分子生物学基础PPT省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

分子生物学基础分子生物学基础第二章 DNA结构、复制和修复第1页第一节第一节 染色体染色体 一、染色体概述一、染色体概述 染色体在不一样细胞周期有不一样形态表现。在细胞大部分时间分裂间期表现为染色质(chromatin)。染色质是细胞核内能够被碱性染料着色一类非定形物质。它以双链DNA为骨架，与组蛋白(hilston)、非组蛋白(non-histon)以及少许各种RNA等共同组成丝状结构。在染色质中，DNA和组蛋白组成非常稳定，非组蛋白和RNA随细胞生理状态不一样而有改变。在细胞分裂期，染色质纤丝经多级螺旋化形成一个有固定形态复杂立体结构染色体。染色体只在细胞分裂期，人们才能在光学显微镜下观察到这些结构。它们存在于细胞核，呈棒状可染色结构，故称为染色体。细胞分裂时，每条染色体都复制生成一条与母链完全一样链，形成同源染色体对。作为遗传物质，染色体含有以下特征：分子结构相对稳定；能够自我复制，使亲代、子代之间保持连续性；能够指导蛋白质合成；能够产生可遗传变异。第2页第一节第一节 染色体染色体 二、原核生物染色体 1细菌染色体形态结构 大肠杆菌染色体长为1 333m，而要装入长约2m宽1m细胞中，为此DNA必定以折叠或螺旋状态存在。有试验证实：在DNA分子进行折叠或螺旋过程中还依赖于RNA分子作用。如300m环状DNA（图2-1A），经过RNA分子连接作用将DNA片段结合起来形成环（loop），从而造成DNA长度缩小成为25m（图2-1B），在活体大肠杆菌染色体上约有50多个这么环。接着每个环内DNA深入螺旋，使DNA长度深入缩短为1.5m，而形成更高级结构染色体（图2-1C）。所以，细菌染色体不是一条裸露DNA链，而是以高度组装形式存在，同时这种组装不但为了适应细菌细胞狭小空间，而且还要有利于染色体功效实现，便于染色体复制和基因表示。第3页第一节第一节 染色体染色体 图2-1 大肠杆菌（E.coli）染色体基本结构 第4页第一节第一节 染色体染色体 2原核生物DNA基因组组织结构特点 （1）结构简练 原核DNA分子绝大部分是用来编码蛋白质，只有非常小一部分不转录，这与真核DNA冗余现象不一样。（2）基因种类和数量较少 原核细胞中染色体普通只有一条双链DNA分子，且大都带有单拷贝基因，且多以重合基因形式存在，只有极少数基因（如rRNA基因）是以多拷贝形式存在；整个染色体DNA几乎全部由功效基因与调控序列所组成；几乎每个基因序列都与它所编码蛋白质序列呈线性对应状态。（3）以操纵子为转录单元 原核生物DNA序列中功效相关RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组一个或几个特定部位，形成功效单位或转录单元，它们可被一起转录为含多个mRNA分子，叫多顺反子mRNA。X174及G4基因组中就含有数个多顺反子。功效相关基因串联在一起转录产生一条多顺反子mRNA链，然后再翻译成各种蛋白质。第5页第一节第一节 染色体染色体 三、真核生物染色体组成三、真核生物染色体组成 1染色体蛋白质 （1）组蛋白 组蛋白是真核生物染色体基本结构蛋白，富含带正电荷Arg和Lys等碱性氨基酸，等电点普通在pH l0.0以上，属碱性蛋白质，能够和酸性DNA非特异性紧密结合，而且普通不要求特殊核苷酸序列，通惯用0.25mol/L HCL或H2SO4从染色质中分离得到。真核生物染色体组蛋白有5种，即H1、H3、H2A、H2B和 H4。组蛋白中，H3，H4，H2A，H2B，其N端氨基酸都是碱性氨基酸，碱性N端借静电引力与DNA起作用，组蛋白之间借此相互聚合，C端是疏水端；而H1则相反，C端是碱性氨基酸，N端是疏水端，而且H1含有45种分子类型，所以在遗传上H1保守性最少。组蛋白可进行各种修饰。因为组蛋白N端赖氨酸乙酰化，改变了赖氨酸所负载电荷，从而影响了与DNA结合，有利于转录进行，而组蛋白磷酸化主要在组蛋白N端丝氨酸残基上进行。