BCL11A在神经细胞中稳定低表达对智能障碍风险基因的转录调控机制.pdf

Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期278网络出版地址：https：/ 发育与再生四川省重点实验室组织胚胎学教研室（成都 610500）；2.成都医学院 病理学与病理生理学教研室（成都 610500）【摘要】目的探究稳定敲降BCL11A对神经发育关键因子的表达影响。方法设计并筛选靶向人源BCL11A的shRNAs，通过慢病毒构建能稳定敲降BCL11A的人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y细胞）。首先，利用逆转录荧光定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹技术实验体外验证BCL11A的敲降效果，RT-qPCR实验探索BCL11A敲降后皮质发育关键转录因子的表达变化，进而利用转录组测序分析BCL11A敲降后差异基因的富集情况，最终通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验验证差异基因启动子的转录活性标志pPol以及染色质活性修饰H3K9ac的变化。结果BCL11A敲降后神经元特异转录因子GRM7、BCL11B、CTCF、ADCYAP1R1、NeuroD1/2、PAX6、SATB1/2的表达降低；皮质神经元关键转录因子GRIN1、TCF12、MEF2D的表达升高。转录活性标志pPol以及染色质活性修饰H3K9ac在GRM7启动子的富集度降低，在GRIN1启动子的富集呈现升高趋势。结论转录因子BCL11A表达缺失可影响智能障碍相关转录因子的转录活性与表达变化。【关键词】慢病毒；BCL11A；CRISPR/Cas9；神经系统【中图分类号】Q291【文献标识码】ATranscriptional Regulation Mechanisms of Stable BCL11A Knockdown in Neuron on Risk Genes of Intellectual DisabilityTang Xiaohan1，2，Chen Jinrong1，Su Bingyin1，Li Shurong1，2，Xie Xuemin1.1.Department of Histology and Embryology，Key Laboratory of Development and Regeneration of Sichuan Province，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.Department of Pathology and Pathophysiology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of stable knockdown of BCL11A on the expression of key factors in neurodevelopment.Methods shRNAs targeting human BCL11A were designed and screened.Human neuroblastoma cell line（SH-SY5Y cells）that could stably knock down BCL11A was constructed by lentivirus.The knock-down effect of BCL11A was verified in vitro by reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）and Western blotting（WB）.The expression changes of key transcription factors in cortical development after BCL11A knockdown were detected by RT-qPCR.The enrichment of differential genes after BCL11A knockdown was analyzed by transcriptome sequencing.The changes of the transcriptional activity marker pPolII and the chromatin modification factor H3K9ac of the differential gene promoters were verified by chromatin immunoprecipitation（ChIP）.ResultsAfter BCL11A knockdown，the expressions of neural-specific transcription factors GRM7，BCL11B，CTCF，ADCYAP1R1，NeuroD1/2，PAX6 and SATB1/2 were down-regulated，while the expressions of key transcription factors GRIN1，TCF12 and MEF2D in cortical neurons were up-regulated.The enrichment of the transcriptional activity marker pPolII and the chromatin modification factor H3K9ac were down-regulated in GRM7 promoter while up-regulated in GRIN1 promoter.Conclusion Stably down-regulated BCL11A leads to changes in transcriptional activity and expression of transcription factors related to intellectual disability.