基于核酸适配体的蛋白质研究新技术和新方法.doc

. 项目名称：基于核酸适配体的蛋白质研究新技术和新方法首席科学家：谭蔚泓 湖南大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部二、预期目标总体目标: 本项目针对当前蛋白质研究中存在的瓶颈问题，发展基于核酸适配体的蛋白质研究新技术新方法；以肝癌和食管癌为研究对象，面向我国社会发展中提高人类健康的重大需求，通过建立肝癌和食管癌相关蛋白的发现、分离分析、检测表征等新技术，探索肝癌和食管癌发生发展的分子机制，为恶性肿瘤等重大疾病早期诊断提供新技术和新方法。通过开展多学科交叉与综合研究，形成具有原始创新的方法学突破及自主知识产权的蛋白质研究支撑平台，获得具有国际影响的重要研究成果，培养造就一支具有多学科知识和创新研究能力的研究队伍，促进我国在蛋白质研究领域达到国际领先水平。五年预期目标： 1. 阐明核酸适配体筛选过程的进化规律，建立针对蛋白质、细胞、组织等不同层次蛋白质靶标体系的高效率核酸适配体筛选技术平台，并筛选出针对肝癌和食管癌特异性标志物的核酸适配体15-30种。2揭示核酸适配体与蛋白质相互作用的分子机制，发展2-4种具有自主知识产权的系统研究核酸适配体分子识别的方法，为核酸适配体分子探针的设计、筛选、构/效关系和性能评价提供理论指导。3. 发展高灵敏、高通量、高准确度的蛋白质定量检测的新原理、新方法，提出高效率、高重现性的蛋白质分离富集的新方法、新技术，研制出相应高通量、自动化的蛋白质分离及检测系统，对低丰度蛋白检测的灵敏度达到1 pg/mL及更低水平，为肿瘤的蛋白质生物标志物的发现、重大疾病的分子机制研究与早期诊断提供研究工具。4. 建立肝癌、食管癌等恶性肿瘤体系的特征核酸适配体分子识别指纹图谱，发现4-5种特异性高的癌症标志物，并完成核酸适配体分子识别体系在癌症早期诊断中的临床意义评估, 开发具有自主知识产权的诊断系统。5. 取得有国际影响的重要基础研究成果，提出有自主知识产权的新理论和新方法。发表一批高水平、具有重要国际影响的学术论文。申请并获得一批具有产业化前景的发明专利。6. 在蛋白质研究领域培养一批具有化学与生物医学交叉学科综合知识的优秀人才队伍与中青年研究骨干。通过项目协作，促进形成一支在核酸适配体相关领域具有国际领先水平的学术团队。三、研究方案（一）总体思路（1）以肿瘤为研究模型，发展基于核酸适配体的蛋白质研究技术本项目从“国家中长期科学和技术发展规划纲要”中“人口与健康”等国家重大战略需求出发，以2008年度起蛋白质研究重大计划重要支持方向“蛋白质研究的新技术和新方法” “核酸适配体识别等新技术新方法”为依据，发挥核酸适配体所具备的高特异性、高亲和力、高稳定性、便于化学修饰与功能化、易于大量低成本与可重复性合成等优势，以及可通过核酸适配体筛选发现未知蛋白标志物并获得病变体系特征分子图谱的优越性，开展核酸适配体分子识别基础研究，指导蛋白质分离与检测方法的设计与发展，建立高通量、高灵敏、高准确度的蛋白质研究新方法和新技术，为癌症早期诊断提供特异性蛋白质标志物、分子探针、分子识别传感器件，满足提升我国人民健康水平的需求。（2）通过学科交叉，发展癌症早期诊治新方法随着核酸适配体、纳米生物探针、蛋白质组学研究方法的发展和成熟, 核酸适配体技术在恶性肿瘤等重大疾病诊治方面的应用正面临新的机遇。