进口萨福克冷冻胚胎移植及受体同期发情技术研究.pdf

2023 05畜牧兽医XUMUSHOUYI摘要：为了丰富我国绵羊遗传资源，开展绵羊品种繁育和新品系培育工作，从澳大利亚引进纯种萨福克胚胎331 枚。并对进口冷冻胚胎的质量、受体处理、技术员操作等因素对胚胎移植妊娠率的影响进行了应用研究。随机将受体羊分为 4组，在相同的环境、饲养和管理条件下，采用舍饲加放牧的饲养模式开展相应的应用研究。结果表明，4 组胚胎中 A 级胚胎占 45%47%，B 级胚胎占 35%36%，C 级胚胎占 17%19%；4 组受体羊同期发情移植率分别为 88.10%，82.83%，88.42%和 83.49%；移植受胎率分别为 58.10%，73.17%，48.81%和 41.76%，平均受胎率为55.46%。从以上实验数据可以看出，在相同的饲养环境、胚胎质量、受体状态的条件下，技术人员的操作水平对受胎率产生极大的影响，差异极显著。本文对羊胚胎移植中的技术环节和水平进行试验和针对性的讨论，以期对该技术的生产应用提供参考。关键词：萨福克；冷冻胚胎；移植；受体；同期发情技术胚胎移植又称为借腹怀胎，亦称为受精卵移植，是通过超数排卵技术获得优良母畜的早期胚胎（囊胚、桑椹胚或二细胞受精卵），同时对受体母畜进行同期发情处理，使供受体母羊处于发情期的同一阶段，然后将早期胚胎移植到生理状态相同的受体母畜子宫内，使之继续发育成独立个体的生物繁殖技术应用1-2。胚胎移植技术最早出现在英国剑桥大学的Walter Heape 教授，他在1890年使比利时母兔成功生产出安哥拉仔兔，该技术引起了国际上的广泛关注3。随后，胚胎移植技术在动物繁殖中得到快速推广，特别是在绵羊、奶牛、山羊、猪、鼠等动物中快速扩繁种群以及优良种畜的跨地域、跨国际间的流通方面起到了举足轻重的作用。我国动物胚胎移植技术的研究起步较晚，在20世纪50 60年代，我国的胚胎移植技术一直处在研究开发阶段。直至20世纪70 80年代期间，胚胎移植技术才逐步在猪、马、牛、羊等物种上取得成功，并进行推广应用4-5。本文从进口胚胎移植中的影响因素开展了相关的应用研究，总结出了在相同的环境、饲养和管理条件、受体状态等因素下，技术人员的移植技术水平是影响移植成功率的重要因素，特别是受体羊子宫角在体外滞留时间，技术人员在控制子宫角的力度和方向以及子宫角钝性打孔时的出血与否等等是直接影响受体羊受胎率的关键因素。为今后一段时间内绵羊胚胎的移植提供技术借鉴。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验羊受体的选择标准为：受体羊健康、无繁殖性疾病和胎衣不下，无不良遗传或传染性疾病，母性好，泌乳量高，体型稍大，年龄2.5 5.0岁，经产羊1 2胎为宜。1.1.2试验药品孕马血清 1 000 IU/支（宁波市三生药业有限公司）；CIDR栓 50个/包，45 mg/个（北京燕瑞生物股份有限公司）；PGF2a0.2 mg/支，2 mL/支（宁波第二激素厂生产）；胚胎解冻液和胚胎保存液（美国ICP公司生产）；静松灵 10 mL/支（丹东市兽药厂）；75%酒精 500 mL/瓶（德州利兴消毒制品有限进口萨福克冷冻胚胎移植及受体同期发情技术研究*党鹏程1.2，陈祥1，熬政1，王智鹏2，刘长彬3*，倪建宏3*，卢守亮3，张振良3（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳550025；2.新疆生产建设兵团第十师一八八团；3.