现普通认为组蛋白磷酸化可减弱组蛋白与核酸结合，从而降低组蛋白对DNA模板活力抑制，从而利于转录进行。而甲基化组蛋白。第6页第一节第一节 染色体染色体 （2）非组蛋白 与染色体组蛋白不一样与染色体组蛋白不一样，非组蛋白是指染色体上与特异DNA序列相结合蛋白质，所 以 又 称 序 列 特 异 性 DNA结 合 蛋 白(sequencespecificDNAbinding proteins)。普通来说，非组蛋白所含酸性氨基酸量超出碱性氨基酸量，所以带负电荷。非组蛋白和组蛋白不一样，它含有种属和组织特异性，而且在活动染色质中比不活动染色质中含量要高。非组蛋白在整个细胞周期中都进行合成，而不像组蛋白仅在S期和DNA复制同时进行。非组蛋白功效：能帮助DNA分子折叠，以形成不一样结构域，从而有利于DNA复制和基因转录；帮助开启DNA复制；特异性地控制基因转录，调整基因表示。非组蛋白和组蛋白一样能够被磷酸化，这被认为是基因表示和调控主要步骤。第7页第一节第一节 染色体染色体 2染色质和核小体 （1）核小体结构主要试验证据 用温和方法破坏细胞核，将染色质铺展在电镜铜网上，经过电镜观察，未经处理染色质自然结构为30nm纤丝，经盐溶液处理后解聚染色质展现一系列核小体相互连接串珠状结构，念珠直径为10nm；用微球菌核酸酶(micrococcal nuclease)消化染色质，经过蔗糖梯度离心及琼脂糖凝胶电泳分析发觉，假如完全酶解，切下片段都是200bp单体；假如部分酶解，则得到片段是以200bp为单位单体、二体(400bp)、三体(600bp)等等。蔗糖梯度离心得到不一样组分，在波长260nm吸收峰大小和电镜下所见到单体、二体、三体核小体完全一致；应用X射线衍射、中子散射及电镜三维重建技术，研究染色质结晶颗粒，发觉颗粒是直径为11nm、高6.0nm扁圆柱体，含有二分对称性(dyad symmetry)，关键组蛋白组成是两个H3分子和两个H4分子先形成四聚体，然后再与两个由H2A和H2B组成异二聚体(heterodimer)结合成八聚体。第8页第一节第一节 染色体染色体 （2）核小体结构关键点 每个核小体单位包含200bp左右DNA、一个组蛋白八聚体以及一个分子组蛋白H1；组蛋白八聚体组成核小体关键结构，分子量100kD，由H2A、H2B、H3和H4各两个分子所组成；DNA分子以左手方向盘绕八聚体两圈，每圈83bp，共166bp。用微球菌核酸酶水解，可得到不含组蛋白H1146bpDNA片段(1.75圈)。一个分子组蛋白H1与DNA结合，锁住核小体DNA进出口，从而稳定了核小体结构；两个相邻核小体之间以连接DNA(1inkerDNA)相连，长度为080bp不等（图2-2）。第9页第一节第一节 染色体染色体AB图2-2 核小体单体存在及关键颗粒形成A：为核小体结构示意图；B：为核小体单元产生第10页第二节 DNA组成和结构 一、一、DNA组成组成 1碱基 核酸中碱基分两类：嘧啶碱和嘌呤碱。嘧啶碱是母体化合物嘧啶衍生物。核酸中常见嘧啶碱有三类：胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。其中胞嘧啶为DNA和RNA两类核酸所共有。胸腺嘧啶只存在于DNA中，不过tRNA中也有少许存在；尿嘧啶只存在于RNA中。植物DNA中含有一定量5甲基胞嘧啶。在一些大肠杆菌噬菌体DNA中，5羟甲基胞嘧啶代替了胞嘧啶。嘌呤碱有两类：腺嘌呤及鸟嘌呤。嘌呤碱是由母体化合物嘌呤衍生而来。除了5种基本碱基外，核酸中还有一些含量甚少稀有碱基。稀有碱基种类极多，大多数都是甲基化碱基。tRNA中含有较多稀有碱基，可高达10。当前已知稀有碱基和核苷达近百种。图2-3A是存在于DNA和RNA分子中5种含氮碱基结构式。第11页第二节 DNA组成和结构 2核苷 核苷是一个糖苷，由戊糖和碱基缩合而成。糖与碱基之间以糖苷键相连接。糖第一位碳原于（C1）与嘧啶碱第一位氮原子(N1)或与嘌呤碱第九位氮原子（N9）相连接。