利用我们在核酸适配体分子识别体系基础研究和蛋白质研究技术创新方面的优势，通过多学科交叉, 联合国内的优势单位组成跨学科的研究团队（包括化学、生物医学、蛋白质科学、纳米技术等学科），系统地开展基于核酸适配体的重大疾病蛋白质标志物发现与检测技术的基础研究，利用核酸适配体分子识别体系进行癌症等重大疾病的早期诊断，将核酸适配体分子识别体系在生物医学领域的应用潜力变成现实。（二）技术路线：（1）核酸适配体筛选方法研究：构建大容量（10P13P至10P15P）的DNA和RNA分子文库，通过对核苷的2位修饰或对磷酸骨架进行硫代修饰等，改善文库的生物稳定性。优化筛选条件与流程。对于已知的几种肝癌和食道癌相关蛋白质（如AFP、PIVKA-II、P53 Ab），采用体外表达纯化的蛋白质直接进行筛选，通过系统优化筛选压力，获得特异性高和亲和力强的核酸适配体；同时为了发现未知蛋白质标志物，以肝癌和食道癌细胞、癌组织作为正筛选靶标，甄别对应非癌细胞系、癌旁组织等做阴性对照进行反向筛选，优化筛选条件与流程。对筛选出的核酸适配体进行测序、二级结构模拟分析、序列裁减，并表征其与靶标结合的亲和力和特异性。通过针对大量不同样本的系统筛选，发现核酸适配体筛选过程中的进化规律，建立高效、快速、标准化的筛选方法。（2）核酸适配体分子识别基础的研究：利用光谱技术、质谱技术、多维核磁共振和单分子探针技术揭示核酸适配体与靶蛋白质分子相互作用的构/效关系，深入研究生物分子识别规律。通过化学计算、分子模拟和分子设计，进行适配体与靶分子对接分析与自适应识别研究，建立相关理论模型，并利用这些模型和机制评估、设计新的核酸适配体分子探针，为建立基于核酸适配体的蛋白质研究新方法提供理论依据与指导。通过荧光标记与蛋白表达水平的同步检测，鉴定不同蛋白质靶标交叉识别与同一蛋白质靶标重复识别的核酸适配体分子识别模式，初步筛选出具有分子指纹价值的核酸适配体探针。运用化学计量学与生物信息学方法，建立不同病变体系的核酸适配体特征分子识别图谱的数学模型，通过大量样品进行核酸适配体特征分子识别图谱的评价与优化，通过特征提取算法进一步精简模型的描述变量，最终确定具有重大疾病个性化诊断价值的核酸适配体。（3）基于核酸适配体的蛋白质定量检测方法研究：基于上述筛选出来针对特定蛋白质分子的核酸适配体及其分子识别特性，设计构象互变型与链置换型荧光分子探针，发展均相、高通量的蛋白质定量检测新方法。结合纳米生物技术和核酸适配体分子识别特性，制备多种灵敏、简便、经济的核酸适配体分子探针，考察探针对靶分子或靶细胞的识别能力，研究其相互作用的动力学过程，发展改善探针靶向识别性能的方法，并建立纳米探针凝集等蛋白质定量检测新原理。综合运用各种纳米组装手段，结合核酸适配体化学修饰与功能化方法，开展自组装、原位沉积、物理插入、化学修饰等传感界面固定化方法研究，发展表面密度与取向可控的核酸适配体探针的固定化技术。以微纳米技术为基础，研究制作基于核酸适配体的微纳米传感器、微阵列的方法。探讨传感界面体系探针分子的负载量与仿生分子识别能力的关系，探索提高仿生分子识别体系纳米传感器、微传感器、微阵列和微芯片系统的重现性与稳定性的方法，抑制复杂生物体系中的交叉干扰现象。在此基础上，研制压电、阻抗、表面等离子共振等无标记型高灵敏、高通量、高精度蛋白质定量检测新方法。（4）基于核酸适配体的蛋白质分离与富集方法研究：对筛选出的肝癌与食道癌相关低丰度蛋白的核酸适配体进行生物素、巯基、氨基等化学修饰，利用表面修饰亲合素、羧基或环氧基的固相基质、纳米金等固定核酸适配体，研究固相表面修饰核酸适配体的密度，通过理论与实验分析其理论容量。