【Key words】Lentivirus；BCL11A；Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR/Cas9）；Nervous system*基金项目：四川省科技厅应用基础研究重点项目（No：2021YJ0018，No：2019YJ0366，No：2021YJ0169）；成都医学院发育与再生四川省重点实验室基金重点项目（No：SYS18-01）通信作者：李淑蓉，解学敏 Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期279BCL11A基 因 座 位 于 人 类 染 色 体 2p16.1，编 码krppel样锌指蛋白1。BCL11A在血液和神经组织中呈高表达，可调节血红蛋白的转化并介导B细胞恶性肿瘤的发生2。BCL11A是皮质发育所必需的关键因子3，在皮质发育过程中，BCL11A调控神经元从多极形态到双极形态的转换，从而参与深层皮质中的投射神经元形成4-5。BCL11A缺陷的神经元表现为辐射迁移受损和Semac3c的过表达，进而参与调节智能障碍（intellectual disability，ID）关联基因TBR1在皮质中的表达，导致ID6。ID的临床表现为进行性的认知能力受损，伴随适应社会环境能力的严重缺陷，其全球发病率高达237，病因多源于遗传因素。遗传性ID受蛋白表达、DNA碱基修饰、染色质共价和非共价变化等多种转录以及表观遗传调控8。临床报道9显示，BCL11A基因座的缺失会介导 2p15-p16.1缺失型ID发生，并伴有持续性胎儿血红蛋白升高。2p15-p16.1微缺失综合征是一种特殊类型的遗传性ID，其临床表现为中至重度ID、自闭症、小头畸形以及包括皮质在内的大脑结构异常等特征10。然而，BCL11A在神经发育中的调控方式及参与 2p15-p16.1 微缺失综合征的具体机制尚需进一步阐释。前期研究11证实，BCL11A主要在小鼠胚胎 13.5 d 的大脑皮质表达，并通过设计siRNA瞬时敲降BCL11A，致使细胞转录活化水平整体下降，初步证明BCL11A在胚胎皮质发育过程中具有转录激活作用。为了进一步探索BCL11A如何参与神经组织的表观遗传调控，本课题组在此基础上，首先通过慢病毒载体构建能长期、稳定敲降BCL11A的细胞株，并利用实时荧光 定量PCR（reverse-transcription quantitative PCR，RT-qPCR）和蛋白质印迹技术，探索BCL11A对皮质发育关键转录因子的表达影响，继而转录组测序分析BCL11A敲降后差异基因的富集情况，最终通过染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）验证差异基因启动子的染色质活性变化，从而初步揭示BCL11A在神经细胞中对ID风险基因的转录调控机制。1材料与方法1.1实验细胞293T细胞系（人肾上皮细胞系）来源于人胚肾细胞、SH-SY5Y细胞系（人神经母细胞瘤细胞系）来源于人神经母细胞，均为本实验室冻存细胞。1.2试剂与仪器 1）主要试剂：蛋白质印迹技术整套试剂（上海碧云天）、蛋白酶抑制剂（北京擎科）、RIPA裂解液（上海碧云 天）、anti-Ctip1抗 体（上 海Abcam）、anti-actin抗体（上 海Abcam）、anti-GAPDH抗 体（上 海Abcam）、anti-BCL11A抗体（上海 Abcam）、pPol（上海Abcam）、H3K9ac（上海Abcam）；opti-MEM 培养基和达尔贝科 极限必需培养液（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）/F12（美国Gibco）、DMEM培养基（美国Gibco）、0.25胰酶及胎牛血清（美国Gibco）；抗生素-抗真菌（美国 Thermo）、聚凝胺（北京Solarbio）、TRIzol（美国Thermo）、逆转录RT-qPCR试剂盒（北京Trans Gen Biotech）。2）主要仪器：Olympus SZX2-ILLT荧光显微镜（日本Olympus）、PCR核酸扩增仪（美国Bio-Rad）、CO2培养箱（美国Thermo）、倒置荧光显微镜（日本 Nikon）、台式低温离心机（美国Thermo）、RT-qPCR 仪 及CFX96TM Real-time system（美国Bio-Rad）。1.3实验方法1.3.1细胞的培养与传代细胞复苏后，在 37、5 CO2 条件下，使用完全培养基（10 Gibico胎牛血清+1抗真菌抗生素）培养HEK293T、SH-SY5Y细胞，每 12 d采用 1PBS轻柔清洗后，更换 1次培养基，细胞汇合度达 80左右时进行传代。1.3.2shRNA慢病毒质粒的构建及病毒收集在NCBI网站上下载人源BCL11A基因的全长序列，设计5组慢病毒序列（表 1）。PCR扩增目的片段后，引物退火连接目标片段，待感受态细胞为冰水混合状态时进行转化连接产物，然后在 37 培养箱中过夜培养。第2天挑选克隆于 37 培养箱中，220 r/min摇晃过夜培养后，提取质粒测序鉴定。