NY∕T 537-2023 （代替 NY∕T 537-2002）猪传染性胸膜肺炎诊断技术.pdf

2023?02?17发布2023?06?01实施猪传染性胸膜肺炎诊断技术41中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX11.220CCS B5372023Diagnostic techniques for porcine contagious pleuropneumonia中华人民共和国农业农村部发 布代替 NY/T?5372002学兔兔 标准下载N Y/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.本文件代替NY/T 猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术.与NY/T 相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:a)增加了“缩略语”(见第章);b)增加了“临床诊断”(见第章);c)增加了“P C R检测”(见第章);d)增加了“实时荧光P C R检测方法”(见第章);e)增加了“综合结果判定说明”(见第 章);f)增加了“胸膜肺炎放线杆菌形态图”(见附录B);g)删除了“补体结合试验”(见 年版的第章);h)修改了“酶联免疫吸附试验”(见第 章,年版的第章).请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担专利的责任.本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(S A C/T C )归口.本文件起草单位:中国动物卫生与流行病学中心、河南科技大学、江苏省农业科学院、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心、山东畜牧兽医职业学院、青岛市即墨区畜牧业发展服务中心.本文件主要起草人:魏荣、张慧、周俊明、汪洋、盖文燕、徐天刚、刘丽蓉、孙翔翔、王岩、魏甜甜、董雅琴、刘爽、倪艳秀、吴发兴、何奇松、熊毅.本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:年首次发布为NY/T ;本次为第一次修订.学兔兔 标准下载N Y/T 引言猪传染性胸膜肺炎(p o r c i n ep l e u r o p n e u m o n i a)是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种猪的急性呼吸道传染病.发病猪以急性出血性纤维素性肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜炎为主要特征.急性病例病死率高,慢性病例能耐过,表现出消瘦和生长发育不良.目前,该病在世界上养猪国家广泛存在.胸膜肺炎放线杆菌(A c t i n o b a c i l l u sp l e u r o p n e u m o n i a e,A P P)属于巴氏杆菌科放线杆菌属.根据对辅酶(NA D)的依赖性,分为生物型和生物型;根据荚膜多糖及脂多糖的抗原性差异,目前将本菌分为 个血清型.通常、型为生物型,生物需要依赖NA D,大多数 型和 型属于生物型,生长不依赖NA D.不同血清型甚至同一血清型中不同菌株之间的毒力有差异,一般型、型、型及 型毒力最强,型、型、型、型、型及 型为中等毒力或低毒力.我国A P P主要流行血清型为型、型、型、型、型、型.学兔兔 标准下载N Y/T 猪传染性胸膜肺炎诊断技术范围本文件规定了猪传染性胸膜肺炎临床诊断、样品采集和运送、病原分离与鉴定、P C R检测、实时荧光P C R检测、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验的技术要求和规范.本文件适用于猪传染性胸膜肺炎的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.NY/T 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件.