通过盐浓度、pH、温度，变性剂等条件的调节，考察核酸适配体对蛋白的吸附、洗脱条件以及分离基质的再生方法，提高蛋白质富集与去除的重现性，由此建立批间误差小、分离容量高的蛋白质富集与去除技术。对于样品中高丰度蛋白质的去除，也将考察二氧化硅分离基质的制备，进一步提高高丰度蛋白质去除的容量与操作的简便性。建立用于蛋白质分离与富集的微流控芯片技术，通过光刻法制备PDMS微流控芯片，通过在芯片上固定的核酸适配体与样品混合物的循环流动进行低丰度蛋白质的富集捕获。此外，通过筛选磷酸化、泛素化与糖基化等翻译后修饰基团的核酸适配体，建立翻译后修饰蛋白质组的捕获与富集方法。（5）恶性肿瘤等重大疾病蛋白质标志物发现与验证方法研究：从食管癌、肝癌的诊断入手，以12种食管鳞癌细胞系组成的细胞群、肝癌和食管癌病人的肿瘤组织标本等为正筛靶标，以正常细胞、癌旁组织为反筛样本，筛选特异性核酸适配体。通过考察核酸适配体对大量食管癌、肝癌的细胞、组织及血清识别行为，系统评价所获得的核酸适配体对恶性肿瘤的特异性。对于充分验证的特异性核酸适配体，将其修饰于微流控芯片或微珠表面，并连续与癌细胞或组织裂解产物进行温育以捕获对应的蛋白质标志物。洗脱捕获的蛋白质采用生物质谱技术进行鉴定，甄别相应的蛋白质标志物。对甄别出的蛋白质标志物，构建相关质粒，在细胞水平及动物模型中改变其表达，观察其表达改变后对细胞生长及动物模型存活的影响，探讨标志物分子在肿瘤发生中的作用，并以此发现与验证癌症发生、发展过程中的新型功能标志物及其表达与变化模式。此外，以核酸适配体探针结合分子成像与流式细胞分析技术，研究相关标志物在病变体系的分布、定位、及动态变化情况，进行标志物的直观量化评估。（6）恶性肿瘤等重大疾病早期诊断方法与发生发展分子机制研究：利用项目所筛选的肝癌、食管癌核酸适配体，通过对大量早期肿瘤患者、健康对照人群进行血清样本检测，探讨核酸适配体作为恶性肿瘤早期诊断指标的价值。利用不同亚型和分期的食管癌、肝癌病理标本检测核酸适配体识别图谱在肿瘤分型诊断中的临床意义。结合纳米生物技术，建立纳米金、量子点、多孔纳米材料、碳纳米管和磁性纳米粒子等纳米材料界面核酸适配体的可控固定化方案，由此构建电、光、磁等功能化纳米核酸适配体探针，建立基于这些分子探针的单个癌细胞的检测方法和对病变组织的高灵敏成像方法，以期用于肿瘤早期诊断。利用生物探针和纳米生物传感器，开发基于液相芯片系统和金标-膜载体配合的核酸适配体快速诊断试剂和设备。通过质谱技术和蛋白质序列比对、结构功能预测以及树状分类分析等生物信息学手段分析与核酸适配体结合的蛋白质的结构和功能，研究肿瘤发生发展的机理。（三）创新点与特色本项目立足于项目组在化学、生物医学、蛋白质科学、纳米技术等方面良好的研究基础，结合项目组成员在核酸适配体、蛋白质研究和纳米生物领域取得的重要进展，尤其是核酸适配体的细胞筛选法和基于核酸适配体的蛋白质分离与检测方面的丰富积累，系统开展基于核酸适配体的蛋白质研究新技术与新方法的基础研究，具有以下多方面的创新性：1、核酸适配体筛选新方法方面：提出蛋白质分子、细胞、组织等多层次靶标的核酸适配体筛选与表征技术，通过核酸适配体的筛选实现正、负样品蛋白质组的成分差减，与传统的针对单一靶标的一次性筛选有本质的区别。本项目在大量筛选肿瘤相关核酸适配体的同时，系统地研究与阐明核酸适配体筛选过程中的进化规律，从而建立高效、快速、标准化的筛选方法。