表 1慢病毒引物序列引物名称引物序列shhsB1-FccggacagaacactcatggattaagctcgagcttaatccatgagtgttctgttttttgshhsB1-RaattcaaaaaacagaacactcatggattaagctcgagcttaatccatgagtgttctgtshhsB2-FccggacctctccatgggattcatatctcgagatatgaatcccatggagaggttttttgshhsB2-R aattcaaaaaacctctccatgggattcatatctcgagatatgaatcccatggagaggtshhsB3-FccggccagaggatgacgattgtttactcgagtaaacaatcgtcatcctctggtttttgshhsB3-R aattcaaaaaccagaggatgacgattgtttactcgagtaaacaatcgtcatcctctggshhsB4-F aattcaaaaagcatagacgatggcactgttactcgagtaacagtgccatcgtctatgcshhsB4-R ccgggcggttgaatccaatggctatctcgagatagccattggattcaaccgctttttgshhsB5-F aattcaaaaagcggttgaatccaatggctatctcgagatagccattggattcaaccgcshhsB5-R ccggacctctccatgggattcatatctcgagatatgaatcccatggagaggttttttgJournal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期280dynabeads protein A磁珠，4 摇床慢速摇 2.5 h，去除非特异性结合的杂质，磁架上静置 1 min。将管中清亮液体吸取到新EP管，加入dynabeads protein A，4 摇床过夜。依次使用Wash buffer、分别 4 摇床慢速清洗磁珠，弃去液体，向珠子中加入新鲜制备的提取缓冲液，置于磁架上提取染色质复合物。样本提取液和input样品中，加入RNase、NaCl、蛋白酶K，混匀，65 水浴裂解过夜，第 2天抽提DNA后，RT-qPCR定量分析。1.4统计学方法 采 用ImageJ及Graphpad Prism 8.0软 件 进 行 统计学分析，定量资料采用（）描述，两组间比较采用t检验，3组及以上表达水平差异采用ANOVA分析。检验水准除特别说明外均设定为 0.05。2结果2.1成功构建稳定敲降 BCL11A 的 SH-SY5Y 细胞株成功构建 4株稳定敲降BCL11A的SH-SY5Y-sh 细胞株，不同慢病毒细胞株的细胞生长速率存在 明显差异，SH-SY5Y-sh1a、SH-SY5Y-4b的生长密度较 SH-SY5Y-2c、SH-SY5Y3d低（图 1）。1.3.3慢病毒介导稳定敲降BCL11A的SH-SY5Y细胞稳定株的构建本研究部分设计并根据测序结果，筛选出测序结果正确的针对BCL11A的shRNA质粒：sh1a、sh2c、sh3d、sh4b。利 用 载 体 质 粒pLKO.1-shRNA1a/2c/3d/4b以及HIV慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G（质量比例为 107.53.5）进行共转染。以eGFP为对照，收集 48、72、96 h的含有 shRNA 病毒上清，选择 72 h病毒感染SH-SY5Y细胞。细胞生长密度为 80时进行感染，病毒感染 48 h后，每隔 48 h向完全培养基里加入嘌呤霉素 10 g/L Polybrene筛选，1周后筛选出目的细胞株。1.3.4RT-qPCR 通过TRIzol法提取各组细胞的总RNA，然后使用超微量分光光度计检测RNA 的浓度和纯度，按说明书取 2 g总RNA进行逆转录，参照 试 剂 盒TransScript All-in-One First-Stand cDNA Synthesis SuperMix for RT-qPCR说明书步骤操作，得到cDNA，以cDNA为模版进行RT-qPCR检测目的基因表达情况。1.3.5蛋白质印迹技术验证BCL11A蛋白表达水平 收集细胞，用PBS缓冲液清洗 23次，用RIPA裂解液 冰 上 裂 解 60 min后，将 裂 解 液 经 12 000 r/min，离 心 半 径 9.6 cm，4，离 心 30 min。经 浓 度 12 SDS-PAGE分 离 胶、5 SDS-PAGE浓 缩 胶、电 泳 电压 60120 V垂 直 电 泳、300 mA恒 流 120 min转 膜。PVDF膜用含 5脱脂奶粉的封闭液室温封闭 2 h后，分 别 与BCL11A一 抗（11 000）和GAPDH一 抗（11 000）在 4 摇床孵育过夜。含聚山梨酯-20的Tris盐酸缓冲液（Tris buffered saline with tween20，TBST）清洗 3次后，再与辣根过氧化物酶标记的二抗（15 000）室温孵育 2 h，洗涤 3次后，将化学发光试剂（electrochemiluminescence，ECL）A液和B液 11比例混合，覆盖到膜上，置于 Bio-Rad 成像系统进行拍摄，使用ImageJ软件进行分析。1.3.6ChIP实验分析神经元特异性因子的启动子活性 SH-SY5Y-sh细胞用终浓度 1甲醛固定，加入甘氨酸终止反应，PBS清洗后，离心收集固定好的细胞，Lysis buffer重悬细胞放冰上 10 min，离心后用PBS漂洗。NCP buffer重悬，冰上放置 10 min，ChIP Lysis buffer重悬，冰上放 30 min 裂解细胞核膜，超声仪使染色质碎裂，用等超声体积的酚氯仿提取超声样品，取上清液，超声样品分为 3组，即抗体IP组、IgG组和input组。每个样品加入IgG，再加入磁珠Invitrogen 2.2SH-SY5Y-sh细胞株中BCL11A的mRNA表达水平 SH-SY5Y-sh细 胞 株 的 RT-qPCR 实 验 表 明，SH-SY5Y-sh1a、SH-SY5Y-sh2c、SH-SY5Y-sh3d细 胞 株 中 BCL11A的mRNA干扰效果明显，其中，SH-SY5Y-sh1a 细胞株BCL11A的mRNA水平下调为对照组的 73.5（P0.01），SH-SY5Y-sh2c的mRNA水平下调为 43.0（P0.001），SH-SY5Y-sh3d细胞株BCL11A的mRNA水平下调为 39.0（P60；C：嘌呤霉素 10 g/L筛选第 1天、第 3天、第 7天各慢细胞株的生长情况。