cereusXULingming2,ZHULi,ZHANXiaobeil-2,GAO Zexin2,YIN Zhongweil2(1.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.Wuxi GlycoBiotechnologyCo.,Ltd.,Wuxi214125,China)Abstract:The biomass of Bacillus cereus has an important effect on its biological function.Inorder to increase the yield and spore rate of Bacillus cereus,the optimum carbon and nitrogen sourcewere screened by single factor experiment.The optimal carbon source was 1:1(mass ratio)mixedglucose and water-soluble starch,and the optimal nitrogen source was 1:l(mass ratio)mixed soybeanpeptone and yeast extract.The effects of feeding method,pH,stirring speed and ventilatory capacityon the biomass and spore rate were studied in a 7 L bioreactor.The optimal fermentation conditionswere as follows:in 0-9 h,the stirring speed,aeration ratio and pH were 250 r/min,3 L/min and 6.5,respectively;in 9-18 h,the stirring speed and ventilatory capacity were 350 r/min and 4.5 L/min,respectively and the concentrated medium was added at a flow rate of 0.45 mL/min;at 18 h,the收稿日期：2 0 2 1-0 7-19基金项目：国家 十三五 重点研发计划项目（2 0 17 YFD0400302）*通信作者：詹晓北（19 6 2 一），男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事生物反应器关键技术研究。E-mail：x b z h a n y a h o o.c o m47会品5 生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第8 期背聆铭，等蜡样芽孢杆菌高密度发酵条件与过程的优化研究论文stirring speed,ventilatory capacity and pH were changed to 150 r/min,2.25 L/min and 7.5respectively,and the feeding was stopped till the end of fermentation.Based on the abovefermentation strategies,the number of viable Bacillus cereus reached 2.2 x101o CFU/mL at 18 h,which was 4.88 times of that before the optimization.At the end of fermentation,the spore rate wasover 90%.This study provided basis for the industrial applications of Bacillus cereus.Keywords:Bacillus cereus,fermentation strategy,fermentation optimization,high cell densityfermentation蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）是一种常见的革兰氏阳性菌，能够产生芽孢，具有较强的抗逆性。