所以，糖与碱基间连键是NC键，普通称之为N糖苷键；核苷中D核糖及D2脱氧核糖均为呋喃型环状结构。糖环中C1是不对称碳原子，所以有及两种构型。但核酸分子中糖苷键均为糖苷键。应用X射线衍射法已证实，核苷中碱基与糖环平面相互垂直。依据核苷中所含戊糖（图2-3B）不一样，将核苷分成两大类：核糖核苷和脱氧核糖核苷。对核苷进行命名时，必须先冠以碱基名称，比如腺嘌呤核苷、腺嘌呤脱氧核苷等。RNA中含有一些修饰和异构化核苷。核糖也能被修饰，主要是甲基化修饰。tRNA和rRNA中还含少许假尿嘧啶核苷，在它结构中，核糖不是与尿嘧啶第一位氮（N1），而是与第五位碳（C5）相连接。细胞内有特异异构化酶催化尿嘧啶核苷转变为假尿嘧啶核苷。第12页第二节 DNA组成和结构 3核苷酸 核苷磷酸酯叫做核苷酸，分为(核糖)核苷酸(ribo)nucleotide和脱氧(核糖)核苷酸deoxy(ribo)nucleotide两大类，分别组成DNA和RNA基本结构单位。全部核苷酸都可在其5位置连接一个以上磷酸基团；从戊糖开始第一、二、三个磷酸残基依次称为、。和及和之间键是高能键，为许多细胞活动提供能量起源。核苷三磷酸缩写为NTP，核苷二磷酸缩写为NDP。5核苷三磷酸是核酸合成前体。细胞内还有各种游离核苷酸和核苷酸衍生物，它们都含有主要生理功效。所以，对于核酸和蛋白质系统，核苷酸相当于氨基酸，碱基相当于氨基酸功效基。下面列举几个核苷酸结构式（图2-3C）。核糖核苷糖环上有3个自由羟基，能形成3种不一样核苷酸。(图2-3C)脱氧核苷糖环上只有2个自由羟基，所以只能形成两种核苷酸。生物体内游离存在核苷酸多是5-核苷酸。用碱水解RNA时，可得到2-与3-核糖核苷酸混合物。第13页第二节 DNA组成和结构 图2-3 碱基、戊糖和核苷酸结构A：碱基；B：戊糖；C：核苷酸第14页第二节 DNA组成和结构 二、二、DNADNA一级结构一级结构 DNA由数量庞大4种脱氧核苷酸经过3，5磷酸二酯键连接而成，DNA一级结构就是这些脱氧核苷酸在分子中排列次序（序列）。就是DNA分子内碱基排列次序。它以密码子方式蕴藏着遗传信息，以碱基序列方式蕴藏着对遗传信息调控。DNA分子中碱基序列似乎是不规则，实际上是高度有序。任何一段DNA序列都能够反应出功效特异性和它个体、种族特征。一级结构决定了DNA二级结构、折叠成空间结构。这些高级结构又决定和影响着一级结构信息功效，即基因开启和关闭。所以，研究DNA一级结构对说明遗传物质结构、功效以及它表示、调控都是极其主要。DNA几乎是全部生物遗传信息携带者。它是信息分子，携带以下两类不一样遗传信息。一类是负责编码蛋白质氨基酸序列信息。在这一类信息中，DNA一级结构与蛋白质一级结构之间基本上存在共线性关系。第15页第二节 DNA组成和结构 另一类一级结构信息与基因表示相关，负责基因活性选择性表示和调控。这一部分DNA一级结构参加调控基因转录、翻译、DNA复制、细胞分化等功效，决定细胞周期不一样时期和个体发育不一样阶段、不一样器官、不一样组织以及不一样外界环境下，基因是开启还是关闭，开启量是多少等等。这一类DNA一级结构有两种情况：它本身负责编码一些调控蛋白，这些蛋白质负责调控对应基因；一些DNA一级结构区段负责基因表示调控位点，即决定基因开启或关闭元件。普通由调控蛋白与调控元件相互作用来有效地控制基因。后者成为调控蛋白作用靶位点。DNA分子中有各种特异性元件，如与复制相关各种位点都有它们特异性一级结构。DNA分子总A+T与G+C含量相等，但在一些区域A+T含量大大增高。因为AT碱基对有2个氢键，而GC之间有3个氢键，在很多有主要调整功效DNA区域都富含有AT，如开启子区域等，有利于双链解开，一些蛋白质与解链部位相互结合。第16页第二节 DNA组成和结构 三、三、DNADNA二级结构二级结构 DNA二级结构指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成双螺旋结构。