卫星现象S a t e l l i t ep h e n o m e n o n挑取A P P菌落接种于血琼脂表面,用金黄色葡萄球菌点种或垂直划线,在 C O条件下培养 h h.越靠近金黄色葡萄球菌菌落生长的本菌菌落越大,越远的越小甚至不见菌落生长,即所谓“卫星现象”,也称V因子需要试验.溶血 h e m o l y s i s菌落周围形成完全透明的溶血环,红细胞完全溶解,称为溶血.相对的,在菌落周围形成不透明的草绿色溶血环,红细胞未溶解,血红蛋白变成绿色,称为溶血.胸膜肺炎放线杆菌含重复子毒素A c t i n o b a c i l l u sp l e u r o p n e u m o n i a eR T X,A p xA P P可产生种毒素,分别为A p x、A p x、A p x、A p x,均为重要的毒力因子,具有细胞毒性或溶血性,是一种穿孔毒素,属于含重复子毒素(r e p e a t s i nt o x i n,R T X)家族.其中,A p x存在于所有血清型,且只在猪体内产生.缩略语下列缩略语适用于本文件.A P P:胸膜肺炎放线杆菌(A c t i n o b a c i l l u sp l e u r o p n e u m o n i a e)P B S:磷酸盐缓冲液(P h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n eb u f f e r)T S B:胰蛋白大豆肉汤(T r y p t i c a s es o yb r o t h)NA D:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,也称V因子(N i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e)C AMP:协同溶血试验(C h r i s t i s A t k i n s M u n c h p e t e r s o n)A p x:胸膜肺炎放线杆菌含重复子毒素(A c t i n o b a c i l l u sp l e u r o p n e u m o n i a eR T X)P C R:聚合酶链式反应(P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n)D NA:脱氧核糖核酸(D e o x y r i b o n u c l e i ca c i d)d NT P:脱氧核糖核苷三磷酸(D e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e)T E:T r i s E D T A缓冲液(T r i s E D T Ab u f f e r)学兔兔 标准下载N Y/T T A E:T A E缓冲液(T r i s a c e t i c E D T Ab u f f e r)E L I S A:酶联免疫吸附试验(E n z y m e l i n k e d i mm u n es o r b e n t a s s a y)HR P:辣根过氧化物酶(H o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e)TMB:,四甲基联苯胺(,T e t r a m e t h y l b e n z i d i n e)I P T G:异丙基 D 硫代半乳糖苷(I s o p r o p y l b e t a D t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e)临床诊断 流行病学 易感动物对猪具有高度宿主特异性,各年龄猪均易感.传染源带菌猪、病猪及其分泌物是本病的传染源.病菌主要存在于肺脏病变部位、扁桃体、支气管、鼻分泌物中.传播途径主要传播途径是通过猪与猪的直接接触或短距离飞沫传播.流行特点一年四季均可发生,秋末春初季节变化时多发.饲养环境突然改变、密集饲养、通风不良、气候突变及长途运输等诱因可引起本病.猪场或猪群之间的传播,多由引进或混入带菌猪、慢性感染猪所致,集约化猪场往往呈跳跃式急性暴发,死亡率高.