发育生物学实验教案.doc

发育生物学实验教案实验一 模式生物蛙、海胆胚胎发育各阶段切片观察一、实验目的了解模式生物发育过程中的形态变化。二、实验原理在多种动物中，胚胎发育经历受精、桑椹胚、囊胚、原肠时期、神经时期，不同时期具有不同的特点，在发育中其形态和构造经历明显的阶段性变化。三、试剂与材料1. 实验试剂香柏油、显微镜2. 实验材料模式生物切片、装片（蛙、海胆）四、实验步骤观察模式生物发育各时期的胚胎形状变化。五、实验作业记录形态学变化。实验二 模式生物鲫鱼、鸡胚胎发育各阶段切片观察一、实验目的了解模式生物发育过程中的形态变化。二、实验原理在多种动物中，胚胎发育经历受精、桑椹胚、囊胚、原肠时期、神经时期，不同时期具有不同的特点，在发育中其形态和构造经历明显的阶段性变化。三、试剂与材料1. 实验试剂香柏油、显微镜2. 实验材料模式生物切片、装片（鲫鱼、鸡）四、实验步骤观察模式生物发育各时期的胚胎形状变化。五、实验作业记录形态学变化。实验三 两栖类变态过程的观察一、实验目的了解两栖类动物变态过程中的形态变化。二、实验原理在多种动物中，胚胎发育经历一个幼虫期，幼虫具有与成体非常不同的特点，在发育中其形态和构造经历明显的阶段性变化，其中有一些器官退化消失，有些得到改造，有些新生出来，从而结束幼虫期，建成成体结构，这种现象统称为变态。三、试剂与材料1. 实验试剂何尔夫列他溶液（氧化钠0.35g，氯化钾0.005g，二氯化钙0.01g，碳酸氢钠0.02g，蒸馏水100mL）2. 实验材料蛙的蝌蚪四、实验步骤人工饲养青蛙，观察其变态过程中的形态变化。五、实验作业记录蛙变态过程中的形态学变化。 附 蛙的饲养方法卵和蝌蚪的培养最好用洁净的自来水，并加上稀释5-6倍的何尔夫列他液（氧化钠0.35g，氯化钾0.005g，二氯化钙0.01g，碳酸氢钠0.02g，蒸馏水100mL），这样可以增加胚胎和蝌蚪发育所必需的钠、钙、钾离子。培养水要多而清洁，否则会因缺氧而致死。蝌蚪主要吃植物性饲料，如水藻等。煮过的菠菜和莴苣是最适宜的食物，但投喂时不宜煮得太熟，并注意除去纤维。初次投食量要小，以后可不断增加。每天定时定量投喂，不宜过多，以防残渣腐败，造成水体污染。若用缸、盆培养，或水体较小，一般3-5d换一次水较好。当蝌蚪发育成带有短尾的幼体开始用肺呼吸时，若用池塘培养，水中必须放些水草，或小木条，以供其登陆用。若为缸、盆培养，水里可放一些泡沫塑料。成体主要吃昆虫之类的动物性食物，以直翅目、鞘翅目、膜翅目、蜻蜓目为最多，其次为双翅目、脉翅目、半翅目等昆虫。有时也食蛛形动物、蚯蚓，甚至也以谷粒、鱼苗或蝌蚪及小蛙为食。实验四 鸟类胚胎发育的观察一、实验目的熟悉鸟类胚胎发育的过程。二、实验原理鸟类胚胎发育是典型的体外发育，利用人工孵化的家禽，可以方便观察其发育过程。鸡胚胎发育可分为两个阶段：成蛋阶段和成雏阶段。（1）胚胎在卵形成过程中的发育即母体内的发育，也即是成蛋阶段的发育。这个阶段的发育过程是，受精卵+卵裂+囊胚期+原肠期。当胚胎发育到原肠期时，已分化形成上胚层和下胚层，从外观上看形如一个圆盘状体即为胚盘，当卵排出体外，因温度下降，胚胎生长发育随即停止。（2）胚胎在孵化过程中的发育卵排出体外后，保存在18以下的环境中，胚胎发育基本处于静止状态。当人孵后，胚胎即开始发育。胚胎在孵化过程中发育的时期称孵化期。鸡的孵化期为21天。种蛋人孵后，胚胎在原肠期形成的同时，上胚层像个碟状圆盘，在其末端，细胞不断地向中线集中，形成一条细胞带，称原条。原条细胞通过原沟的底部逐渐转人上胚层与下胚层之间，并分别向两侧扩展，这些迁移至上下胚层之间的细胞称为中胚层。原条细胞也逐渐转人上胚层与内胚层之间，并分别向前伸展，伸展的结构称为头突，后发育成脊索。