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所）收稿日期：20230316*基金项目：贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室开放课题（黔教合KY字（2022）370号）；兵团科技合作计划（2023AB009-01）；兵团科技创新人才计划（2020CB022）。*通讯作者：刘长彬，男，博士，研究员，主要从事动物胚胎生物技术创新研究，E-mail：；倪建宏，男，硕士，研究员，主要从事动物遗传育种与繁殖方向，E-mail：。502023 05XUMUSHOUYI畜牧兽医公司）和碘伏 500 mL/瓶（山东利尔康股份有限公司）；青霉素G粉针160万IU（江西省可大动物药业有限公司）。1.1.3试验设备恒温水浴锅4孔（上海精宏实验设备有限公司，DK-8D）；腹腔镜及其胚胎设备（Germany Wolf Laparoscopic，Henke Sass Wolf）；体式显微镜（日本尼康公司）；外科器械（上海金钟医疗器械有限公司）；B超仪（Tringa Linear Vet，意大利百胜集团荷兰公司）；羊 用 子 宫 角 打 孔 器（专 利 号：ZL2015 20272750.4）；移植针（美国ICP公司）。1.2试验方法1.2.1同期发情处理方案随机筛选400只受体母羊，“两病”检测全部为阴性，分组进行PGF2a颈部肌肉注射，剂量为1mL（0.1 mg）/只，补饲胡萝卜或亚硒酸钠维生素E灌服。7 d后阴道放置CIDR栓，记为0 d；埋置CIDR栓后13 d，撤出CIDR栓，颈部肌肉注射PMSG 330 450 IU或PGF2a0.1 mg/mL；试情公羊试情，36 48 h羊群出现发情记为0 h，记为15 d；从发情开始计算，发情后第5 d受体羊需要断食限水，补饲一定量（200 g/只）的全价精饲料；于发情后的6 d，即可进行胚胎移植技术操作。1.2.2胚胎移植技术步骤第一步，将空腹、断水和补饲精料的受体母羊，固定在手术架上，用肥皂水呈扇形打湿乳房基部前3 10 cm处羊毛，用刮毛刀将羊毛全部剃除干净。第二步，使用喷壶将剪毛部位喷洒碘酒消毒，待30 s后，使用酒精喷壶，喷洒碘酒部位进行脱碘，待30 s后，再用消毒棉球或纱布，由内向外旋转擦干剪毛（手术）部位。第三步，选择血管较少的部位，使用腹腔镜打孔器错位打孔，避免出血，通过光源探查对侧腹壁手术部位的血管分布，避开血管，使用手术刀片，切开一个切口，切口长约1.0 1.5 cm。此时，使用子宫钳夹住子宫角小弯处，轻轻拉出腹壁外，使用子宫角打孔器，选择子宫角分布的毛细血管间隙打孔，避免子宫角出血。第四步，将装好胚胎的移植针对准子宫角移植孔，插入子宫角内约2 3 cm深，迅速地将胚胎推送至子宫角小弯处，完成胚胎移植过程。第五步，将腹壁切口缝合1针，打结，缝合后在切口处涂抹土霉素软膏或喷洒碘酒进行消毒处理。刚刚移植后的受体母羊需要休息2 h后再进行适量的饮水和采食优质干草，并补饲一定量的全价精饲料以及胡萝卜等。1.2.3进口胚胎质量分级鉴定标准胚胎质量分级评定标准详见表1。表1胚胎质量分级评定标准6序号1234级别A级B级C级D级内细胞团内细胞团呈均匀对称球形，单个卵裂球的大小、颜色、密度一致，发育阶段与预期的发育阶段一致，不规则的细胞相对较少，透明带必须是光滑的而不应该是凹陷或平坦的，至少有85%以上的细胞质是完整的、具有活性的细胞团。内细胞团的大小、性状以及单个细胞的颜色和密度存在一定的不规则。至少50%以上的细胞结构是完好的、具有活性的细胞团。内细胞团的大小、形态以及单个细胞的颜色、密度存在严重不规则，至少25%以上的细胞结构是完好的、具有活性的细胞团。死亡或退化。退化的胚胎、卵母细胞、细胞胚胎等，内细胞团没有活力。2结果与分析2.1进口萨福克冷冻胚胎质量鉴定依据胚胎质量鉴定标准，A、B级胚胎在移植后，因胚胎质量不同，受体羊子宫所产生的信号也不同，因此受胎率明显高于C级胚胎。