这些新筛选方法将成为疾病诊断、分子机制研究与疾病标志物发现、鉴定的新的重要资源。2、蛋白质定量检测新方法方面：利用核酸适配体易于修饰与标记的特性，将核酸适配体转化为人工设计的多功能化生物分子探针。系统深入研究核酸适配体分子识别基础，阐述分子识别体系的构-效关系与相关的理论模型，指导基于核酸适配体的蛋白质检测方法的理性设计。通过结合纳米生物技术、核酸适配体的自适应机制、核酸适配体的特异性信号放大技术，为高灵敏、高通量、高选择性的蛋白质检测方法的建立提供机遇，促进蛋白质定量检测新方法的重大突破。3、蛋白质分离新技术、新方法方面：针对翻译后修饰蛋白质难以选择性富集的难题，提出以糖基化、磷酸化、泛素化这类免疫原性很小的蛋白质翻译后修饰基团为靶标筛选核酸适配体，以分离富集相关修饰蛋白；利用核酸适配体可规模化学合成、批间误差小、成本低、稳定性好的优势，发展具有高容量、高精度的低丰度蛋白富集技术与高丰度蛋白的去除技术。这些新技术、新方法的发展，可望形成性能优良的蛋白质分离与富集技术平台。4、在重大疾病蛋白质标志物发现新方法方面：通过发展针对癌细胞、组织的核酸适配体筛选新方法，将差异蛋白质组鉴别有效的嵌入在核酸筛选过程中，既避免了对大量蛋白质的平行定量分析，又解决了低丰度蛋白质标志物发现存在的检测灵敏度低的难题，可望成为本项目自主创新的重大突破，成为重大疾病蛋白质标志物发现的重要技术手段。5、在恶性肿瘤等重大疾病早期诊断方面: 提出以核酸适配体分子识别指纹图谱作为肿瘤早期诊断、分型的方法，在肿瘤分型与肿瘤细胞的生物学特性间建立新的对应关系，为临床治疗方案的确立提供新依据。通过创新性地结合纳米生物技术与核酸适配体分子工程技术，获得一系列高灵敏、实时的生物检测新方法与新器件，将为表达差异小、低丰度生物靶标的鉴定与研究提供关键的检测技术与方法，可望在重大疾病的早期诊断方法学与技术基础方面取得创新性成果。本项目具有以下特色：（1）创新性强。面向国家需求发展癌症等重大疾病早期诊断新方法，利用新的蛋白质识别技术，提出基于核酸适配体的系列蛋白质研究新技术与新方法。并以此为契机对核酸适配体筛选与识别中的基本科学问题进行系统的研究与阐述。（2）突出理论与应用的交叉。系统研究核酸适配体分子识别体系的识别规律，建立核酸适配体筛选的统计理论与模型，在理论层次上指导基于核酸适配体的蛋白质分离与检测新技术与新方法的设计与应用。（3）研究内容覆盖了生物、医学、化学、蛋白质科学、纳米技术等学科，体现了多学科交叉融合的特色。（4）项目组在核酸适配体筛选、蛋白质分离与检测、恶性肿瘤早期诊断、生物传感技术、纳米生物分析技术等方面具备非常强的研究基础，优势互补，为项目的高效率实施提供了保障。（四）可行性本项目根据设定的研究目标和内容，凝聚了一支来自国内主要优势单位的多学科紧密配合的创新研究团队，共有8个不同学科的国家重点实验室或部门重点实验室参与研究工作，研究条件互补性强，具备了开展本项研究的软硬件条件。各参加单位在相关研究领域有长期的研究积累，而且已经合作开展了与本项目相关的前期研究工作,并取得具有国际影响的创新性成果。在核酸适配体筛选方法方面：主要承担单位湖南大学、中科院化学所和中国医学科学院多年来在各种类型蛋白质体系的核酸适配体筛选等诸多方面积累了相当丰富的经验，具有较强的综合研究能力。