1双螺旋结构模型依据 X射线衍射数听说明DNA含有两条或两条以上含有螺旋结构多核苷酸链，而且沿纤维长轴有0.34nm和3.4nm两个主要周期性改变。choqoe等应用层柝法对各种生物。DNA碱基组成进行了分析，发觉中腺嘌呤数目与胸腺嘧啶数目相等，胞嘧啶(包含5甲基胞嘧啶)数目和鸟嘌呤数目相等。以后又有些人证实腺嘌呤和胸腺嘧啶间能够生成两个氢键；而胞嘧啶和鸟嘌呤之间能够允许生成3个氢键。用电位漓定法证实DNA磷酸基能够滴定，而嘌呤和嘧啶可解离基团则不能漓定，说明它们是由氢键连接起来。第17页第二节 DNA组成和结构 由此得出DNA双螺旋模型关键点：主链：DNA主链由脱氧核糖和磷酸相互间隔连接而成，从3，5磷酸二酯键方向来看，双螺旋中2条多聚脱氧核苷酸链是反向平行。2条主链处于螺旋外侧，碱基处于螺旋内侧，且主链是亲水性。2条主链形成右手螺旋，有共同螺旋轴，螺旋直径是2nm。碱基配对特征：因为受几何形状限制，只有A和T配对，G和C配对，其形状才能正适合双螺旋大小，安置在双螺旋内，不会使螺旋有任何畸变或丧失对称性。这两种碱基对还有另一个特征，就是处于一个平面含有二次旋转对称性，即一个碱基对旋转180并不影响双螺旋对称性。这意味着AT、TA、GC和CG四种碱基对形式都允许处于这种几何形状中，即双螺旋结构只限定配对方式，并不限定碱基排列次序。第18页第二节 DNA组成和结构 碱基：碱基环是一个共轭环，碱基对组成平面与螺旋轴近似垂直，螺旋轴穿过碱基平面，相邻碱基对沿螺旋转36角，上升0.34nm。所以，每10对碱基绕轴旋转一圈组成一节螺旋，螺距3.4nm。大沟和小沟：沿螺旋轴方向观察，能够看到配正确碱基并没有充满螺旋空间。因为碱基对与糖环连接都是在碱基正确同侧，故这种不对称连接造成双螺旋表面形成2个凹下去沟，一个宽一个窄，分别称为大沟和小沟。糖一磷酸骨架组成大沟和小沟两壁，碱基对边就是沟底，而螺旋轴经过碱基对中央。所以，大、小两沟深度差不多，亦即从螺旋圆柱面至碱基对边之间横向距离大致相等。双螺旋表面沟对DNA与蛋白质相互识别和结合都是很主要。因为只有在沟内才能接触到碱基次序，而在双螺旋表面则是脱氧核糖和磷酸重复结构，似乎并无信息可言。当然，大沟和小沟之间存在着显著差异。大沟空间可容纳其它分子“阅读”沟内碱基次序信息，并可使其氮、氧原子与蛋白质氨基酸侧链形成氢键而结合。而小沟没有足够大空间与蛋白质分子识别和结合，不过在B-DNA小沟内可观察到水合结构。（图2-4）是DNA双螺旋模型第19页第二节 DNA组成和结构 图2-4 DNA双螺旋模型 第20页第二节 DNA组成和结构 2DNA双螺旋种类 （1）右手螺旋多重构象表2-1不一样螺旋形式DNA分子主要参数比较 第21页第二节 DNA组成和结构 （2）左手螺旋 在DNA单链中存在嘌呤与嘧啶交替排列次序CGCGCG或CACACA时，则会出现左手双螺旋结构。在主链中各个磷酸根呈锯齿状排列，如同“之”字形一样，所以叫做Z型构象(采取Zigzag第一个字母)。Z型结构是全部DNA结构每圈螺旋碱基对最多，因而有最少扭曲结构。比如，真核细胞中常出现胞嘧啶第5位碳原于甲基化，形成局部疏水区，这一区域伸入BDNA大沟中，使BDNA不稳定而转变为ZDNA。抗体能够区分Z型DNA和B型DNA。这些抗体与果蝇染色体特殊区域以及其它生物体细胞核结合。在果蝇中，结合区域比染色体有更为展开结构,说明ZDNA存在是一个自然现象。能够看出，DNA构象多变性，或者说DNA二级结构多态性，是在不一样条件和含有特殊序列结构时才展现出来，说明DNA是一个可变动态分子，以多变构象实现内涵丰富生物学功效。第22页第二节 DNA组成和结构 四、DNA高级结构 DNA高级结构是指DNA双螺旋深入扭曲盘绕所形成特定空间结构。超螺旋结构是DNA高级结构主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类，它们在特殊情况下能够相互转变，如：DNA分子这种改变能够用一个数学公式来表示：L=T+W其中，其中为连接数，是指环形DNA分子两条链间交叉次数。只要不发生链断裂，L是个常量。