所以在生产胚胎时，除了考虑激素类药品的品质和剂量、处理程序、膘情和品种等，还应考虑供体的饲料是否均衡和供应充足7。由表2可知，A级胚胎平均占比为45%47%，B级胚胎平均占比为35%36%，C级胚胎平均占比为13%16%。基本达到了胚胎商业化利用的胚胎质量水平。C级胚胎严格来说是不能作为商业化胚胎出口的，胚胎质量主要体现在透明带裂痕或破损、内细胞团松散等，C级胚胎的产生可能与胚胎冷冻后的冷冻损伤有关。表2进口胚胎不同级别占比组别1234A级（枚）35373843A级占比（%）47.30a45.12a45.24a47.25aB级（枚）26303033B级占比（%）35.17a36.59a35.71a36.26aC级（枚）13151615C级占比（%）17.57a18.29a19.05a17.58a注：同列上标字母相同表示差异不显著（P 0.05）512023 05畜牧兽医XUMUSHOUYI2.2同期发情技术分组试验结果将425只相同品种的受体母羊随机分为4组，采用相同的同期发情处理方法，检验同期发情技术的处理效果。从表3中可以看出，受体羊发情率平均为88%95%，移植率为82%88%。受体羊使用率达到同期发情处理的结果，各组之间差异不显著（P 0.05）。表3受体羊同期发情技术处理效果组别1234处理数（只）95110100120发情数（只）849995109发情率（%）88.4290.0095.0090.83移植数（只）74828491移植率（%）88.10a82.83a88.42a83.49a处理成本（元）36363636注：同列字母相同表示差异不显著（P 0.05）2.3进口萨福克冷冻胚胎移植效果为了提高进口萨福克肉羊冷冻胚胎移植的受胎率，对胚胎等级进来了严格分级，将C级胚胎与A、B级胚胎搭配移植。同时革新子宫角打孔技术和减少子宫角接触性刺激等措施，大大提高了冷冻胚胎的移植受胎率。从表4可以看出，四组的受胎率分别为58.10%、73.17%、48.81%和41.76%，1、3、4组受胎率与2组相比，差异极显著（P 0.01）；1组与2、4组相比，受胎率差异显著（P 0.05）。平均受胎率为55.46%。表4进口冷冻萨福克肉羊胚胎移植数及受胎率组别1234平均受体数（只）819490101移植数（只）74828491受孕数（只）43604138受孕率（%）58.10a73.17Ab48.81b41.76b55.46注：同一列上标字母相同表示差异不显著（P 0.05），同一列上标字母不同表示差异显著（P 0.05），同一列上标字母不同大小写表示差异极显著（P 0.01）3讨论与结论进口萨福克肉羊冷冻胚胎的质量是影响受胎率的关键因素之一，在相同的饲养、管理、移植技术和移植的胚胎数量等条件下，A级胚胎的受胎率明显高于B级和C级胚胎7-8。鲜胚、双胚和A级胚胎的受胎率要高于冻胚、单胚和B/C级胚胎，这是胚胎移植行业的普遍共识。再者，技术人员的胚胎移植技术熟练程度，特别是移植手法的轻重和子宫角打孔时的出血与否，也是影响受胎率的关键因素之一，这与S.Papadopoulos的研究结果一致9-11。研究表明，在胚胎的质量方面，随着胚胎质量的下降如A级降到B级再降到C级，所表现出来的受胎率也呈下降趋势，说明了胚胎的质量越高，越能够快速适应受体羊的子宫内环境，并快速的孵化与继续发育，最终完成胚胎着床这一生理过程，这与F.Baria的公开报道一致12-13。受体羊所处的发情阶段也会对胚胎移植的受胎率产生一定的影响。受体羊在同期发情处理后相对集中在撤栓后的36 h左右出现发情，通过试情公羊进行试情，并用不同的标记符号进行相应的标注，严格受体羊的发情时间，基本确定受体羊的排卵时间。