谭蔚泓教授已经开展了系列的癌细胞特异性核酸适配体筛选与应用研究，具有重大的国际影响，近期他得到国家“千人计划”的支持回湖南大学工作，与中科院化学所合作建成了核酸适配体筛选技术平台，已成功筛选出白血病癌、肺癌、肝癌、丙肝病毒等特异结合的核酸适配体，发现了不同类型癌细胞具有不同的特征核酸适配体分子识别谱。中国医学科学院开展了对肿瘤组织样本的核酸适配体筛选初步工作。这些工作为本项目针对食管癌、肝癌样品的核酸适配体筛选提供了理论与技术保障。在基于核酸适配体的蛋白质分离与定量检测方法方面:湖南大学、中科院长春应用化学所、南京大学等主要承担单位都是长期从事蛋白质研究的国内优势单位, 在核酸适配体生物传感技术、分子探针成像技术、纳米生物技术、生物微阵列分析、微流控芯片技术等诸多方面具有很强的综合研究能力。湖南大学在复杂多维数据分析、图谱解析与专家系统、知识库搜索与知识发现等化学计量学领域有很强的研究实力,曾获得国家自然科学二等奖，为核酸适配体分子图谱的解析及相关生物信息的发现与挖掘提供了理论与技术保障。中科院长春应用化学所、南京大学在核酸与蛋白界面组装、纳米技术、电化学、微电极系统方面研究成果丰硕，均曾获得国家自然科学二等奖，为蛋白质研究新方法的突破奠定了坚实的基础。在基于核酸适配体的蛋白质标志物发现方法方面: 主要承担单位之一的中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所是长期从事恶性肿瘤的基础与临床研究的国内优势单位, 是一个医疗服务辐射全国的大型肿瘤专科医院，具有丰富的临床资源，拥有丰富的癌组织、血清、癌细胞系储备，已获得了相关疾病的多个重要标志物和蛋白质靶标，建立了靶向治疗载体平台技术与相关动物模型，成功研究了多种抗肿瘤疫苗与药物。湖南大学谭蔚泓教授利用白血病筛选的核酸适配体，通过癌细胞特异性膜蛋白的富集与质谱分析，成功发现与鉴定相关癌细胞特异性膜蛋白标志物，相关成果连续在PNAS上发表，证明了本项目技术的可行性。通过本项目实施与多学科的交叉合作，可望为相关重大疾病标志物的发现提供新方法和技术平台，具有取得原始创新的重要研究成果与自主知识产权的关键技术突破的可能。在基于核酸适配体的癌症早期诊断方法方面：本项目一方面将核酸适配体技术与纳米技术、生物传感技术、分子成像技术等结合发展相关重大疾病个性化分子诊断新方法。另一方面，本项目提出将核酸适配体分子识别图谱方法用于癌症早期诊断与分子分型，这一自主创新的关键技术可在对恶性肿瘤等重大疾病蛋白质标志物、及肿瘤发生发展的分子机制尚不清楚的条件下，发展肿瘤特异性分子探针组，进而探索疾病发生、发展过程中蛋白质标志物的分子指纹与表达、变化模式，从而实现对应恶性肿瘤的个性化分子诊断与治疗。此外，基于核酸适配体分子识别图谱，也可以发现新的疾病标志物，进行新药开发和病变分子机理的基础研究。在此意义上，本项目的实施将可望为重大疾病早期诊断以及发生、发展机制的研究开辟新途径。总之，本项目给出的技术路线和研究思路充分考虑了原理与方法的可行性，既保证了创新性和预期成果的水平，又充分考虑了已有工作的基础，可保障研究目标的实现。因此，研究技术路线先进可行，已经具备了取得重大突破的条件。经过本项目的研究，可望在核酸适配体的筛选、蛋白质的分离与定量检测新方法、恶性肿瘤的蛋白质标志物的发现、癌症等重大疾病早期诊断等蛋白质研究的新技术与新方法方面取得重大突破。(五) 课题设置 本研究项目将以解决当前蛋白质研究中的瓶颈问题为总目标，围绕四个关键科学问题，发展基于核酸适配体的蛋白质研究的新方法、新技术。