脊索是胚胎期的纵轴支持器官，最终为脊柱所代替，随着胚胎的不断发育，由外、中、内三个胚层逐渐形成各种腺体、器官、骨骼、肌肉、皮肤、羽毛和喙，最后形成新的机体雏鸡。三、试剂与材料鸡的种蛋四、实验步骤1. 观察比较种蛋（受精）与非种蛋（未受精）内部结构的差异。2. 观看教学片，熟悉鸡的胚胎发育过程。2. 人工孵化种蛋，记录鸡的孵化进程及特征。五、实验作业拍照记录鸡孵化进程中的特征变化。附 1. 鸡胚发育进程及特征1胚龄：蛋黄表面有一颗颜色稍深，四周稍亮的圆点，俗称“鱼眼珠”或白光珠。2胚龄：可看到卵黄囊血管区，其形状很象樱桃形，故俗称为为“樱桃珠”。3胚龄：卵黄囊血管的形状象静止的蚊子，俗称“蚊虫珠”。卵黄颜色稍深的下部似月牙状，俗称“月牙”。4胚龄：蛋转动时，卵黄不易跟随着转动，俗称为“钉壳”。5胚龄：明显看到黑色的眼点，谷称“起珠”、“单珠”、“起眼”（若为5天整，还可见到些羊水）。6胚龄：胚胎形似“电话筒”，一端是头部，另一端为弯增大的躯干部，俗称“双珠”。可以看到羊毛。7胚龄：白茫茫的羊水增多，胚胎活动尚不强，胚胎在羊水中不易看清，似沉在羊水中，俗称“沉”。正面已布满扩大的卵黄和血管。8胚龄：胚胎较易看到，象在羊水中浮游一样，俗称“浮”。从背面看，卵黄已扩大到背面，蛋转动时二边卵黄不易晃动，俗称为“边口发硬”。9胚龄：蛋转动时，二边卵黄容易晃动，背面尿囊血管迅速伸展越出卵黄，故俗称为“发边”。10胚龄：尿囊血管继续伸展，在蛋的小头合拢，整个蛋除气室外都布满了血管，俗称为“合拢”、“长足”。11胚龄：血管开始加粗，血管颜色开始加深，解剖背部出现绒毛，腺胃明显可辨。12胚龄：血管加粗、颜色逐渐加深。解剖身躯覆盖绒毛。13胚龄：主要观察小头发亮的部分随着胚龄的增长而逐日缩小。头部和身体大部分覆盖绒毛，跖、趾出现角质鳞片原基。14胚龄：小头发亮的部分随着胚龄增长而逐日缩小，蛋内黑影部分随着胚龄增长而加大，胚胎全身覆盖绒毛，头向气室，胚胎开始改变横着的位置，逐渐与蛋长轴平行。15胚龄：蛋内黑影部分增大。解剖观察，翅已完全成形，跖、趾的鳞片开始形成，眼脸闭合。体内外的器官大体上部形成了。16胚龄：黑影继续燕大，解剖冠和肉髯明显，绝大部分蛋自己进入羊膜腔。17胚龄：以小头对准光源，再看不到发亮的部分，俗称“封门”。躯干增大，脚、翅、颈变大、眼、头日益显小，两腿紧抢头部。喙向气室。18胚龄：气室向一方倾斜，这是胚胎转身的缘故，俗称为“斜口”、“转身”。解剖头弯曲在右翼下，眼开始睁开。19胚龄：喙进气室，开始呼吸，颈、翅突入气室，头埋右翼下，两腿弯曲朝头部，呈抢头姿势，以便于破壳时挣扎。雏胚开始啄壳，可闻雏鸣叫。照蛋时，可见气室有翅膀、喙、颈部的黑影闪动，俗称“闪毛”。20胚龄：起初是胚胎喙部穿破壳膜，伸入气室内，称为“起嘴”；接着开始啄壳，称“见嘌”、“啄壳”。20.5-21胚龄：出壳。2. 鸡的人工孵化鸡属鸟类，鸟类与哺乳动物胚胎发育不同，受精卵（种蛋）排出母体后完全依赖外界环境条件继续发育。第1-4天为内部器官发育阶段；5-14天为外部器官形成阶段；15-19天为胚胎生长阶段；20-21天为出壳阶段。在整个孵化过程中，温度，湿度，通风换气与翻蛋等外界条件将是保证胚胎正常发育，并使孵化获得成功的关键因素。（1）温度：温度是孵化过程的首要条件，发育中的鸡胚对温度最敏感，只有在适宜的温度下，才能保证鸡胚的正常生长发育和物质代谢。所以正确地掌握孵化温度是提高孵化率的关键。在1-18天中孵化的最适温度是37.5C-38.6C；19-21天则应稍低于此温度是36.1C-37.5C。如果温度过高胚胎发育迅速，孵化期缩短，胚胎死亡增加。温度过低则会延长种蛋的孵化时间，同时胚胎发育迟缓并带来死亡。（2）湿度： 水是温度的良导体，空气中的湿度对鸡胚胎发育有很大作用。