临床症状 最急性型本病临床症状因动物的年龄、免疫状态、疫病状态、环境因素及对病原的易感程度等不同而呈现差异.猪群中一头或几头猪只突然发病.体温升高达 ,并可出现短期呕吐.鼻、耳、眼及后躯皮肤常发绀,最后阶段出现严重呼吸困难,临死前常从口、鼻流出血性泡沫状分泌物.有时未见任何症状即突然死亡.急性型病猪体温升高,可达 ,精神委顿,喜卧少动,饮食不振.有咳嗽、喘气、呼吸困难等严重呼吸道症状.亚急性型或慢性型病猪体温可能无明显变化,常呈现间歇性咳嗽,呼吸异常、食欲不振、增重减少.疾病暴发初期,母猪常出现流产(可能由发热引起).个别猪只出现中耳炎.若混合感染猪流感病毒、巴氏杆菌、支原体等其他呼吸道病原时,病程恶化,病死率明显增加.病理特征 剖检后的眼观变化主要是纤维素性肺炎,可呈单侧、双侧、大叶性、弥漫性或多灶性,肺炎区色深,有出血点或斑块状出血,中等硬度,略有弹性,急性、亚急性和慢性病例可见肺部纤维素性渗出物.纤维素性胸膜炎明显,急性和慢性病例均可见胸腔含有带血色的液体,胸膜有粘连区,气管和支气管充满带血色的黏液性泡沫分泌物.组织学变化以肺组织坏死、出血、中性粒细胞浸润、血管栓塞、广泛水肿和纤维素性渗出为特征,坏死区周围发生巨噬细胞浸润和纤维化.结果判定易感动物出现 或 或 至少一项临床症状且符合 流行病学及 病理特征,判定为A P P感染疑似病例.学兔兔 标准下载N Y/T 样品采集和运送 耗材 无菌棉拭子.灭菌管.医用防护服.试剂 P B S,按照附录A中A 描述的方法配制.甘油磷酸盐缓冲液,按照A 描述的方法配制.活体病料采集按照NY/T 规定的方法采样.用棉拭子伸入鼻腔采集分泌物,将该鼻拭子样品端置于含有m LP B S或 甘油磷酸盐缓冲液的灭菌管中.尸体病料采集无菌采集具有典型病变的肺、肺门淋巴结、扁桃体、气管或鼻腔分泌物.最急性感染死亡的病猪,除采集上述病料外,还可取脾、血液病料,置于无菌密封袋或密封容器中.样品运送按照NY/T 规定的方法运输.采集的样品,在条件下保存时间应不超过 h.病原分离与鉴定 仪器设备和耗材 生物安全柜.C O恒温培养箱.光学显微镜.微量可调移液器(L L、L L、L L和 L L各支).m L无菌试管.吸头.接种环.试剂 血琼脂,按照A 描述的方法配制.巧克力琼脂,按照A 描述的方法配制.T S B,按照A 描述的方法配制.商品化革兰染色试剂.NA D储存液,按照A 描述的方法配制.商品化新生牛血清.尿素琼脂,按照A 描述的方法配制.商品化微量生化鉴定管(D 木糖、甘露醇、棉子糖、阿拉伯胶糖等).分离培养在生物安全柜中用接种环无菌蘸取采集的样品划线接种于血琼脂表面,再用金黄色葡萄球菌作交叉划线,在 C O条件下培养 h h,形成菌落后依据 鉴定.培养特性 菌落特性A P P为黏液型的小菌落,直径 mmmm.多数菌株可产生稳定的溶血.生物型A P P依学兔兔 标准下载N Y/T 赖NA D,包括 血清型、血清型,不能在血琼脂上生长,可在含有NA D或由共培养的葡萄球菌提供NA D的血琼脂上生长,产生“卫星现象”.生物型不依赖NA D,包括 血清型和 血清型,可在血琼脂上生长,不产生“卫星现象”.卫星现象挑取A P P菌落接种于血琼脂表面,用金黄色葡萄球菌点种或垂直划线,在 C O条件下培养 h h.越靠近金黄色葡萄球菌菌落生长的本菌菌落越大,越远的越小甚至不见菌落生长,即所谓“卫星现象”,也称V因子需要试验(见附录B中的B ).涂片染色镜检取典型菌落作革兰染色,镜检显示为革兰阴性小球杆菌,两极着色(见B ).增殖培养在生物安全柜中挑取溶血或具有“卫星现象”的典型单菌落在巧克力琼脂上进行再次纯培养后,挑取单个菌落接种于添加 新生牛血清和 g/m LNA D的T S B液体培养基中,培养 h h至液体混浊.生化鉴定 尿素酶试验将分离菌接种于尿素琼脂斜面上,置于 C O恒温培养箱中培养h h,斜面变粉红色者为尿素酶试验阳性,否则为阴性.C A M P试验在血琼脂上用具有溶血的金黄色葡萄球菌划一横线,在此横线下方隔 c m c m处划垂直线接种被检菌,置于 C O恒温培养箱中培养 h,横线与垂直线相邻空间的溶血区明显增大者为阳性,否则为阴性.糖发酵试验将少量待检菌接种于糖发酵管培养液内,置于 C O恒温培养箱中培养 h h,能分解某种糖会产酸或产酸产气.产酸时,可使颜色变黄,产气者于倒置小发酵管内出现气泡.