其在自然界中广泛分布于水、土壤、空气中，且与大多数动植物具有密切的共生关系2。近年来，生物防治在农业与环境保护方面都成了研究热点，越来越多的人利用微生物处理动植物疾病与环境问题3。蜡样芽孢杆菌凭借其优异性质吸引了许多研究者的兴趣，李生樟等利用蜡样芽孢杆菌拮抗水稻条斑病，表明蜡样芽孢杆菌能够抑制水稻条斑病菌的生长，限制条斑病症状的扩展14。此外，蜡样芽孢杆菌在代谢物合成5-7 、益生菌剂制备18-9 废水处理0、土壤修复叫等方面都有良好的表现。于平等利用蜡样芽孢杆菌高密度发酵生产新型中性蛋白酶，获得了酶活力为7 0 2.2 1U/mL的中性蛋白酶12。综上所述，蜡样芽孢杆菌是一种很有前景的微生物菌株，可以广泛应用于农业、食品、医药等领域。目前关于提高蜡样芽孢杆菌产量的报道相对较少113，已有报道的蜡样芽孢杆菌产量最高只有1.21010CFU/mL4，不足以满足工业化生产的需求通常认为发酵条件优化是影响生物过程中细菌生长与芽孢形成的关键因素15。因此可以对蜡样芽孢杆菌的发酵条件与过程进行优化，以提高其产量，满足工业化需求高密度发酵(HighCell-DensityCulture,HCDC)又称高密度培养，是一种相较于常规培养够显著提高产物产量的培养技术16 ，对降低生产成本与工业化扩大生产具有重要意义。刘开放等利用高密度发酵技术对布拉酵母培养工艺进行优化，摇瓶阶段酵母产量达8.2 1g/L，比优化前提高1.39 倍，于5 0 L发酵罐进行扩大培养，酵母产量达到5 1.2 1g/L7。因此利用高密度发酵技术培养蜡样芽孢杆菌来促进其工业化生产切实可行。此外，蜡样芽孢杆菌的芽孢具有多种优良特性，在利用高密度发酵技术提高蜡样芽孢杆菌产量的同时，也需提高其芽孢率，以最大化利用蜡样芽孢杆菌作者以BacilluscereusATCC14579为实验菌株，通过单因素实验对蜡样芽孢杆菌培养基成分进行优化，获得最适宜蜡样芽孢杆菌生长的碳源与氮源。在此基础上，于7 L发酵罐进行深层扩大培养，探究最佳发酵调控策略，以期提高蜡样芽孢杆菌产量与芽孢率，为其工业化生产和应用提供参考依据材料与方法1.1实验菌株蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus）：编号ATCC14579，来源于作者所在实验室保藏的菌种1.2主要仪器与设备尼康TI-S-EJOY型倒置显微镜：日本Nikon公司产品；英诺聚EnologyY15型全自动葡萄酒分析仪：西班牙Biosystems公司产品；EppendorfNewBrunswickBioFlo/CelliGen115型全自动发酵罐：美国Eppendorf公司产品1.3培养基LB培养基（组分g/L)：胰蛋白陈10,酵母提取物5，氯化钠10;pH7.0NA固体培养基（组分g/L）：胰蛋白陈10，牛肉浸粉3，氯化钠5，琼脂2 0;pH7.3。种子培养基（组分g/L）：胰蛋白陈10，酵母提取物5,氯化钠10,葡萄糖10;pH7.0。1.4主要试剂酵母粉：购自Oxoid公司；其他试剂：均为国产分析纯，购自国药化学试剂有限公司1.5单因素实验1）蜡样芽孢杆菌活化培养将实验室保存的蜡样芽孢杆菌转接到NA固体培养基中，于30 的恒温培养箱中培养2 4h，传代2 次后置于4保存。2）种子液制备用接种环挑取1环活化2 次48JOURNALOFOODSCIENCEANDBIOTYVol.42lssue82023ConditionsandProcessof BacilluscereusXULingming,etal：Optimizationof HighCellDensityFermentationARCH后的菌苔，接人种子培养基，于30、2 0 0 r/min条件下培养14 16 h，获得种子液3)250mL摇瓶中营养物质筛选在LB培养基基础上，通过单因素实验，探究不同碳源、氮源对蜡样芽孢杆菌生长情况的影响，通过测定各因素下发酵液OD6oo与活菌数来判断菌体生长情况，采用双染色法监控芽孢形成情况1.6深层高密度发酵扩大培养根据摇瓶阶段优化的培养基配方与发酵条件，在7 L发酵罐上进行扩大培养，初始装液量为3L，将蜡样芽孢杆菌种子液按体积分数10%接种至发酵培养基。