T为双螺旋盘绕数(twisting number)，W为超螺旋数(writhing number)，它们是变量。第23页第三节第三节 DNADNA复制复制 一、DNA半保留复制机理 二、DNA复制起点、方向和速度 DNA在复制时，首先在一定位置解开双链，这个复制起点展现叉子形式，称为复制叉。普通把生物体能独立进行复制单位称为复制子。试验证实，复制在起始阶段进行控制，一旦复制开始，就连续进行下去，直到整个复制子完成复制。每个复制子由一个复制起点控制。原核生物复制起始点通常在它染色体一个特定位点，而且只有一个起始点，所以，原核生物染色体只有一个复制子。真核生物染色体多个位点能够起始复制，有多个复制起始点，所以是多复制子（表2-2）。且多个复制子不是同时起作用，而是在特定时间，只有一部分复制子（不超出15%）在进行复制过程。关于DNA复制方向和速度，最为普遍就是双向等速进行（图2-5）。一些环状DNA偶然从一个复制起始点形成一个复制叉，单向复制。而腺病毒则从两个起始点相向进行复制。第24页第三节第三节 DNADNA复制复制 表2-2 部分生物复制子比较第25页第三节第三节 DNADNA复制复制 图2-5 放射性试验证实DNA复制是从固定起始点双向等速进行第26页第三节第三节 DNADNA复制复制 三、三、DNADNA复制几个主要方式复制几个主要方式 1线性DNA双链复制 复制叉生长方向有单一起点单向(如腺病毒)及双向(如噬菌体)，和多个起始点双向几个，DNA双向复制时复制叉处呈“眼”型。线性DNA复制中RNA引物被切除后，留下5端部分单链DNA，不能为DNA聚合酶所作用，使子链短于母链。T4和T7噬菌体DNA经过其末端简并性,使不一样链3端因互补而结合，其缺口被聚合酶作用填满，再经DNA连接酶作用生成二联体。这个过程可重复进行直到生成原长20多倍多联体，并由噬菌体DNA编码核酸酶特异切割形成单位长度DNA分子。290噬菌体和腺病毒基因组末端含反向重复序列，复制时，5端首先与末端蛋白共价结合，开始互补链合成。当另一条链完全被置换后，两端经过发卡结构相连，形成一个大部分序列互补单链环形DNA分子，复制从其内部起始位点开始按前导链方式双向进行，经过环形结构抵达分子另一部分，经双链结构交织切割后生成完整子链病毒。除了环形部分发生重排之外，所生成新DNA分子带有母链全部遗传信息。第27页第三节第三节 DNADNA复制复制 2环状DNA双链复制 （1）型复制 型（图2-6）复制能够是双向或单向，大多为等速双向，少数为不等速双向复制。两个共价封闭相互盘绕DNA双链在拓扑异构酶作用下从起始点（ori）开始形成DNA切口和封闭，DNA一条或两条主链骨架有暂时切断，是DNA超旋或解旋，有利于复制叉向前移动。前导链DNA开始复制前，复制原点核酸序列被转录生成短RNA链，作为起始DNA复制引物。（2）滚动环复制 它是很多病毒、细菌因子以及真核生 物中基因放大基础。如：X174，T4噬菌体等DNA都以如图2-7所表示 第28页第三节第三节 DNADNA复制复制 图2-6 DNA复制型结构第29页第三节第三节 DNADNA复制复制 （3）D型复制 线粒体和叶绿体含有双链环状DNA，在电镜中观察到，线粒体DNA复制叉曾展现出D形。在复制开始时，双链环状DNA在特定ori位点出现一个复制泡(replicative bubble)，双链解链。复制泡亲代分子中以（）链作为模板，合成一条新链，而且将亲代分子（+）链置换出来，新链与它模板形成部分双链。这么，在线粒体DNA复制过程中，出现一条单链和一条双链组成三元泡结构，称为置换环(displacement loop)或D环。（图2-8）。第30页第三节第三节 DNADNA复制复制 图2-7 环状DNA能够经过滚环式复制产生多单元DNA第31页第三节第三节 DNADNA复制复制 图2-8 D型复制模型第32页第四节 原核生物和真核生物DNA复制特点 一、原核生物DNA复制特点 1DNA双螺旋解旋 DNA双螺旋分子含有紧密缠绕结构，编码碱基位于分子内部，所以在复制时，母本DNA两条链应最少分开一部分，才能使DNA复制酶系统“阅读”模板链碱基次序。