发酵D木糖、甘露醇,不发酵棉子糖、阿拉伯胶糖者为阳性,否则为阴性.核酸鉴定对符合 的分离菌株,选用P C R检测(见第章)或实时荧光P C R检测(见第章)进行核酸鉴定.血清型鉴定对符合 的分离菌株,可用琼脂扩散实验(见第 章)进行血清型鉴定.结果判定病原分离培养形成的菌落符合A P P培养特性、染色特征、生化特性且核酸阳性者,判定A P P分离阳性.P C R检测 仪器设备和耗材 组织匀浆器或研钵.生物安全柜.冷冻离心机.恒温水浴锅.P C R扩增仪.稳压稳流电泳仪和水平电泳槽.凝胶成像系统或紫外透射仪.学兔兔 标准下载N Y/T 微量可调移液器(L L、L L、L L和 L L各支).吸头.P C R管.m L无菌离心管.试剂 P B S,按照A 描述的方法配制.消化液和消化液,按照A 描述的方法配制.酚/氯仿/异戊醇混合液,按照A 描述的方法配制.乙醇.T E缓冲液,按照A 描述的方法配制.商品化P C R反应试剂盒.T A E电泳缓冲液,按照A 描述的方法配制.商品化上样缓冲液.琼脂糖.D NA相对分子量标准物M a r k e rD L .无菌双蒸水(d d HO).阴、阳性对照:分别为灭菌的T S B培养基和灭活的A P P菌株.上、下游引物:按照附录C中C 的描述合成.样品处理 组织样品用无菌剪刀和镊子剪取典型病变组织 g g,加入 m Lm LP B S,于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨,将组织悬液转入无菌离心管中备用.鼻及气管分泌物鼻拭子在 mLmLP B S中反复挤压,r/m i n离心m i n,沉淀用 LP B S重悬备用.增菌培养物按照 所述方法进行病原分离培养,并吸取增菌培养物 L于无菌离心管中,r/m i n离心m i n,沉淀用 LP B S重悬备用.组织样品D N A的制备 分别取上述处理后样品、阴性对照、阳性对照各 L,加入到 m L无菌离心管,再在每管中加入 L消化液和 L消化液,反复吹打混匀,置于 条件下水浴 m i n m i n.分别加入 L酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,于条件下 r/m i n离心 m i n,分别吸取离心后的上层清液转移至新的 m L无菌离心管中.加入等体积 预冷的异丙醇,混匀,室温放置 m i n,条件下 r/m i n离心 m i n,轻轻倒去上清液,倒置吸水纸上,吸干液体.加入 L 乙醇,轻轻混匀;条件下 r/m i n离心 s,轻轻倒去上清液,将管壁上的残余液体离心,用微量加样器尽量将其吸干,不要碰触沉淀,置于室温条件下干燥 m i n.加入 LT E缓冲液,轻轻混匀,溶解D NA,置于 条件下保存备用.也可采用商品化的试剂盒提取D NA.鼻及气管分泌物和增菌培养物D N A的制备取鼻及气管分泌物或增菌培养物,r/m i n离心m i n.弃去上清液,沉淀用 L无菌d d HO重悬,于 水浴 m i n,置于 条件下保存备用.学兔兔 标准下载N Y/T P C R反应P C R反应体系见表.表P C R反应体系组分体积,L P C Rb u f f e r(M gP l u s)d N T P s(mm o l/L)上游引物(工作浓度 m o l/L)下游引物(工作浓度 m o l/L)模板D NA T a q酶(U/L)无菌d d HO 将P C R管放入P C R扩增仪进行扩增.反应程序为:预变性m i n,变性 s,退火m i n,延伸 s,个循环,终延伸 m i n.凝胶电泳取P C R扩增产物和D NA相对分子量标准物M a r k e rD L 各L,于 琼脂糖凝胶中进行电泳,V V恒压电泳 m i n m i n,在凝胶成像系统上观察结果,并做好记录.结果判定 成立条件阴性对照未扩增出任何条带,阳性对照扩增出 b p的条带,则试验成立(见附录D).结果判定在阴性对照和阳性对照试验结果成立的前提下,如果样品扩增出 b p的特异性条带,判定该样品A P P核酸阳性.实时荧光P C R检测 仪器设备和耗材 实时荧光定量P C R仪.微量可调移液器(L L、L L、L L和 L L各支).吸头.P C R管.