初始培养基(组分g/L)：葡萄糖12.5,水溶性淀粉12.5，大豆蛋白陈10，酵母提取物10，MgSO4.7H03（NH 4),SO 43,M n Cl 2 0.2；初始通气量为3L/min，搅拌转速为2 5 0 r/min，温度30，初始pH恒定为6.5，在发酵过程中流加碳源和氮源，改变转速与通气量，自动流加2 mol/LNaOH与1mol/L磷酸调控pH。发酵过程中以泡敌消泡，每隔3h取一次样，测定OD60、p H、活菌数与芽孢数。1.6.1补料分批发酵1)间歇流加碳源当培养基中残糖质量浓度低于5 g/L时开始流加碳源，流加液为7 5 mL200g/L葡萄糖与2 0 0 g/L水溶性淀粉混合液，每隔3h测定一次残糖质量浓度2）间歇流加碳氮源当培养基中残糖质量浓度低于5 g/L时开始流加碳源与氮源，流加液中碳源为7 5 mL200g/L葡萄糖与2 0 0 g/L水溶性淀粉混合溶液，氮源为7 5 mL100g/L酵母提取物与10 0g/L大豆蛋白陈混合溶液，每隔3h测定1次残糖与残留伯胺氮质量浓度3）恒速流加碳氮源当培养基中残糖质量浓度低于5 g/L时开始流加碳源与氮源，流加液中碳源为2 0 0 g/L葡萄糖与2 0 0 g/L水溶性淀粉混合液，氮源为10 0 g/L酵母提取物与10 0 g/L大豆蛋白陈混合液。碳源与氮源流加速率为0.45 mL/min。1.6.2分段pH调控0 18 h时恒定pH为6.5,18h时将pH调至7.5，直至整个发酵过程结束1.6.3分段搅拌转速与通气量调控0 9 h保持搅拌转速为2 5 0 r/min，通气量为3L/min;918h调高搅拌转速与通气量至35 0 r/min与4.5 L/min，18 h时将搅拌转速与通气量调至15 0 r/min与2.2 5 L/min，直至发酵结束1.7检测方法1.7.1菌体质量浓度测定发酵液的菌体质量浓度采用比浊法（OD600）测定1.7.2pH测定取一定量发酵液，10 0 0 0 r/min离心5 min，取上清液于pH计上测定pH。1.7.3活菌与芽孢计数参见GB4789.142014118,芽孢率Y通过芽孢数A和活菌数B计算，公式如下：AY100%B1.7.4芽孢形成过程监控取样后涂片，干燥固定，滴加孔雀绿染液盖满菌膜，置于酒精灯上加热5min，倾去染液，待玻片冷却至室温后，用细水流冲洗玻片，再用番红复染1 2 min后，倾去染液，干燥后，显微镜镜检。1.7.5残糖质量浓度采用葱铜-硫酸比色法测定发酵液中残糖质量浓度9 1.7.65伯胺氮质量浓度取一定量发酵液，10 0 0 0r/min离心5 min，取上清液，使用英诺聚EnologyY15型全自动葡萄酒分析仪测定发酵液中伯胺氮质量浓度。1.8数据处理以上每个实验重复3次。采用SPSS25.0软件对实验数据进行统计分析Origin2021制图。2结果与分析2.1碳源对蜡样芽孢杆菌生长的影响在LB培养基的基础上,分别以葡萄糖(10 g/L)和相同质量浓度的水溶性淀粉、麦芽糖、玉米糊精、糖蜜和蔗糖为碳源，探究不同碳源对菌体生长的影响，实验结果如图1(a)所示。以10 g/L葡萄糖和10g/L水溶性淀粉为碳源，菌体生长情况最好。分别测定这2 种发酵液中的活菌数、芽孢数、pH与ODeo0的变化情况，实验结果如图1(b）、（c)所示。以葡萄糖为碳源，菌体生长情况最好，以水溶性淀粉为碳源，芽孢最早出现。基于上述结果，选择将葡萄糖与水溶性淀粉进行复配，复配结果如图1（d）所示。当葡萄糖与水溶性淀粉的质量比为1:1时，发酵液ODo最高。