在移植过程中，需要解冻2 3管冷冻胚胎，在实体显微镜下对解冻后的胚胎进行鉴定，并对胚胎进行严格分级，确定胚胎的胎龄。将胚胎装移植针后，移植给与胚胎相对应子宫内环境相同的受体羊，以保障受体羊能够获得较高的受胎率14-16。胚胎移植是一个系统工程，包括了供体羊筛选、供体羊处理程序、供体羊品种、FSH总注射剂量、FSH批次和品牌、PMSG或PGF2a批次与用量和品牌、供体羊激素组合（海绵栓+PMSG或PGF2a+LH、CIDR+PMSG或PGF2a+LH）、受体羊筛选、受体羊品种、受体羊处理程序、受体羊激素组合（海绵栓+PMSG或PGF2a、CIDR+PMSG或PGF2a）、供体羊激素的注射部位、超排和移植的季节、气候变化、营养状况、饲养方式（放牧和圈养）、技术水平等17个关键技术环节，任何一个技术环节考虑不充分的话，都可能会影响到胚胎移植的最终受胎率。参考文献1乌云格日乐，阿木古楞，红莲，等.不同年龄、不同剂量对杜泊羊胚胎移植的影响研究J.农业开发与装备，2018（4）：103-104.2石国庆.动物胚胎移植与胚胎分割技术研究进展J.新疆农业科学，2001（1）：80-84.3杨静.中系安哥拉兔特征特性及推广利用J.特种经济动522023 05XUMUSHOUYI畜牧兽医植物，2016，19（8）：2-3.4江秀芳.山羊胚胎移植技术及在农村的推广应用J.黑龙江动物繁殖，2014，22（1）：49-50.5刘长彬，倪建宏，卢守亮，等.萨福克肉羊MOET技术优化及应用J.新疆农垦科技，2020（11）：26-28.6刘丑生.牛胚胎发育阶段和质量等级的评定体系J.中国牛业科学，2006，32（增刊）：240-241.7杨昇，冯建忠，张金龙，等.影响羊胚胎移植妊娠率的因素分析J.中国畜牧杂志，2005，41（7）：41-43.8巴贵.藏西北紫绒山羊首次腹腔镜胚胎移植试验及分析J.畜牧兽医杂志，2022，41（4）：15-18.9刘长彬，倪建宏，卢守亮，等.萨福克肉羊MOET技术优化及应用J.新疆农垦科技，2020（11）：26-28.10郭延华，刘长彬，万鹏程，等.肉羊胚胎移植成活的影响因素实例分析J.新疆农业科学，2017，54（11）：2138-2145.11S.Papadopoulos，D.Rizos，P.Duffy，et al.Embryo survivaland recipient pregnancy rates after transfer of fresh or vitrified，in vivo or in vitro produced ovine blastocystsJ.Animal Reproduction Science，2002（74）：35-44.12F.Baria，M.Khalidb，W.Haresigna.Factors affecting thesurvival of sheep embryos after transfer within a MOETprogramJ.Theriogenology，2003（59）：1265-1275.13Breuel K F，Baker R D，Buther R L.et al.The effects ofbreed，age of donor and dosage of foll icle-stimulating hormoneon the superovulatory response of beef-cowsJ.Theriogenology，1991（36）：241-255.14Carey Satterfield M，Spencer T 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