试剂 商品化实时荧光定量P C R反应试剂盒.上、下游引物及探针,按照C 描述的方法合成.无菌双蒸水(d d HO).阴、阳性对照:分别为灭菌的T S B培养基和灭活的A P P菌株.样品处理样品处理见 .样品D N A的制备样品D NA的制备见 .实时荧光P C R反应实时荧光P C R反应体系见表.学兔兔 标准下载N Y/T 表实时荧光P C R反应体系组分体积,LP r e m i xE xT a q 上游引物(工作浓度 m o l/L)下游引物(工作浓度 m o l/L)探针 模板D NA 无菌d d HO 实时荧光P C R反应程序为:预变性 s;变性 s,退火 s并收集荧光信号,循环 次.结果判定 阈值设定阈值(t h r e s h o l d)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,不同仪器可根据仪器噪声情况进行调整.成立条件阴性对照应没有C t值显示或显示C t值 ;阳性对照的C t值 且出现特定的扩增曲线(见附录E).否则,实验视为无效.结果判定检测样本C t值 ,且出现特定的扩增曲线,判定为核酸阳性.检测样本 C t值 时重复一次,如果仍为 C t值 且出现特定的扩增曲线,判定为核酸阳性;否则判定为核酸阴性.检测不到样本C t值或C t ,判定为核酸阴性.琼脂扩散试验 仪器设备和耗材 水浴锅或微波炉.打孔器.载玻片.恒温培养箱.微量可调移液器(L L、L L、L L和 L L各支).吸头.试剂 琼脂糖.氯化钠.A P P 型单因子血清,见附录F.琼脂板的制备 取琼脂糖 g、氯化钠 g,加双蒸水至 m L,在沸水浴中溶化混匀.按制板所需体积分装(如用 mm mm载玻片,胶厚mm,需加琼脂凝胶 m L),保存备用.临用前,取分装好的保存琼脂凝胶管,在沸水中溶化后,倒在水平玻璃板或载玻片上,凝固后按图打孔,火焰封底.学兔兔 标准下载N Y/T 标引序号说明:A g 待检多糖抗原;A g A g 分别为 型标准株多糖抗原;S S 分别为 型标准株单因子血清.图琼脂扩散试验示意图 加样中间孔加待检菌多糖抗原(见附录G),周边孔加 型单因子血清和对应型标准株多糖抗原(见附录F),加量以加满为宜(见图).加样完毕后,将凝胶板放入湿盒内置于 恒温培养箱中反应,h后观察并记录结果.结果判定被检抗原与单因子血清之间出现明显清晰的沉淀线,并与标准型抗原和单因子血清之间形成的沉淀线完全融合,即可判为该相关血清型.酶联免疫吸附试验(E L I S A)仪器设备和耗材 酶标检测仪.恒温培养箱.洗板机.酶标板.微量可调移液器(L L、L L、L L和 L L各支).吸头.试剂 抗原包被液,按照A 描述的方法配制.洗涤液,按照A 描述的方法配制.封闭液,按照A 描述的方法配制.样品稀释液,按照A 描述的方法配制.商品化TMB显色液.终止液,按照A 描述的方法配制.抗原与抗体 A p x 重组抗原克隆A P Ps h o p e 菌株(标准菌株血清型)a p x编码基因(G e n B a n k序列号:A F )b p b p片段,插入表达载体p E T a,经I P T G诱导、N i柱纯化获得高纯度的A p x 重组蛋白,作为试验用抗原.商品化辣根过氧化酶(H R P)标记羊抗猪I g G抗体按说明书稀释使用.学兔兔 标准下载N Y/T 阴性对照血清阴性对照血清来自未经A P P疫苗免疫的健康猪,鼻拭子增菌物经P C R检测为A P P抗原阴性,A p x E L I S A检测的O D值应介于 ,过滤分装该血清作为试验中的阴性对照血清.阳性对照血清选取未免疫健康猪,以纯化A p x 重组蛋白m g配合G e l P R佐剂免疫,共免疫次,免疫间隔 d,末次免疫后d采血分离猪血清,A p x E L I S A检测O D值与阴性对照血清O D值的比值应高于 ,过滤分装该血清作为试验中的阳性对照血清.抗原包被用抗原包被液将纯化的A p x 重组抗原稀释至 g/m L,用移液器将稀释好的抗原加入到酶标板各孔内,L/孔,加盖于冰箱中放置 h h.洗涤甩掉酶标板孔内的抗原包被液,加入洗涤液 L/孔,室温()下浸泡m i n,甩去洗涤液,在吸水纸上叩击,尽量排尽洗涤液.再重新加入洗涤液,按同法洗次.