且葡萄糖与水溶性淀粉价格低廉，以葡萄糖和水溶性淀粉为碳源，不仅能获得较高产量与芽孢率，还能大大降低生产成本，故以质量比1:1葡萄糖与水溶性淀粉为碳源49会品与生物技术学报2023年第42 卷第8 期骨铭，蜡样芽孢杆菌高密度发酵条件与过程的优化研究论文14r10aOD600pH12b菌体数10芽孢数8(T/01)/开108860096644422200燕糖糖蜜036913172125麦芽糖葡萄糖玉米糊精时间/h可溶性淀粉（a）不同碳源对菌体生长影响（b）葡萄糖发酵曲线2512OD600pH菌体数1020芽孢数68150096410425200036913172125时间/h碳源（c）水溶性淀粉发酵曲线（d）不同配比葡萄糖与水溶性淀粉对菌体生长的影响图1碳源对蜡样芽孢杆菌生长的影响Fig.1Effect of carbon source on the growth of Bacillus cereus2.2氮源对蜡样芽孢杆菌生长的影响氮源对菌体生长具有重要影响，蛋白质是细胞结构的组成成分，也是菌体生长不可或缺的营养物质。分别以酵母提取物（10 g/L)与等质量浓度的胰蛋白陈、大豆蛋白陈、牛肉膏、尿素与氯化铵为氮源，探究不同氮源对菌体生长的影响。实验结果如图2(a），以大豆蛋白陈与酵母提取物为氮源，菌体生长情况最好。代书玲等的报道中发现，复配氮源比单一氮源更有利于菌体生长，因此进一步探究了氮源复配比例对菌体生长的影响。如图2（b）所示，当大豆蛋白陈与酵母提取物的添加质量比为1:1时，发酵液OD6o最高，菌体生长情况最好。酵母提取物来源于微生物，大豆蛋白陈来源于植物，以二者为共同氮源，能提供更丰富的营养物质，有利于菌体的生长。故选择质量比为1:1的酵母提取物与大豆蛋白陈为氮源2.3发酵罐深层扩大培养2.3.1流加策略的影响补料分批发酵是通过间歇或连续补加一定量新鲜培养基，排出废料，使菌体能在生长阶段获得足够的营养物质并减缓菌种老化，可以让菌体保持较高且较稳定的生长速率，从而获得高产物产量2 0-2 2 。目前补加单一营养物质的补料分批发酵策略较常见，邹孟琳等通过连续流加葡萄糖，获得了较高产量丁酸梭菌及芽孢2 3。但补加单一营养物质，可能导致发酵液中部分营养物质过剩，使菌体产生过多代谢副产物，不利于菌体生长发育。刘景阳等通过全营养流加，获得了较高产量的谷氨酸2 4。杨文革等也通过流加多种营养物质，获得了高产量的蜡样芽孢杆菌2 。作者在此基础上稍加修改，探究间歇流加碳源、间歇流加碳氮源与恒速流加碳氮源3种策略对蜡样芽孢杆菌生长及芽孢形成情况的影响。间歇流加碳源结果见图3(a），发酵液中氮源在9 12 h时耗尽，由于缺乏氮源，菌体的生长速率减缓。同时流加碳氮源结果如图3（b）所示，菌体生长速率在整个对数生长阶段未出现明显减缓，表明同时流加碳氮源有利于菌体的快速生长繁殖。如图3（c）所示，恒速流加碳氮源后发酵液中活菌数明显增多，但芽孢率没有显著提50JOURNALO42lssue82023Conditionsand Processof Bacillus cereusXULingming,ettal：OptimizationofHighCellDensityFermentation上ARCH12a20ab1810C16b814009CT12dd6o1048d624f200牛肉膏氯化铵1:00:11:22:11:1胰蛋白陈酵母提取物大豆蛋白陈氮源氮源质量比（a）不同氮源对菌体生长情况的影响（b）不同配比酵母提取物与大豆蛋白陈对菌体生长的影响图2氮源对蜡样芽孢杆菌生长的影响Fig.2HEffect of nitrogen source on the growth of Bacillus cereus活菌数pH活菌数pH残糖芽孢率残糖芽孢率伯胺氮12410010008伯胺氮130一7100800762025(/)80800(T/0 x)/界80656001620(7/）/6005%/本4606012415#40034040034081022200202002045000000036 91215182124273036912151821242730时间/h时间/h(a)间歇流加碳源对菌体生长的影响（b）间歇流加碳氮源对菌体生长的影响10r活菌数pH128一平一100残糖芽孢率800伯胺氮248802026006604001214408200220400036912151821242730时间/h（c）恒速流加碳氮源对菌体生长的影响图3不同流加方式对蜡样芽孢杆菌生长的影响Fig.3Effect of different feeding methods on the growth of Bacillus cereus升，考虑到恒速流加策略更加简单易操作，因而选择以恒速流加方式，同时流加碳氮源作为蜡样芽孢杆菌高密度发酵的流加策略。