人类免疫缺陷病毒(I型)HIV-RNA核酸定量检测SOP.doc

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人类免疫缺陷病毒（I型）核酸定量检测系统标准操作程序
1. 目的：规范超敏PCR仪器配置系统及人类免疫缺陷病毒（HIV-I RNA）的检测过程，确保检测结果的准确性和重复性。
2. 检测方法和原理
2.1 检测方法：TaqMan探针荧光定量PCR法。
2.2 检测原理：人类免疫缺陷病毒（I型）核算定量检测试剂盒（PCR-荧光法）采用核酸扩增技术，定量检测人血浆中HIV-I RNA。该方法包括三个主要步骤：（1）样品制备以分离HIV-I RNA；（2）靶RNA的逆转录形成互补DNA（cDNA）；（3）靶（cDNA）的PCR扩增以及裂解的、靶特异性的、双标记寡核苷酸探针的检测。
3. 标本要求
3.1 标本类型：血浆（EDTA抗凝）。
3.2 标本的采集与处理
3.2.1 标本采集量：采集患者静脉血6 mL（EDTA抗凝真空采血管）。
3.2.2 标本处理：标本采集后应在2小时内送至实验室，实验室收到标本后在1小时内处理标本。
3.2.2.1签收：门诊、住院以及CDC标本签收条码，并做好相关登记工作。
3.2.2.2编号：对标本进行唯一编号，内容如下：“年月日6位数字+标本号3位数字”，例如2018年1月1日收到一个HIV-RNA标本即编号为：“180101401”。
3.2.2.3离心：800-1600g,20min离心标本。
3.2.2.4标本保存：血浆在室温（25-30℃）最多存储1天；2-8℃最多存储6天；-20℃—-80℃可存储6周。将待检血浆以2管每管1200 uL量存储于2.0mL戴螺旋盖的无菌聚丙烯管，在管壁编写如3.2.2.2的编号。未检标本放置于专用样本盒中，冻存于-80 ℃冰箱。已检血浆置-80ºC冰箱保存2个月，到期后按科室有关程序作废弃标本处理。
4.仪器和试剂
4.2 试剂：（配套封闭试剂）
4.2.1 试剂盒（包含核酸提取试剂、质控品及阳性定量参考品组分、PCR 检测试剂组分）保存于2-8℃环境下，有效期22个月。
4.2.3试剂开瓶后，在室温条件下放置时间不应超过72小时；2-8℃条件下不超过30天。
4.2.4 主要组成成份：
组份名称
规格
数量
质控品

阴性质控品
1000μL/管
1
临界阳性质控品
1000μL/管
1
强阳性质控品
1000μL/管
1
HIV2CS1

48测试
1
HIV2CS2

48测试
1
HIV2CS3

48测试
1
HIV2CS4

48测试
1
5.标准操作
5.1 COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48 的配置如下：