封闭用移液器将封闭液加入酶标板各孔中,L/孔,温箱孵育 m i n.洗涤取出酶标板将其甩干,用洗涤液洗涤次,方法同 .加样待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清用样品稀释液作 稀释,对照血清作复孔,L/孔.加盖于 温箱内孵育 m i n.洗涤取出酶标板将其甩干,用洗涤液洗涤次,方法同 .加H R P标记羊抗猪I g G抗体HR P标记的羊抗猪I g G抗体用洗涤液按说明书稀释后使用,L/孔.加盖于 温箱内孵育 m i n.洗涤取出酶标板,将其甩干,用洗涤液洗涤次,方法同 .加底物显色液加入TMB显色液,L/孔,室温避光反应 m i n.终止反应加入终止液,L/孔.结果判定 成立条件终止反应后,m i n内在酶标仪 n m波长处,测定酶标板的每孔光吸收值.计算对照血清的平均O D值,当P/N值 (P为阳性对照平均O D值,N为阴性对照平均O D值),并且 N 时,则试验成立.结果判定计算每份被检血清O D值与阴性对照平均O D值的比值,则得出每份样品的S/N值(S为被检血清O D值,N为阴性对照平均O D值).判定标准:样品S/N值 ,样品判定A P P抗体阳性;样品S/N值 ,样品判定A P P抗体阴性.也可采用商品化的A p x E L I S A试剂盒进行检测.综合结果判定 出现 或 或 至少一项临床症状且符合 流行病学及 病理特征的发病猪,学兔兔 标准下载N Y/T 可判定疑似猪传染性胸膜肺炎.在 基础上,病原分离与鉴定(第章)或P C R检测(第章)或实时荧光P C R检测(第章)任何一项检测阳性,可诊断为猪传染性胸膜肺炎.在 基础上,酶联免疫吸附试验(E L I S A)(第 章)抗体检测阳性的发病猪,可诊断为猪传染性胸膜肺炎.学兔兔 标准下载N Y/T 附录A(规范性)溶液的配制方法(试剂为分析纯及以上)A 磷酸盐缓冲液(P B S)称取 g氯化钠(N a C l)、g氯化钾(K C l)、g磷酸二氢钾(KHP O)、g磷酸氢二钠(N aH P O HO),加入 m L双蒸水中溶解,调节溶液的p H至 ,加双蒸水定容至 m L.分装后,在 灭菌 m i n m i n,或过滤除菌,室温保存.A 甘油磷酸盐缓冲液(p H )取 m L甘油、g氯化钠(N a C l)、g磷酸二氢钾(KHP O)、g磷酸氢二钾(KH P O)、酚红 m L,加双蒸水定容至 m L.溶解后,调节溶液的p H至 ,高压灭菌 m i n,冰箱中保存备用.A 血琼脂取营养琼脂 m L煮沸溶解,高压灭菌 m i n,冷却到约,以无菌方式加入脱纤维绵羊血m L,摇匀,倾注无菌平皿.A 巧克力琼脂取营养琼脂 m L煮沸溶解,高压灭菌 m i n,冷却到约,以无菌方式加入脱纤维绵羊血m L,置于 水浴中 m i n m i n,摇匀后倾注无菌平皿.A 胰蛋白大豆肉汤(T S B)取 gT S B,加双蒸水溶解并定容至 m L,高压蒸汽灭菌 m i n,条件下保存.使用前,加入 m L无菌新生牛血清和m LNA D储存液(见A ).A 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(N A D)贮存液取gNA D溶解于 m L双蒸水中,充分摇匀溶解后,m的细菌滤器过滤,分装于无菌离心管中,置于 条件下保存个月.A 尿素琼脂称取g蛋白胨、g氯化钠(N a C l)、g葡萄糖、g磷酸二氢钾(KHP O),加双蒸水溶解后加入m L 酚红溶液混匀,调p H至 ,加双蒸水定容至 m L.加入 g琼脂后加热混匀,高压灭菌 m i n,冷却至 后,加入过滤除菌的 尿素溶液 m L至终浓度,分装于灭菌试管中,置斜面备用.A 消化液和消化液消化液:T r i s HC l(p H )终浓度为 mm o l/L;E D T A(p H )终浓度为 mm o l/L;S D S终浓度为 g/m L;N a C l终浓度为 mm o l/L.消化液:m g蛋白酶K溶解于m L灭菌双蒸水中.A 酚/氯仿/异戊醇混合液T r i s饱和酚氯仿异戊醇按 的比例混合.