sh1a100 m100 mABCsh2csh3dsh4b第1天第3天第7天100 mJournal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期281图 2RT-qPCR检测SH-SY5Y-sh细胞中BCL11A的干扰效率（，n=3）注：与SH-SY5Y-Cas9-72 h比较，*P0.01，*P0.001。图 3SH-SY5Y-sh细胞中BCL11A蛋白表达水平（，n=3）注：A：SH-SY5Y-sh细胞中BCL11A蛋白表达水平；B：通过ImageJ定量分析BCL11A蛋白的表达量；与SH-SY5Y-WT比较，*P0.01，*P80.0（P0.001），而SH-SY5Y-Sh3d细胞BCL11A蛋白表达量下调约 20.0（P0.01）；将慢病毒细胞株的蛋白表达量灰度值统计分析显示，SH-SY5Y-Sh1a、SH-SY5Y-Sh2c 细胞的BCL11A蛋白表达量最低（图 3）。SH-SY5Y-WTSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2cSH-SY5Y-sh3dSH-SY5Y-sh4bSH-SY5Y-WTSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2cSH-SY5Y-sh3dSH-SY5Y-sh4b1.21.00.80.60.40.20.0BCL11A?BCL11A?actinA细胞株中皮质发育关键转录因子TCF12的mRNA表达上调至 1.25倍（P0.001）、MEF2D的mRNA表达量上调至 3倍（P0.001）。SH-SY5Y-sh2c细胞株中皮质发育关键转录因子TCF12的mRNA表达上调至 1 300倍（P0.001），MEF2D的 mRNA表 达 量 上 调 至 3.8倍（P0.001）。由此提示，BCL11A对于皮质神经元关键转录因子的表达具有负向调控作用，BCL11A对TCF12、MEF2D的抑制作用呈线性负相关（图 4）。图 4SH-SY5Y-sh细胞中皮质发育关键转录因子TCF12、MEF2D的mRNA表达水平（，n=3）注：AB：SH-SY5Y-sh1a、SH-SY5Y-sh4b细胞株RT-qPCR实验显示转录因子TCF12、MEF2D的表达情况；与SH-SY5Y-Cas9-72 h比较，*P0.01，*P0.001。*TCF12/?actin?*MEF2D/?actin?1 5001 4001 3001 2001.51.00.50.04.03.02.01.00.0SH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2cSH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2cAB5.55.04.51.00.50.0*SH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2cSH-SY5Y-sh3dSH-SY5Y-sh4bBCL11A/?actin相对表达量2.5BCL11A 敲 降 后 关 键 基 因 BCL11B、CTCF、ADCYAP1R1、NeuroD1/2、PAX6、SATB1/2的表达水平选取BCL11A蛋白水平敲降效果明显的SH-SY5Y-sh1a、SH-SY5Y-sh2c细 胞 株 进 行RT-qPCR实 验，观 察 皮质神经元发育关键转录因子的表达变化。转录因子BCL11B为参与神经系统及免疫系统发育的核内转录Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期282SH-SY5Y-sh2c细胞株中，BCL11A的mRNA水平降至 44.070.0（P0.001），此时细胞株内皮质神经元发育关键基因BCL11B、CTCF、NeuroD1、NeuroD2、SATB1、ADCYAP1R1、PAX6、SATB2 的mRNA表达降低。以上结果提示，BCL11A可正向调控以上皮质神经元关键转录因子的表达，且对胚胎发育关键转录因子ADCYAP1R1、PAX6、SATB2的降低程度更明显（图 5）。因子14；CTCF广泛存在于真核生物中，可阻断增强子和启动子的相互作用15；ADCYAP1R1在焦虑、恐惧认知和应激反应中发挥重要作用16；NeuroD1/2参与调控RNA聚合酶启动子，在神经系统发育以及细胞形态分化中起重要作用17；在胚胎发育过程中，PAX6对调节神经系统起重要作用18；SATB1/2参与调节神经系统的分化和成熟19。RT-qPCR 结 果 显 示，构 建 的 SH-SY5Y-sh1a、2.6转录组测序分析 BCL11A 在神经细胞中参与调控的靶基因及相关启动子染色质水平变化转录组测序样显示，SH-SY5Y-sh细胞株组差异表达的 246个基因进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析显示，193个基因富集到人类疾病相关因素的GO条目（P0.05），有约 200个基因富集到生物系统及环图 5SH-SY5Y-sh细胞中皮质发育关键转录因子BCL11A、BCL11B、CTCF、ADCYAP1R1、NeuroD1/2、PAX6、SATB1/2的mRNA表达水平（，n=3）注：AI：RT-qPCR对SH-SY5Y-sh1a、SH-SY5Y-sh4b细胞株转录因子BCL11A、BCL11B、CTCF、ADCYAP1R1、NeuroD1/2、PAX6、SATB1/2表达情况的影响；与SH-SY5Y-Cas9-72 h比较，*P0.01，*P0.001。