2.3.2分段pH的影响通过摇瓶阶段的实验发现，pH会影响蜡样芽孢杆菌的生长与芽孢形成产生，弱酸性条件适合菌体生长，弱碱性条件适合芽孢形成,这与Hue等的研究结果2 6 相符合。故在7 L发酵罐扩大培养阶段，将恒速流加碳氮源流加策略与分段pH调控策略相结合，在菌体生长达到稳定期前，使用弱酸性环境（pH6.5)进行培养，促进其生51食品5 生物技术学报2023年第42 卷第8 期骨聆铭，等蜡样芽孢杆菌高密度发酵条件与过程的优化研究论文长，待菌体生长进入稳定期后，将发酵液pH调至弱碱性环境（pH7.5）进行培养，促使其转变为芽孢，实验结果见图4。18 h菌体生长达到稳定期后，将发酵液pH从弱酸性调至弱碱性，与恒定弱酸性条件相比，发酵液中活菌数无较大差异，但分段pH调控后芽孢率得到了较大提升，故恒速流加碳氮源与两段pH调控相结合策略有利于菌体生长及芽孢形成活菌数残糖1000r101307100伯胺氮pH258008芽孢率80206006601540044010200220500003691215183212422730时间/h图4分段pH调控策略结果Fig.4Results of segmented pH control strategy2.3.3分段搅拌转速与通气量调控策略溶氧对蜡样芽孢杆菌的生长具有重要影响2 7-2 8 ，低溶氧条件不利于菌体生长，并会促使其转变为芽孢2 9-30 。发酵罐中的溶氧一般由改变通气量与搅拌转速调控3。故以分段pH与恒速流加碳氮源为基础，在菌体生长进入稳定期（18 h）时，通过降低搅拌转速与通气量考察低溶氧对芽孢率的影响，结果见图5(a）。在菌体生长达到稳定期后，将搅拌转速与通气量从2 5 0 r/min与3L/min降低至15 0 r/min与2.25L/min。因而芽孢率从（5 8.0 0.5）%升至9 0.0%以上，表明此种溶氧调控方式能够显著提高芽孢率。在发酵过程中发现，菌体生长进入对数生长期中期后，发酵液变黏稠，氧气传递速率下降，溶氧快速减少，因而考虑在此时加大搅拌转速与通气量，对发酵液进行充分搅拌，增加发酵液中溶氧，以促进菌体的生长繁殖。结果如图5（b）所示，在9 h时调高搅拌转速与通气量至35 0 r/min与4.5 L/min；18h时，按照图5(a）策略调低搅拌转速与通气量，以此得到三段搅拌转速与通气量调控策略。在此调控策略下，发酵液中活菌数得到了较大提升，最终达到2.2 10 l0CFU/mL2.4芽孢率镜检分析芽孢是细菌的休眠体，一般为内生孢子，在恶劣环境下，细菌形成芽孢，待到条件适宜时，再重新萌发为细菌。在前面的实验中，通过分段pH、分段搅拌转速与通气量调控，发酵结束时发酵液内的蜡样芽孢杆菌芽孢率超过9 0.0%。图6 为实验过程中所观察到的芽孢形成过程图，实验中所使用的染色方法为双染色法，即利用菌体与芽孢对染液的亲和力不同，将菌体染为红色，芽孢染为绿色，以便于观察区分。从图6 中可以看出，到12 h开始有菌体转变为芽孢，到18 h芽孢开始逐渐增多，但此时主要还处于芽孢形成阶段，芽孢作为内生孢子，还未脱离菌体。18 h后进行的一系列调控使发酵液中的芽孢率开始快速上升，到2 4h时芽孢率达到5 0%以上；到30 h时发酵液中芽孢率达9 0.0%以上。以上结果表明本实验所使用的发酵调控策略能有效提升芽孢率一通气比一搅拌转速活菌数芽孢率一通气比一搅拌转速活菌数芽孢率100r1.00115251.6r74001002501.50.95122080751.4300(u/l)/转2000.901.3%/率卡915601.2500.851501.020061040250.801000.9350.8100200.750.75000036912.15182124273003691215182124.27330时间/h时间/h（a）两段溶氧调控策略对菌体生长与芽孢形成的影响（b）三段溶氧调控策略对菌体生长与芽孢形成的影响图5 