根据核酸适配体技术基础、理论基础、关键方法学与应用三个方面的研究内容与预期目标，设置四个课题:课题1 核酸适配体筛选新方法的基础研究课题2 基于核酸适配体的蛋白质定量检测新方法研究课题3 基于核酸适配体的蛋白质分离与富集新技术研究课题4 重大疾病蛋白质标志物发现的新方法研究如上图所示，这些课题既相对独立，又互相交叉。课题1是其它3个课题的基础，为课题2和课题3的实施提供理论指导与研究工具，也为课题4中蛋白质标志物发现提供新的技术依据和平台；课题2和课题3在课题1的指导下，以课题4涉及的目标为对象，建立高灵敏、高选择性、高通量的蛋白质分离与检测新方法，提供技术平台，并针对癌症早期诊断这一应用出口进行验证；课题4是课题1、2、3研究的外延与主要应用出口，主要开展蛋白质标志物发现的新方法与癌症早期诊断的核酸适配体分子识别图谱方法研究，该课题反过来也为课题1、2、3的实施提供物质基础。4个课题的研究成果可相互借鉴，同时课题2-4为课题1研究提供了验证，而课题4研究过程中，有可能发现新的蛋白质标志物，也将纳入到课题2、3中建立相关的分离与检测的技术平台。数个课题共同完成核酸适配体的分子识别机理、蛋白质分离与分析检测方法、蛋白质标志物发现与癌症早期诊断应用的研究。研究组成员通过联合研究，协同公关，优势互补，共同促进，有分工，有协作，体现了整体的团队精神。课题1 核酸适配体筛选新方法的基础研究参加单位： 湖南大学， 中国科学院化学研究所负责人：谭蔚泓教授学术骨干：俞汝勤院士，方晓红教授，蒋健晖教授，李继山副教授经费比例：28% 研究目标：发展细胞、组织等不同多蛋白质复合靶标体系核酸适配体筛选方法，通过化学合成、目标筛选、分子裁减、功能化衍生等手段，设计、合成并筛选具有独特优良性能的核酸适配体；研究这类复合体系核酸适配体的分子识别图谱；阐明核酸适配体的分子识别基础，为课题2与3中蛋白质定量检测与分离新方法的研究提供指导。主要研究内容： 1. 核酸适配体文库设计和筛选基础研究：合成含有20-60个随机碱基长度的系列高质量DNA和RNA文库；从随机文库中核酸结构的多样性、不同核酸高级结构与靶标结合力的差异、核酸二级结构冗余性与PCR扩增效率的序列特异性三个方面，对筛选过程中影响核酸适配体富集的因素进行系统研究，分析筛选过程中核酸适配体的进化规律，以保证筛选过程中文库结构的多样性和配体的无偏扩增，实现基于配体与靶标亲和力差异的核酸适配体高效进化。2. 复合靶标体系核酸适配体筛选方法：以细胞、组织等靶标为重点，通过优化筛选条件与流程，发展针对不同生物靶标的标准化筛选方法，建立高效的活细胞、组织体系的核酸适配体筛选平台。3. 核酸适配体分子识别性质研究：建立表征核酸适配体分子与生物靶标结合性质的各种谱学研究方法，表征筛选出的核酸适配体与靶标结合的亲和力和特异性，进行核酸适配体的二级结构分析和序列裁减；研究核酸适配体与靶标结合的构效关系，阐明核酸适配体的分子识别机制。通过分子模拟，建立核酸适配体分子识别的理论模型，指导核酸适配体分子探针的设计。4. 核酸适配体分子识别图谱研究：根据核酸适配体筛选与表征的结果，构建核酸适配体分子探针组合，分析核酸适配体组对大量不同肿瘤样品的分子识别图谱，建立肝癌、食管癌的核酸适配体组的分子识别模式。结合大样本的临床评价，进一步研究核酸适配体特征分子识别图谱用于相关肿瘤诊断的可行性，建立相关的诊断标准，探讨核酸适配体特征分子识别指纹图谱的早期诊断价值。