配置
实验所需的架子和耗材
相应位置
COBAS AmpliPrep_
COBASTaqMan 48
a. K-tubes放在样本架上
b. 带有K-tips 的K-tip 架
c 将带有样本或质控的S-tubes 放在样本架上
d. 带有SPUs 的SPU-架
e. CS1放在一个试剂架
f. CS2, CS3, CS4放在一个试剂架
g. 将空的K-carrier 放在 K-carrier 架上
样本核酸提取完成后：
K-carrier上的K-tubes 手工转移
F-H
M-P
F-H
J-L
A
B-E
M-P
(M-P)
6.2. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48上使用试剂及耗材的保存及注意事项：
1). 所有试剂（HIV-I test试剂）2-8℃保存，即拿即用；
2). 试剂启用后，可保存28 days (2-8℃)；
3). 试剂启用后，在Cobas Ampliprep上累计使用时间最多64 hrs；
4). CTM(-)阴性质控、L(+)弱阳性质控、 H(+)强阳性质控，使用后的废弃；
5). 洗液2-30℃保存，打开后可使用28 days；
6). 耗材（S-tube/样本条码/K-tip/K-tube/SPU）常温保存。
6.3. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48上使用样本的保存及注意事项：
1). 需要的样本为血浆；
2). 血样在2～25 ℃下运输，24hrs内 (HIV RNA)收集出血浆(室温800-1600g离心 20分钟)；
3). HIV RNA检测：血浆可在室温下(25-30℃)保存最多1天，在2～8℃最多保存6天，或者-20~-80℃下长期保存，至少6周；
4). 血浆建议倒取1100-1200 μL进行保存；
5). 血浆冷冻时，最多冻融5次不损失HIV RNA。
6.4. COBAS AmpliPrep_COBAS TaqMan 48 HBV DNA定量检测操作流程：
A
仪器初始化及维护
A1
打开COBAS AmpliPrep 和 COBAS TaqMan 开关，等待仪器初始化完成，为 stand-by 状态
A2
登陆电脑及 AMPLILINK 软件
登陆Windows® XP操作系统（ User ID 和 password）
a) 双击桌面上AMPLILINK 软件图标
b) 登陆AMPLILINK 软件（ User ID 和 password）
A3
通过软件Status界面检查洗液量是否足够，如不够需要更换新的洗液
A4
检查软件维护界面Due 按钮下列出的需要进行的维护内容，按照维护手册进行相应内容的维护工作 ，COBAS AmpliPrep 仪器自动进行系统初始化工作
B
加载试剂
将所有试验需要的试剂匣从 2-8°C 冰箱拿出，立即放在试剂架上并放入 COBAS AmpliPrep 仪器中，试验开始前在仪器上平衡至少30分钟。不要将试剂匣放在仪器外进行温度平衡，以免在试剂匣表面形成水凝结，造成条码的损坏。如果在试剂匣表面有水凝结，不要对条码部位进行擦拭，以免损坏条码造成仪器无法对条码进行辨识。
B1
将CS1 试剂匣放在一个试剂架上，将试剂匣 CS2, CS3 和CS4 放于另一个试剂架上
B2
将放有CS1的试剂架放入到COBAS AmpliPrep 仪器中的A位置
B3
将放有CS2, CS3 和 CS4的试剂架放入到COBAS AmpliPrep仪器中的B、C、D、E的任一位置
C
加载耗材
注意：根据检测的样本数计算需要的COBAS AmpliPrep 试剂匣数目, 样本处理单元(SPU), 样本管(S-tube), K-枪头(K-tips) 和 K-管(K-tubes) 的数量。 每个样本或质控分别需要 一个SPU, 一个S-tube, 一个K-tip 和一个K-tube 。
C1
加载样本处理单元 (SPUs)
计算需要SPU数量，一个样本或质控需要一个SPU
将SPUs 放入到SPU 架中，向下压SPU的边缘部分（不要碰到S-tip的部分）使SPU完全坐稳在SPU架的底部
确认 SPUs 正确的放入在SPU 架中 (若SPUs放置不正确，可能造成仪器运行中停止)
将SPU 架放入到COBAS AmpliPrep仪器的 J, K 或 L位置
C3
使用COBAS TaqMan 48 分析仪时，将K-carriers 放在K-carrier 架上，放在COBAS AmpliPrep 的M, N, O 或 P 位置
C4
加载K-tip 架于COBAS AmpliPrep 上M, N, O 或 P 位置
D
创建命令和加载样本
D1
样本架准备，将样本的条码夹放在样本架上相应有样本管 (S-tube)的地方
将专用于质控的条码夹放在样本架上与阴性质控(-) C, 弱阳性质控L(+) 和强阳性质控相对应的地方
注意对相应的质控使用正确的质控条码夹
D2
& D3
通过AMPLILINK 软件创建命令 （见下图）
在软件orders界面下的Sample rack 按钮下创建样本及质控的命令
选择相应的检测项目，并进行保存
打印创建好的样本及质控工作表