分段搅拌转速与通气量调控策略Fig.5Control strategy of segmented stirring speed and ventilation ratio52JOURNALOFFOODSCIENCEANDBIOTLOGYVol.42Issue82023ConditionsandProcessof BacilluscereusXULingming,ettal:Optimizationof HighCellDensityFermentationEARCH(a)0 h显微镜图(b)6h显微镜图(c）12 h 显微镜图(d）18 h 显微镜图(e）2 4h 显微镜图(f)30h显微镜图图6 虫蜡样芽孢杆菌芽孢形成过程（x100）Fig.6Bacillus cereus spore formation process(x100)3结语作者通过摇瓶阶段的研究，筛选出最利于蜡样芽孢杆菌生长的碳源为葡萄糖与相同质量浓度的水溶性淀粉，氮源为大豆蛋白陈与相同质量浓度的酵母提取物。通过7 L发酵罐扩大培养，分别探究了流加方式、pH与溶氧对蜡样芽孢杆菌生长情况和芽孢率的影响。结果表明，0 9 h恒定搅拌，转速、通气量与pH分别为2 5 0 r/min、3L/m i n 与6.5;9 h时以0.45 mL/min速率流加碳氮源，并提高搅拌转速至35 0 r/min，通气量为4.5 L/min；18 h 时停止流加碳氮源，调高pH至7.5，搅拌转速与通气量分别降至15 0 r/min与2.2 5 L/min。在此调控策略下，18 h时蜡样芽孢杆菌的活菌数达到2.2 10 10 CFU/mL，是未优化前的4.8 倍，发酵结束时，芽孢率超过90.0%。利用流加碳氮源与分段pH、搅拌转速与通气量调控相结合策略对蜡样芽孢杆菌进行高密度发酵，是本研究的一个创新点，实验结果也表明此调控策略确实有效，与未优化结果相比，蜡样芽孢杆菌生物量与芽孢率均有了较大提高，研究结果为蜡样芽孢杆菌工业化生产提供了新思路。参考文献：1程国富，郑自强，卫春会，等.蜡样芽孢杆菌与酿酒酵母混菌发酵效果探究J.酿酒科技，2 0 2 1,42(3)：5 3-5 9.2李霞.蜡样芽孢杆菌调控番茄根系分泌物对南方根结线虫的作用D.南京：南京师范大学,2 0 19.【3】尹艳楠，谈家金，李梦伟，等.蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株防治松材线虫病研究J.南京林业大学学报（自然科学版），2 0 2 1，45(3):152-158.【4 李生樟，刘昭，杨瑞环，等.一株拮抗水稻条斑病菌的蜡样芽孢杆菌的分离和鉴定J.江苏农业科学，2 0 2 0,48(7)：12 7-136.【5 钟小廷.产细菌素蜡样芽孢杆菌的筛选、鉴定及培养基优化D.成都：西华大学，2 0 14.【6 代书玲，陈国，宗琪.蜡样芽孢杆菌产磷脂酶D发酵条件优化J.中国酿造，2 0 19,38(11)：140-144.【7 李晔.蜡样芽孢杆菌胶原酶的分离纯化及其在毕赤酵母中表达的研究D.天津：天津商业大学,2 0 16.【8 汪梅珍.蜡样芽孢杆菌活菌片联合中医推拿治疗肠绞痛患儿的效果J.医疗装备，2 0 2 1,34(10)：7 1-7 3.【9 葛全兴.微生态制剂在养猪生产中的应用J.现代畜牧科技，2 0 2 1,49(3)：46-47.10 JIA F,YI Z,JIN Q,et al.Bacillus cereus liquid fertilizer was produced from A garicus bisporus industrial wastewaterJJ.Journalof Biotechnology,2021,327(2):74-85.11焦仕林.蜡样芽孢杆菌Cr4-1对六价铬污染土壤的修复及其土壤微生态影响D.武汉：华中科技大学,2 0 16.53品与生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第8 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