无菌检查方法验证方案.doc

安徽捷众生物化学有限公司

无菌检查方法（薄膜过滤法）
验证方案

文件编号：QY·TS·05·007-00

批准日期： 年 月 日 　　　 　　　实施日期 年 月 日

安徽捷众生物化学有限公司
文 件 审 批 表
文件名称：无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案
文件编号： QY·TS·05·007-00
文件提出部门：质量控制部/QC
文件起草目的： 新订 修订□
文件起草人（签字）： 　　完成日期： 年 月 日
文件会审部门
文件审核人（签字）
审核日期
质量管理部

年 月 日
质量保证部/QA

年 月 日
质量控制部/QC

年 月 日
生产部

年 月 日
工程(设备)部

年 月 日
文件批准人（签字）： 批准日期 年 月 日
文件实施日期： 年 月 日 起 实 施
文件编制依据：
1、 卫生部：《药品生产质量管理规范》2010年修订版和修订附录
2、 《中华人民共和国药典》（二部）2010年版附录。
文件复制人： 校对人：
复制份数： 复制日期： 年 月 日
颁发部门： 质量管理部
分发单位：
备注：

安徽捷众生物化学有限公司

无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案

目 录
1．验证目的
2. 验证频次
3. 验证操作内容与要求
3.1. 验证操作试验
3.2 试验菌要求
3.3.验证方法步骤
3.4. 验证准备
3.5验证试验操作
4．验证结果评价分析
5．附件

安徽捷众生物化学有限公司
无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案
编号
QY·TS·05·007-00
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共 11 页
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质量管理部
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批准日期
年 月 日
生效日期
年 月 日
分发部门
相关部门
1．验证目的
确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
2. 验证频次
2.1. 建立药品的无菌检查法时
2.2. 修订检验方法时
2.3. 供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时
3. 验证操作内容与要求：
3.1. 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定要求进行验证操作试验：
3.1.1. 对每一试验菌应逐一进行验证。
3.1.2. 硫乙醇酸盐流体培养基—金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌。
3.1.3. 改良马丁琼脂培养基—白色念珠菌、黑曲霉。
3.2 试验菌要求：
3.2.1验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
3.2.2验证试验可在供试品的无菌检查之前或与供试品的无菌检查同时进行。当同时进行时，若验证试验失败，则供试品的无菌检查结果是不成立的
3.3.验证方法步骤：
3.3.1验证试验的操作计划 用3个不同批号产品按照无菌检查方法（薄膜过滤法）进行平行试验，通过计算回收率来判断无菌检查方法（薄膜过滤法）是否对产品有影响。
3.3.2试验结果可接受标准 用无菌标准评价方法“0.9％氯化钠注射液(三层共挤膜袋)的无菌检查”对检品中无菌检查试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。
3.4. 验证准备：准备验证所需的供试品、培养基、试药试剂、仪器设备和菌种。
3.4.1. 培养基
硫乙醇酸盐流体培养基；改良马丁琼脂培养基；营养琼脂培养基；血琼脂培养基
备注：
3.4.1.1 培养基应注明来源；如采用市售干粉培养基，应按说明配制。
3.4.1.2 配制后的培养基应按照中国药典附录“无菌检查法”中“培养基的适用性检查”项下检验无菌性和灵敏度。
3.4.2 仪器设备
3.4.2.1. 净化工作台
3.4.2.2. 生物洁净安全柜
3.4.2.3. 集菌仪
3.4.2.4. 生化培养箱
3.4.2.5. 霉菌培养箱
3.4.2.6. 高温试验箱
3.4.2.7. 台式灭菌器
3.4.2.8. 医药品冷藏柜
3.4.2.9. 微波炉
3.4.2.10.　器具 无菌培养皿：（直径90mm） 无菌移液管（5ml）等
备注：以上仪器设备需要确认与验证的均应已按要求验证。
3.4.3. 菌种
3.4.3.1. 金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕
3.4.3.2. 枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501〕
3.4.3.3. 白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕
3.4.3.4. 黑曲霉〔CMCC（F）98003〕
3.4.3.5. 铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕
3.4.3.6. 生孢梭菌〔CMCC（B）64941〕
3.4.4操作环境：
3.4.4.1操作间应该安装空气除菌过滤层流装置。
3.4.4.2环境洁净度不应低于C级，净化工作台洁净度为A级。
3.4.4.3操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于10pa。
3.4.5试验样品： 0.9％氯化钠注射液(三层共挤膜袋)　　　规格：250ml
①　批号： 　 　　生产日期： 　 　　
②　批号： 　　 生产日期： 　 　　
③　批号： 　　　 生产日期： 　 　　
3.4.6稀释液和试剂： PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 无菌十四烷酸异丙酯
3.4.7验证用微生物名称及其编号
3.4.7.1实验菌株的来源：
序号
菌株名称
菌株代码及编号
内控编号
1
金黄色葡萄球菌
〔CMCC（B）26003〕

2
铜绿假单胞菌
〔CMCC（B）10104〕

3
枯草芽孢杆菌
〔CMCC（B）63501〕

4
白色念珠菌
〔CMCC（F）98001〕

5
生孢梭菌
〔CMCC（B）64941〕

6
黑曲霉
〔CMCC（F）98003〕

3.4.7.2编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成
3.4.8培养基
名称
生产商
培养基批号
配制日期
有效期
营养琼脂
培养基