使DNA双螺旋解旋并使两条链保持分开状态是个极其复杂过程，现在已找到一些酶和蛋白质，它们或者能使DNA双链变得易于解开，或者能够使超螺旋分子松弛。2冈崎片段与半不连续复制 按照Watson-Crick假说，DNA两条链方向相反，所以复制时，如新生DNA一条链从5向3端合成，则另一条链必须从3端向5端延伸。可是，迄今发觉DNA聚合酶都只能催化DNA链从5端向3端延长。第33页第四节 原核生物和真核生物DNA复制特点 图2-9 DNA半不连续复制 第34页第四节 原核生物和真核生物DNA复制特点 3DNA复制引发与终止 在细胞提取物中合成冈崎片段时，不但需要dATP、dGTP、dCTP和dTTP四种前体，还需要一个与模板DNA碱基次序互补RNA短片段看成引物。有许多试验结果能证实RNA引物存在。在多瘤病毒体外系统中合成冈崎片段是一个5端约10核苷酸长，以3三磷酸为结尾RNA。这是一个强有力证据。第35页第四节 原核生物和真核生物DNA复制特点 图2-10 大肠杆菌染色体DNA双向复制示意图 第36页第四节 原核生物和真核生物DNA复制特点 4DNA聚合酶 DNA聚合酶不是复制大肠杆菌染色体主要聚合酶，它有35核酸外切酶活性，这种活性和聚合酶活性紧密结合在一起，既可合成DNA链，又能降解DNA，确保了DNA复制准确性。另外，它还有53核酸外切酶功效，可作用于双链DNA，又可水解5末端或距5末端几个核苷酸处磷酸二酯键，因而该酶被认为在切除由紫外线照射而形成嘧啶二聚体中起着主要作用。它也可用以除去冈崎片段5端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，确保连接酶将片段连接起来。DNA聚合酶含有53方向聚合酶活性，但酶活性很低。若以每分钟酶促核苷酸掺入DNA效率计算，只有DNA聚合酶5，故也不是复制中主要酶。其35核酸外切酶活性可起校正作用。当前认为DNA聚合酶生理功效主要是起修复DNA作用。DNA聚合酶包含有7种不一样亚单位和9个亚基，其生物活性形式为二聚体。它有53方向聚合酶活性，也有35核酸外切酶活性。它活力较强，为DNA聚合酶15倍，DNA聚合酶300倍。它能在引物3OH上以每分钟约5万个核苷酸速率延长新生DNA链，是大肠杆菌DNA复制中链延长反应主导聚合酶。表2-3介绍了上述DNA聚合酶性质。第37页第四节 原核生物和真核生物DNA复制特点 第38页第四节 原核生物和真核生物DNA复制特点 二、真核生物二、真核生物DNADNA复制特点复制特点 1真核细胞每条染色体含有多个复制起始点。复制子大小改变很大，约5-300kbp。复制能够在几个复制起始点上同时进行，复制起始点不是一成不变。在发育过程中，活化细胞有更多复制起始点。比如，果蝇在胚胎发育早期，其最大染色体上有6000个复制叉，大约每10 kbp就有一个。2真核生物染色体在全部复制完成之前，各个复制起始点不能开始新一轮复制。而原核生物中，复制起始点上能够连续开始新复制事件，表现为一个复制子内套叠有多个复制叉。3真核生物DNA复制子被称为自主复制序列（ARS），长约150bp左右，含有几个复制起始必须保守区。而且其复制起始需起点识别复合物（ORC）参加，并需ATP。真核生物复制叉移动速度大约只有50bp/s，还不到大肠杆菌1/20。所以，人类DNA中每隔3x1043x105就有一个复制起始位点。第39页第四节 原核生物和真核生物DNA复制特点 4真核生物有各种DNA聚合酶，分别为在真核细胞中主要有5种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶、和，真核细胞DNA聚合酶和细菌DNA聚合酶基本性质相同，均以dNTP为底物，需Mg2+激活，聚合时必须有模板链和含有3OH末端引物链，链延伸方向为53。但真核细胞DNA聚合酶普通都不含有核酸外切酶活性，推测一定有另外酶在DNA复制中起校对作用。