一般要求1-18天相对湿度40%-60%；19-21天相对湿度65%-75%。若湿度过高会妨碍蛋内水分蒸发，使胚胎发育所产生的大量代谢水不能及时排出，严重时可导致胚胎畸形。若湿度过低，将加速蛋内水分蒸发，造成失水过多，阻碍代谢废物的排出及所需氧气的摄入。易引起胚胎和壳膜粘连。（3）通风换气： 通风换气的主要目的是帮助胚蛋中的胚胎与外界进行气体交换和热能交换，同时调节机内的温度。胚胎发育过程中需要不断的吸入氧气，排出二氧化碳气和水分。孵化初期，胚胎需要少量氧气可通过酶的作用从蛋黄中获得，而后利用气室的空气，再后则利用尿囊循环与蛋壳上的气孔同外界进行气体交换，19天后胚胎开始用肺呼吸。随着胚龄的增加，胚胎的气体交换量也不断增加。因此除胚胎发育初期外，胚胎的气体交换都是由通风换气解决。通风换气还与温度、湿度有密切的关系。通风良好时，空气能充分流通还能与外界不断的进行热能交换。温度、相对湿度都可保证。（4）翻蛋： 翻蛋的主要作用是改变胚胎方位，促进羊膜运动，防止胚胎、蛋黄、蛋白与蛋壳之间粘连。胚蛋放置位置必须适当，在1-18天进行定时翻蛋，每2小时翻蛋一次，翻蛋角度以90度为宜。种蛋孵化到18天时，将种蛋移到出雏盘上叫落盘。这时胚胎发育完成，在20-21天时开始出壳。出壳时胚胎已经完全长成雏鸡。这时雏鸡的头位于气室中（即鸡蛋的大头部分），健壮的雏鸡先把蛋壳啄开一个小孔，然后慢慢的将小孔向两侧扩大，直至破壳到一半以上时，雏鸡的头便可脱壳而出，而后身体也逐渐自行挣脱出来。1胚龄 2胚龄 3胚龄4胚龄 5胚龄 6胚龄7胚龄 8胚龄 9胚龄10胚龄 11胚龄 12胚龄13胚龄 14胚龄 15胚龄16胚龄 17胚龄 18胚龄19胚龄 20胚龄 20.5胚龄替补实验 实验五 精子形态观察及体外获能实验一、实验目的1. 熟悉哺乳类精子的形态结构。2. 了解精子体外获能的方法。二、实验原理哺乳动物的精子离开精巢后并没有受精能力，必须要经过成熟和获能才能使卵子受精。精子在附睾中成熟。成熟过程中，在附睾中多种物质的作用下，精子质膜的脂类、糖蛋白、唾液酸、吸收抗原、表面ATP酶等许多成分发生变化，负电荷增加，与凝集素的结合力也发生改变。精子射出后，经阴道和子宫到达输卵管，在壶腹部与卵子结合，完成受精。张明觉、Austin 1951年发现兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受精，必须在生殖道中停留一段时间后才具备受精能力，这一现象称为精子的获能。后来研究发现，精子在体外也能完成获能，卵泡液、输卵管分泌物、血清、房水等多种液体都可使精子获能，pH、Ca2+浓度等环境条件对获能也有影响。精子在获能过程中发生一系列的形态及生理生化的变化，呼吸明显加强，运动形态和速度也发生很大变化，由直线前进变为曲线运动。体外获能一般分为两步：一是精子的洗涤，经1次或多次离心后除去杂质、死精子、低活力精子、冻精保护液及稀释液等；二是精子的获能处理，主要是使用高离子强度液（His）、钙离子载体、肝素等，以促进钙离子进入精子顶体并刺激精子内部pH升高，从而诱发精子获能。三、试剂与材料1. 实验试剂IVF液（NaCl 5.803g/L，KCl 0.201g/L，NaHCO3 2.106g/L，CaCl22H2O 0.264g/L，丙酮酸钠0.055g/L，60%乳酸钠3.5mL，葡萄糖1.000g/L，青霉素G钾或钠盐0.063g/L，硫酸链霉素0.050g/L，酚红0.010g/L，Na2HPO412H2O 0.056g/L，MgCl26H2O 0.102g/L），牛血清白蛋白（BSA）2. 实验材料雄性小鼠四、实验步骤1. 断颈处死雄性小鼠。2. 