学兔兔 标准下载N Y/T A T E缓冲液配置终浓度为 mm o l/LT r i s HC l(p H )和mm o l/LE D T A(p H )的混合溶液,高压灭菌后,保存备用.A T A E电泳缓冲液称取 gT r i s碱、m L冰乙酸、m L m o l/LE D T A(p H ),溶解混匀后调p H至 ,用双蒸水定容至 m L,充分混匀后即为 T A E,保存备用.使用前,用双蒸水将其做 倍稀释即为T A E,现用现配.A 抗原包被液(m o l/L,p H 碳酸盐缓冲液)取 g碳酸钠(N aC O)、g碳酸氢钠(N a HC O)加双蒸水溶解并定容至 m L,高压 m i n,冰箱保存.A 洗涤液(m o l/Lp H ,P B S T w e e n)取 g磷酸氢二钠(N aH P O HO)、g磷酸二氢钾(KHP O)、g氯化钠(N a C l)、g氯化钾(K C l)加双蒸水溶解并定容至 m L,再加入 m LT w e e n .A 封闭液洗涤液内加入终浓度明胶,热水溶解后,恢复至室温备用.A 样品稀释液洗涤液内加入终浓度脱脂奶粉,溶解成浑浊液备用.A 反应终止液(m o l/L硫酸)取浓硫酸(纯度)m L加入 m L双蒸水,静置冷却后备用.学兔兔 标准下载N Y/T 附录B(资料性)A P P形态图B A P P菌落形态及卫星现象见图B .图B A P P菌落形态及卫星现象B A P P革兰染色镜检形态图见图B .图B A P P革兰染色镜检形态图()学兔兔 标准下载N Y/T 附录C(规范性)P C R检测引物及实时荧光P C R检测引物、探针C P C R检测引物表C 列出了P C R检测引物信息.表C P C R检测引物目的片段引物名称 的序列产物大小a p xA基因上游引物G G G GA C G T AA C T C G G T GA T T下游引物G C T C A C C AA C G T T T G C T C A T b pC 实时荧光P C R检测引物、探针表C 列出了实时荧光P C R检测引物及探针信息.表C 实时荧光P C R检测引物及探针目的片段引物名称 的序列产物大小a p xA基因上游引物G G G GA C G T AA C T C G G T GA T T下游引物G C T C A C C AA C G T T T G C T C A T探针F AM C G G T G C G GA C A C C T A T A T C T B HQ b p学兔兔 标准下载N Y/T 附录D(资料性)P C R检测判定电泳图例P C R检测判定电泳图例见图D .标引序号说明:M D L M a r k e r;阳性对照;阴性对照.图DP C R检测判定电泳图例学兔兔 标准下载N Y/T 附录E(资料性)实时荧光P C R检测判定图例E 实时荧光P C R检测判定图例见图E .图E 实时荧光P C R检测判定图例E 说明扩增曲线A P P核酸浓度由左至右为n g/L、n g/L、n g/L、n g/L、n g/L,阴性对照没有C t值显示.学兔兔 标准下载N Y/T 附录F(资料性)单因子血清制备F 免疫抗原的制备将A P P标准菌株划线于巧克力培养基,于 培养 h,将琼脂表面的菌苔用含 福尔马林生理盐水洗下来,洗涤次后,重悬至约 细胞悬液.F 单因子血清制备每种血清型A P P抗原免疫健康新西兰大白兔只.第一次免疫剂量为 m L/只,分点点背部皮下注射,之后次免疫均为耳缘静脉注射,每只兔每次免疫剂量分别为m L、m L、m L、m L、m L、m L、m L,免疫周期为次/周.免疫完成周后,采血分离血清.所有血清置于 保存,长期保存应置于 保存.学兔兔 标准下载N Y/T 附录G(资料性)多糖抗原的提取G 将接种在巧克力琼脂上的A P P培养物用适量生理盐水洗下,以 r/m i n离心 m i n,去上清液,再用生理盐水洗次.G 沉淀菌体按(V/V)加入双蒸水,混匀后置于 水浴中,使瓶中菌液接近水浴温度,再加入等体积 酚液,置于 水浴 m i n m i n,其间不断搅拌.G 取出后在冰浴中冷却.G 在下以 r/m i n离心 m i n,离心后分层,即水层、酚层和不溶解的部分.G 小心吸取上部水层.G 将酚层和不溶性物质加入与B 中等量的 双蒸水,搅拌后放入 水浴 m i n m i n,然后再重复B B 程序提取次.G 将次收集的水层混合,即为A P P琼脂扩散抗原.学兔兔 标准下载