DNA聚合酶功效主要是引物合成。DNA聚合酶活性水平稳定，可能主要在DNA损伤修复中起作用。DNA聚合酶是主要负责DNA复制酶，参加先导链和滞后链合成。而DNA聚合酶主要功效可能是在去掉RNA引物后把缺口补全。5端粒复制 线性染色体末端DNA称为端粒，端粒功效主要是稳定染色体末端结构，预防染色体之间末端连接。复制由一个特殊酶-端粒酶所催化。真核生物线性染色体在复制后，不能原核生物那样填补5末端空缺，从而会使5末端序列所以缩短。而端粒酶能够外加重复单位到5末端上，维持端粒一定长度。第40页第四节 原核生物和真核生物DNA复制特点 三、三、DNADNA复制调控复制调控 1大肠杆菌染色体DNA复制调控 染色体复制与细胞分裂普通是同时，但复制与细胞分裂不直接偶联。复制起始不依赖于细胞分裂，而复制终止则能引发细胞分裂。在一定生长速度范围内，细胞与染色体质量之比相对恒定，这是由活化物、阻遏物和去阻遏物及它们相互作用所制约。复制功效单位，即复制子，由起始物位点和复制起点两部分组成。起始物位点编码复制调整蛋白质，复制起点与调整蛋白质相互作用并开启复制。起始物位点突变使复制停顿并造成细胞死亡。2ColE1质粒DNA复制调控 ColE1是一个6646bp小质粒，在宿主细胞内拷贝数为2030。ColE1 DNA复制不依赖于其本身编码蛋白质，而完全依靠宿主DNA聚合酶。质粒DNA编码两个负调控因子Rop蛋白和反义RNA(RNA1)，它们控制了起始DNA复制所必需引物合成。第41页第四节 原核生物和真核生物DNA复制特点 3真核细胞DNA复制调控 真核细胞生活周期可分为4个时期：G1、S、G2和M期。G1是复制预备期，S为复制期，G2为有丝分裂准备期，M为有丝分裂期。DNA复制只发生在S期。真核细胞中DNA复制有3个水平调控：（1）细胞生活周期水平调控 也称为限制点调控，即决定细胞停留在G1期还是进入S期。许多外部原因和细胞因子参加限制点调控。促细胞分裂剂、致癌剂、外科切除等都可诱发细胞由G1期进入S期。一些细胞质因子如四磷酸二腺苷和聚ADP核糖也可诱导DNA复制。（2）染色体水平调控 决定不一样染色体或同一染色体不一样部位复制子按一定次序在S期起始复制，这种有序复制机理还不清楚.（3）复制子水平调控 决定复制起始是否。这种调控从单细胞生物到高等生物是高度保守。另外，真核生物复制起始还包含转录话化、复制起始复合物合成和引物合成等阶段，许多参加复制起始蛋白功效与原核生物中相类似。酵母染色体复制只发生于S期,各个复制子按专一时间次序活化，在S期不一样阶段起始复制。第42页第五节第五节 DNADNA损伤与修复损伤与修复 一、一、DNADNA损伤起源损伤起源 1DNA分子自发性损伤 （1）互变异构 DNA分子中4种碱基自发地使氢原子改变位置，产生互变异构体，深入使碱基配正确方式发生改变，这么在复制后子链上就可能出现错误。比如：腺嘌呤互变异构体A能够与C配对，胸腺嘧啶互变异构体T与G配对，当DNA复制时，假如模板链上存在这些互变异构体，在子链上就可能发生错误，形成损伤。（2）脱氨试剂及自发脱嘌呤和脱嘧啶 包含羟胺，是一个体外诱变剂；亚硫酸盐，主要改变DNA分子单链区CU，亚硝酸盐主要使CU，也使A和G脱去氨基，但特异性较差，可引发体内外广泛诱变。（3）活性氧引发诱变 活性氧为氧分子电子数大于O2O2。8oxoG(GA)是一个氧化碱基(7，8、二氢8氧代鸟嘌呤)，可与C、A配对，而DNA聚合酶、校正活性不能校正其错配，造成GCTA颠换，这种损伤能够积累。H202是细胞呼吸副产物，非常活跃，造成DNA氧化损伤时，产生胸腺嘧啶乙二醇、胸苷乙二醇和羟甲基尿嘧啶等，这类损伤普通能被修复。第43页第五节第五节 DNADNA损伤与修复损伤与修复 2物理原因引发DNA损伤 紫外线（UV）照射引发DNA损伤主要是形成嘧啶二聚体，DNA分子最易于吸收波长在260nm左右，当受到大剂量UV照射后，一条链上相邻两个嘧啶核苷酸共价结合，形成环丁烷嘧啶二聚体。