D4
&
D5
在生物安全柜中进行样本准备
涡旋混匀样本及质控3-5秒，将1000 µl 样本及质控品转移到相应的样本管S-tube中；避免将颗粒或凝块状物质转移到样本管S-tube中
装有样本及质控的样本管放到样本架相应的位置（与创建好的命令工作表中的位置一致）；确保质控条码上的lot 号码与质控的lot 号码一致；确保相应的质控使用正确的质控条码夹 ；避免样本或质控污染样本管S-tube的上部
D6
加载带有样本管的样本架于COBAS AmpliPrep 仪器的F, G 或 H 位置
E
开始运行COBAS AmpliPrep 仪器
E1
在AMPLILINK 软件上启动运行COBAS AmpliPrep
检查Status 界面下，确保没有样本、质控或试剂被锁住
确保所有的样本和耗材都已加载到COBAS AmpliPrep中，点击Start 按钮
F
COBAS AmpliPrep 仪器运行结束后，手工转移提取好的样本到COBAS TaqMan48中，应避免将所有提取好的样本及质控直接放置于日光或光源下
F1
检查AMPLILINK 软件中可能显示的标记flags及错误信息
F2
在COBAS AmpliPrep处理好的样本及质控必须在120 分钟内转移到COBAS TaqMan 48 中开始反应，不要冷冻或在2-8°C储存处理好的样本及质控 。
F3
丢弃COBAS AmpliPrep 仪器中的废物
G
加载处理好的样本及质控
G1
加载处理好的样本及质控到COBAS TaqMan 48 中– 通过K-carrier 转移工具，手工转移带有 K-carrier 的 K-carrier 架到COBAS TaqMan 48 中
H
开始运行COBAS TaqMan
H1
打开扩增仪的外部盖子，将 K-carrier 放入到扩增模块中并关闭盖子，开始运行COBAS TaqMan 48
I
COBAS TaqMan 48 运行结束
I1
运行结束，打印结果报告
检查结果中的标记flags 或错误信息
接受结果，数据自动备份(archive)
I2
将检测完毕的K-tubes 从COBAS TaqMan 48的废物盒中拿出，根据实验室规定进行相应处理或丢弃
7.质量控制
7.1 阴性质控品：必须产生“没有检测到目标”的结果。如果有标记标为无效，那么整个批次都是无效的。
7.2 阳性质控品：阳性质控品的检测值应该落在其指定的范围内，如果一个或两个质控品标记表示无效，那么整个批次无效。
8.结果报告
对于有效批次，检查每个样品是否在结果打印中出现标记或注释。结果解释如下：有效批次可能包括有效和无效样品的结果，这取决于每个样品是否得到标记和/或注释。
样品结果解释如下：
测定结果
解释
没有检测到目标

HIV-I的CT值超出该检测的界限之上或者未能获得HIV-I的CT值。报告为“HIV-I RNA not detected”。
<2.00E+01cp/mL
计算所得的cp /mL结果低于该检测试剂检测限。报告为“<20 cp /mL”
≥2.00E+01 cp/mL且≤1.00E+07 cp/mL
该区间为检测系统的线性范围
>1.00E+07 cp /mL
结果超出线性范围。报告“>1.00E+07 cp/mL”。如果希望得到定量结果，必须稀释原始样本，重复该测试。以1：100与HIV-I阴性经EDTA处理人类血浆稀释。根据稀释因子换算最终的结果。
9.性能参数
9.1 最低检出限及定量限：试剂最低检出限浓度为20 cp/mL。
9.2 精密度：检测高浓度（1.00E+07 cp/mL），低浓度（2.00E+01 cp/mL）HIV样本，批内及批间的检测浓度对数值的变异系数（CV%）均小于5%。
9.3 线性范围：本试剂盒的线性范围为20 cp/mL～1.00E+07 cp/mL之间呈线性。以高浓度的HIV定值样本，梯度稀释12个浓度为待检样本，分析理论值与检测值呈现良好的线性相关，相关系为0.989。
9.4 对不同基因型的覆盖：本试剂盒对HIV-I M组的8个亚型，均可在最低检出限浓度检出为阳性。
9.5 分析特异性：
9.5.1 临床特异性：对临床HIV-RNA阴性样本进行检测，结果均为阴性。
10.临床意义：本检测方法旨在与临床表征以及疾病进展中的其他实验室标记物相结合，用于HIV-I M组与O组感染病人的临床管理。通过测定HIV-I RNA的基线水平，可评价患者预后；或者抗病毒治疗过程中通过测定EDTA处理的血浆中HIV-I RNA水平的变化，监测抗病毒治疗的效果。
11.安全防护措施
11.1 为了避免样本中任何潜在的生物危险，试剂盒中阳性质控品、参考品和检测样本应视为具有传染性物质，避免接触到皮肤和粘膜，故而实验操作过程中必须戴一次性乳胶手套；样本的处理必须在可防止气雾外流的生物安全柜中操作。
11.2 样本制备区所用过的试管、吸头需打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；样本操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
11.3实验完毕用10%次氯酸或75%酒精处理工作台和移液器，然后用紫外线灯照射30分钟。
12.引用文件
《全自动核酸提取及扩增分析系统使用说明书》（罗氏公司）
《HIV-I病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光法）》说明书（罗氏公司）
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