1.5001.0000.5000.0001.5001.0000.5000.1000.0001.5001.0000.5000.1000.0001.5001.0000.1000.0001.5001.0000.0010.0001.5001.0000.2000.1000.0001.5001.0000.0100.0050.0001.5001.0000.5000.0001.2000.0080.0050.0030.0010.000BCL11A/?actin?SH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2c*BCL11B/?actin?SH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2c*CTCF/?actin?SH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2c*ADCYAP1R1/?actin?SH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2cNeuroD1/?actin?SH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2cNeuroD2/?actin?SH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2c*PAX6/?actin?SH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2cSATB1/?actin?SH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2cSATB2/?actin?SH-SY5Y-Cas9-72 hSH-SY5Y-sh1aSH-SY5Y-sh2c*ABCDEFGHIJournal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期283境信息处理、细胞过程、代谢、遗传信息处理等方面皆有参与（图 6AB）。通过京都基因和基因组百科全书数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）对BCL11A敲降后差异基因参与的基因组、化学和系统功能信息进行分析，结果显示，BCL11A代谢通路分为多个分支，其中在组织系统异常富集数量排名第 3的为神经系统异常（图 6C）。在生物学功能中，BCL11A与免疫系统、内分泌系统以及神经系统高度相关，KEGG疾病富集柱状图分析结果显示，BCL11A在神经系统疾病有高度富集（图 6D）。RNA测 序 结 果 显 示，SH-SY5Y-sh细 胞 株 组 差异表达基因共 824个差异有统计学意义（P0.05），其中有 649个基因上调，175个基因下调；与神经发育异常相关的差异表达基因有两个，分别是下调基 因GRM7与 上 调 基 因GRIN1，都 是ID风 险 基 因（图 6E）。GRM7是一种抑制性异源三聚体G蛋白偶联受体，它通过河马信号通路影响脑发育，可调节哺乳动物中枢神经系统突触前末端的神经递质释放和突触可塑性，为神经发育障碍风险基因20。GRIN1基因突变可影响NMDA受体的生理功能，引起神经元功能异常，最终导致大脑到肠道的各种神经、精神症状21。GO biological process富集气泡图(shBCL11A/ctrl)extracellular matrix organizationpositive regulation of gene expressloncytokine-mediated signaling pathwayimmune responsecellular protein metabolic processinfammatory responsepositive regulation of cell proliferatio.defense response to viruscell adhesionimmune system processcellular response to lipopolysaccharidepositive regulation of inflammatory resp.positive regulation of NIKNF-KappaB sig.response to virusresponse to mechanical stimuluspositive regulation of chemokine product.regulation of blood pressureinnate immune responsetype I interferon signaling pathwayinterferon-gamma-mediated signaling path.0.000 000.000 050.000 100.000 150.000 200.000 25QvalueGene Number1225375062Rich Ratio00.050.100.150.200.25KEGG_ pathway 分类(shBCL11A/ctrl)human diseasesorganismal systemsenvironmental information processingcellular processesmetabolismgenetic information processing050100150200Numberovarian cancersmall cell lung cancerpituitary adenomasthyroid cancerod absence epilepsyfebrile selzurescowden syndromeeating disordersential thrombocytosisPI3K-delta syndromemall round cell tumormyelofibrosisCLAPO syndromeary malformation sy.overgrowth,vascul.lefect,developmentaleptic encephalopathyensitvity with anhld.rder with movemen.neuroblastoma?log10(Qvalue)?log10(Qvalue)term candidate gene numterm candidate gene num0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0KEGG.pathway?