改良马丁琼
脂培养基

3.5验证试验操作：
3.5.1试验菌的制备和稀释：
3.5.1.1将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至良马丁流体培养基中，23～28℃下培养24～48小时。
3.5.1.2将黑曲霉接种至改良马丁琼脂培养基中，在23～28℃下培养5～7天小时。
3.5.1.3将上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌落数为50～100cfu的菌悬液。
3.5.2用不同类别的微生物考察供试液及检验程序的抑菌性，将试验分为4组
3.5.2.1样品试验组：
A准确取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。
B然后加入45℃的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。
C 用移液管准确吸取1.0ml供试液至平皿中；并在每个平皿中接种50～100cfu试验菌，立即倾注营养琼脂培养基，每个试验菌平行接种2个平皿，按照 平皿法测定其菌数。
3.5.2.2菌液组 ：按中国药典附录“无菌检查法”中“灵敏度检查”项下的菌液制备
A 在平皿中注入1ml的菌液立即倾注营养琼脂培养基，以测定所加的菌数。
B供试品对照组 取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品的本底菌数。
C 稀释剂对照组 取相应稀释液1ml加入试验菌，使最终菌浓度为每ml供试液含50～100cfu试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌落数。
D 对于同一份培养物，采用相同的测定方法，不同的试验人员的测定结果可能有很大的误差。所以在操作过程中，应特别注意能造成误差的各个环节。
E 当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体分散于稀释液中。
F为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍系列稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。
G液体培养物直接稀释法较比浊法造成误差小，基本保证每次菌数能控制在要求的范围内。
I 最终制得的菌悬液应为小于100CFU/ml。
J金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌采用营养琼脂培养基；生孢梭菌采用血琼脂培养基；白色念珠菌、黑曲霉采用改良马丁琼脂培养基。
3.5.3培养 将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在30～50℃下培养48小时将白色念珠菌、黑曲霉在23～28℃下培养72小时，点计菌落数。并将结果记录于附件1。
3.5.4试验结果
3.5.4.1稀释剂对照组菌的回收率
接入菌种
0.9％氯化钠注射液
批号
菌落计数（cfu/皿）
回收率
稀释剂对照组
菌液组
金黄色葡萄球

平均值

铜绿假单胞菌

平均值

枯草芽孢杆菌

平均值

白色念珠菌

平均值

生孢梭菌

平均值

黑曲霉

平均值

表中：回收率=稀释剂对照组的平均菌落数÷菌液组的平均菌落数×100%。
3.5.4.2试验组的菌的回收率
接入菌种
0.9％氯化钠注射液批号
菌落计数（cfu/皿）
回收率
试验组
供试品对照组
金黄色葡萄球

平均值

铜绿假单胞菌

平均值

枯草芽孢杆菌

平均值

白色念珠菌

平均值

生孢梭菌

平均值

黑曲霉

平均值

表中：回收率=（试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数的值）÷菌液组的平均菌落数×100%。
4．验证结果评价分析
4.1对验证结果的评审应包括：
（1） 验证试验是否有遗漏？
（2） 验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准？
（3） 验证记录是否完整？
（4） 验证试验结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明合理？是否需进一　　　　　　
步补充试验？
4.5. 结果判断 ：?
4.5.1..供试品按无菌检查法进行检查，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，结果判断验证无效，并重新进行方法验证。
4.5.2如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，可采用增加冲洗量，增加培养基用量，使用中和剂或灭菌剂；更换滤膜品种等方法，并重新进行方法验证。
5．附件
附件1
产品试验组的微生物生长检查记录：
菌种名称
产品试验组计数结果（cfu/皿）
平均值
金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

生孢梭菌

黑曲霉

供试品对照组的微生物生长检查记录
菌种名称
供试品对照组计数结果（cfu/皿）
平均值
金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

生孢梭菌

黑曲霉

稀释剂照组的微生物生长检查记录
菌种名称
阳性对照计数结果（cfu/皿）
平均值
金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

生孢梭菌

黑曲霉

菌液组
菌种名称
阳性对照计数结果（cfu/皿）
平均值
金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

生孢梭菌

黑曲霉

测试人/测试日期： 复核人/复核日期：

附件2
安徽捷众生物化学有限公司
质量控制检测仪器(设备)
验证结果评价表
验证名称
无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案
编号
VF-PR-17-A
验证
结果

评价
及建议

确

认

验证小组： 年 月 日

附件3
安徽捷众生物化学有限公司

质量控制检测仪器(设备)
验证报告

年 月 日至 年 月 日，验证小组根据批准的编号为“VF-PR-17-A”的无菌检查方法（薄膜过滤法）验证文件对无菌检查方法（薄膜过滤法）检查法进行了相关的一系列验证工作，达到了预期效果，滋将有关事项说明如下：
1． 验证方案在实施过程中未做修改；
2． 验证方案各项性能指标在验证中未作变动，误差在允许范围内；
3． 验证过程中结果符合规定要求，记录完整属实；
4． 验证结果符合设计要求和GMP原则要求，可以投入使用。

以上情况，请验证委员会审批！

　验证小组：
　 年 月 日

附件4
安徽捷众生物化学有限公司

质量控制检测仪器(设备)
验证试验报告审批表
验证名称
无菌检查方法（薄膜过滤法）
编号
VF-PR-17-A
验证内容

审
阅
会
签
质
量
管
理
部
审核人： 年 月 日
验证委员会意见：

批准人： 年 月 日