打开腹腔，剪取附睾尾（尽可能除去脂肪），将每个附睾尾放入已在37、5%CO2培养箱预平衡2h的2ml IVF液（加30mg/ml BSA）中。3. 将附睾尾剪成几段，用镊子轻轻挤压之，使精子挤入培养液中，去掉附睾尾。4. 吸打均匀后，1800 r/min离心5min，弃上清，以2ml IVF液重悬。5. 将精子在37、5%CO2培养箱中培养1.5h，使之获能。6. 镜检，观察获能精子的运动。五、实验作业观察比较精子在获能前后运动形态和速度的变化。实验六 植物组织培养一、实验目的了解植物细胞全能性。二、实验原理生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成完整个体所必需的全部基因。三、试剂与材料1. 实验试剂MS培养基、无菌水，升汞、酒精、次氯酸2. 实验材料银杏枝叶四、实验步骤（一) 培养基的配制 1.母液配制 母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四 类。 2.培养基的配制与分装 3.培养基的灭菌 ( 二 ) 取材、消毒与接种（1）先将剪下的枝条清洗干净，选择新鲜的花柄、嫩梢和带腋芽的茎段作为外植体，将外植体放在自来水下冲洗12h,以冲洗掉大的土壤颗粒。（2）将清洗干净的外植体移入无菌操作台进行消毒，先用75%酒精表面消毒30S，再用0.1%新洁尔灭处理15min。消毒后用无菌水冲洗45次。（3）将消毒后的外植体放入消毒过的培养皿上，在无菌条件下切成0.40.5 cm长的小段单芽，用无菌滤纸吸干水，立即接种到加有不同激素浓度的MS培养基上，每个培养基接种三个芽，并用封口膜封好。( 三 ) 外植体的培养接种后的外植体放入用75%酒精消毒后的干净的光照培养箱中，培养条件为：温度27，光照周期为光照12h/d+黑暗12h/d，培养基的pH值为5.8，进行培养与愈伤组织的诱导。全部接种工作都是在严格无菌条件下进行的 , 所以要特别认真、仔细、以防杂菌污染。 ( 四 ) 两周后观察愈伤组织的诱导并进行生根生芽诱导 五、实验作业1. 观察植物组织培养的培养物在培养中的生长情况。 2观察植物组织培养的培养物有无污染，分析原因？ 3. 以MS为例，试说明MS培养基中各成分各有何作用。实验七 植物生长调节剂对果实发育的影响一、实验目的1. 了解2,4-D、萘乙酸对无籽果实形成的诱导作用。2. 了解乙烯对果实的催熟作用。二、实验原理植物生长调节剂2,4-D、萘乙酸（NAA）等，在适当的浓度下能诱导无籽果实形成。适当浓度的乙烯利能促进果实成熟。三、试剂与材料1. 实验试剂20mg/L2,4-D（用少许1 mmol/L NaOH溶解2,4-D，再用蒸馏水定容），500mg/L NAA（用热水或少量95%乙醇溶解NAA，再用蒸馏水定容），40%乙烯利2. 实验材料盆栽番茄、辣椒幼苗，香蕉（或大蕉、柿子、芒果等）四、实验步骤1. 无籽果实的诱导形成（1）2,4-D诱导无籽果实 在番茄开花授粉前用2-3滴20mg/L 2,4-D溶液涂在花上，以水处理作对照。果实成熟时，观察果实内籽粒的有无。（2）NAA诱导无籽果实在辣椒开花初期，用2-3滴500mg/L NAA溶液滴在花朵上（或喷花），以水处理作对照。果实成熟时，检查是否有籽。2. 乙烯利对果实的催熟作用将采收后的香蕉（或大蕉、柿子、芒果等）用500mg/L乙烯利溶液浸泡5s，以蒸馏水浸泡作对照，取出果实分别放在箩筐或纸箱内，室温保存。5-10d之内，观察结果。比较果皮的颜色和果实的成熟度五、注意事项1. 用植物生长调节剂处理材料的时期一定要把握好。2. 可尝试使用不同的激素浓度，筛选出激素的最适作用浓度。六、实验作业拍照记录实验结果（包括对照）并进行分析。