(shBCL11A/ctrl)?0 20 40 60 80 100 120 140 160BCDEACell growth and deathCellular community-eukaryotesTransport and catabolismCell motilitySignal transductionSlgnallng molecules and InteractlonMembrane transportFolding,sorting and degradationReplication and repairTranslatlonCancer:overviewInfectious disease:viralInfectious disease:bacterialCardlovascular dlseaseEndocrine and metabolic diseaseInfectious disease:parasiticCancer:specific typesNeurodegeneratlve dlseaseImmune diseaseDrug resistance:antineoplasticSubstance dependenceAmino acid metabolismLipid metabolismGlycan biosynthesis and metabolismGlobal and overview mapsCarbohydrate metabolismMetabolism of cofactors and vitaminsMetabolism of other amino acidsNucleotide metabolismEnergy metabolismXenobiotics biodegracation and metabolismBiosynthesis of other secondary metabolitesImmune systemEndocrine systemNervous systemDigestive systemDevelopment and regenerationCirculatory systemEnvlronmental adaptatlonSensory systemExcretory systemAgingJournal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期2842.7BCL11A 敲降后神经元中 GRM7 启动子染色质富集情况为探索神经细胞中BCL11A的上游差异表达基因GRM7的启动子染色质活性，课题组针对GRM7的启动子进行了ChIP-qPCR实验，结果显示，在SH-SY5Y-sh 细胞中，ID基因GRM7启动子位点的转录活性标志pPol（抗Phospho-Rpb1 CTD）以及染色质活性修饰H3K9ac（抗H3K9ac）的富集都明显降低；其中，mRNA水平和蛋白表达水平下调效果明显的SH-SY5Y-sh1a、SH-SY5Y-sh2c细胞中pPol的富集度下调 95以上（P0.001），较IgG下调 92以上（P0.001）。GRM7启动子染色质活性修饰H3K9ac的富集度降低 50以上（P0.001），SH-SY5Y-sh1a细 胞 中H3K9ac的 富 集较对照组降低约 25（P0.01），SH-SY5Y-sh2c细胞中H3K9ac的富集较对照组降低约 90（P0.001）。以上结果表明，GRM7的启动子染色质活性及染色质修饰活性在BCL11A敲降后明显降低，且在SH-SY5Y-sh2c细胞中富集度降低明显，提示神经发育异常相关基因GRM7可能受到BCL11A的正向调控（图 7）。350300250200150100500?50?12?10?8?6?4?2 0 2 4 6 8 10 12log2(shBCL11A/ctrl)GRM7GRIN1Upno-DEGSDownovarian cancersmall cell lung cancerpituitary adenomasthyroid cancerod absence epilepsyfebrile selzurescowden syndromeeating disordersential thrombocytosisPI3K-delta syndromemall round cell tumormyelofibrosisCLAPO syndromeary malformation sy.overgrowth,vascul.lefect,developmentaleptic encephalopathyensitvity with anhld.rder with movemen.neuroblastoma?log10(Qvalue)?log10(Qvalue)term candidate gene numterm candidate gene num0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0KEGG.pathway?(shBCL11A/ctrl)?0 20 40 60 80 100 120 140 160BCDE图 6BCL11A参与的重要生物学过程及差异表达基因注：A：BCL11A富集生物学过程中的差异基因GO分析，X轴