形成二聚体反应可逆较长波长（280nm）有利于二聚体形成，较短波长（240 nm）利于其解聚。二聚体生成位置和频率与侧翼碱基序列有一定关系。当人皮肤暴露在阳光下，每小时因为UV照射产生嘧啶二聚体频率为5x104细胞。因为UV穿透力有限，故对人伤害主要是皮肤。紫外线照射影响微生物存活。电离辐射对DNA损伤有直接效应和间接效应两种路径。前者指辐射对DNA分子直接聚积能量，引发理化性质改变；后者指电离辐射对DNA存在环境中其它成份(主要是水)沉积能量，引发DNA分子改变。第44页第五节第五节 DNADNA损伤与修复损伤与修复 3化学原因引发DNA损伤 （1）烷化剂对DNA损伤 烷化剂是一类亲电子化合物，极轻易与生物体中有机物大分子亲核位点起反应。当烷化剂和DNA作用时，就能够将烷基加到核酸碱基上去。DNA中亲核位点主要有：腺嘌呤中N1，N3，N6，N7；鸟嘌呤中N1，N2，N3N7和06；胞嘧啶中N3，N4和O4；胸腺嘧啶中N3，O2和O4。其中鸟嘌呤N7位和腺嘌呤N3位最轻易被烷化，DNA链上磷酸二酯键中氧也轻易被烷化。（2）碱基类似物对DNA损伤 碱基类似物是一类结构与碱基相同人工合成化合物，因为它们结构与碱基相同，进入细胞后能替换正常碱基掺入到DNA链中，干扰DNA正常合成。5溴尿嘧啶(5BU)是胸腺嘧啶环上甲基被溴取代一个最常见碱基类似物，与U结构非常相同,能与A配对，5BU有酮式和烯醇式两种形态，当处于烯醇式时，可与G配对，且存在机率高于酮式形态，所以一旦掺入到DNA链中，经过互变异构在复制中产生突变，引发ATCC转换。另一个常见碱基类似物是2氨基嘌呤(2AP)，在正常酮式状态时与T配对，在烯醇式状态时与C配对。在一些植物体代谢过程中，能产生个别毒性化合物，其中包含DNA损伤剂。第45页第五节第五节 DNADNA损伤与修复损伤与修复 二、二、DNADNA修复修复 1错配修复 E.coli防止突变主要路径之一就是甲基指导错配修复系统。这个系统是非特异性，它能修复引发DNA双螺旋轻微扭曲任何扭伤，包含错配、移码、碱基类似物掺人和一些类型微小扭曲烷基化损伤。2碱基切除修复 是一个在细胞中存在较普遍修复过程。在细胞中都有不一样类型、能识别受损核酸位点糖苷水解酶，它能特意性切除受损核苷酸上N-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点（AP位点）。DNA分子中一旦产生了AP位点，核酸内切酶就会把受损核酸糖苷-磷酸键切开，并移去包含AP位点核苷酸在内小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新片段，最终由DNA连接酶把二者连成新被修复DNA链。第46页第五节第五节 DNADNA损伤与修复损伤与修复 图2-11 甲基介导错配修复模型 第47页第五节第五节 DNADNA损伤与修复损伤与修复 3核苷酸切除修复 核苷酸切除修复系统几乎能够修复紫外线照射引发各种损伤。包含环丁烷二聚体、64损伤、碱基-糖基交联等引发DNA双螺旋大扭曲(major distortion)，而不能修复因为碱基错配、O6甲基鸟嘌呤、O4甲基胸腺嘧啶、8oxoG或碱基类似物引发DNA双螺旋微小扭曲，对提升DNA损伤细胞存活能力是非常主要。第48页第五节第五节 DNADNA损伤与修复损伤与修复 图2-12 UvrABC内切酶切补修复模型 A：UvrA；B：UvrB；C：UvrC；D：UvrD；I：PolI第49页第五节第五节 DNADNA损伤与修复损伤与修复 4DNA直接修复 大肠杆菌细胞中有光复活修复系统，不需切除碱基或核苷酸，而直接由可见光激活细胞内DNA光解酶，分解因紫外光照射而产生胸腺嘧啶二聚体。即在生物体内，光解酶首先识别DNA上二聚体，结合成酶DNA复合物，利用可见光能量，使DNA分子上受损部位恢复正常，然后酶从DNA上释放。图2-13为DNA分子上胸腺嘧啶二聚体。第50页第五节第五节 DNADNA损伤与修复损伤与修复 图2-13 DNA分子上胸腺嘧啶二聚体结构 第51页