课题2 基于核酸适配体的蛋白质定量检测新方法研究参加单位： 中国科学院长春应用化学研究所, 湖南大学, 苏州大学负责人：于聪教授学术骨干：董绍俊教授，刘庄教授，羊小海教授，聂舟副教授经费比例：23% 研究目标：以课题1筛选的核酸适配体及其分子识别基础研究为依据，将纳米技术、微阵列技术与核酸适配体技术相结合，引进高灵敏度的光、电、磁等传感技术，建立核酸适配体在各类界面的可控修饰技术，发展高灵敏、高通量、高选择性的蛋白质定量检测方法与传感器，并针对癌症早期诊断应用开展蛋白质标志物检测技术研究。主要研究内容：1核酸适配体的功能化与分子探针的制备：研究不影响核酸适配体特异性的化学修饰、标记、与组装方法，结合纳米生物技术，制备灵敏、简便、经济的核酸适配体分子探针。2. 基于核酸适配体的蛋白质检测新原理与新方法：设计构象互变型与链置换型荧光分子探针，发展均相、高通量的蛋白质检测新方法。利用核酸适配体修饰的纳米双色传感颗粒、光-磁复合纳米探针，发展细胞、组织、活体等水平的分子成像新原理与新方法，并开展癌症早期诊断应用研究。3. 基于核酸适配体的传感器构建基础研究：利用核酸适配体分子识别原理，以微纳技术为基础，综合运用各种纳米技术如自组装、原位沉积、物理插入、化学修饰等传感界面固定化方法，构建微纳结构传感界面，制作核酸适配体的微纳传感器、微阵列，并探索提高这些传感体系修饰的重现性与稳定性的方法，研究微传感结构界面仿生分子识别体系探针分子的负载量、空间取向与识别量的关系。4基于核酸适配体的蛋白质传感器技术：基于纳米金、量子点、硅纳米荧光粒子，介孔纳米材料、碳纳米管和磁性纳米粒子等，发展用于高灵敏生物传感的核酸适配体探针，基于核酸放大技术，发展微阵列检测中基于光、电、磁信号传导与放大的新方法；研制高灵敏的压电、阻抗、可视、荧光及表面等离子共振等无标记的蛋白质传感器，通过传感器综合优化，实现蛋白质的高通量、高灵敏、高选择性检测，并开展癌症早期诊断应用研究。课题3 基于核酸适配体的蛋白质分离与富集新技术研究参加单位： 南京大学，中国医学科学院，湖南大学负责人：许丹科教授学术骨干：练鸿振教授，张晓兵教授，余晓冬副教授，王小明副教授 经费比例：22% 研究目标：以课题1筛选的核酸适配体及其分子识别基础研究为依据，建立以微流控学与微纳米分离为基础的生物亲和分离技术；建立高容量、自动化、高度重复性的低丰度蛋白质的高效富集方法以及高丰度蛋白的无偏去除方法；通过泛素化、磷酸化、糖基化等翻译后修饰基团的核酸适配体，建立相关翻译后修饰蛋白组的选择性富集方法。同时，针对癌症早期诊断应用开展蛋白质标志物分离与鉴定技术研究。主要研究内容：1微纳米载体上核酸适配体负载技术：通过核酸适配体末端的生物素、巯基、氨基等化学修饰基团，利用微珠表面修饰亲合素、纳米金与羧基，发展对应的微纳米载体表面核酸适配体的固定技术。研究微球表面的核酸适配体的修饰密度，通过理论与实验分析其理论容量。2. 蛋白质微纳米分离技术：通过负载核酸适配体的微纳米颗粒，建立高丰度蛋白去除、低丰度蛋白富集的磁分离、离心分离、超滤分离、柱分离等技术。通过盐浓度、pH、温度、变性剂等条件的调节，考察核酸适配体吸附蛋白的洗脱与微珠的再生条件，研究提高蛋白质富集与去除的重现性的方法。3蛋白质富集的微流控芯片技术：制备PDMS的微流控芯片，通过在芯片上核酸适配体的固定与样品混合物的循环流动进行低丰度的蛋白质富集捕获。优化流路尺寸、核酸适配体固定模式，研究流路与流体控制对富集捕获效率的影响，实现低丰度蛋白质的高效率、自动化的富集，并开展癌症早期诊断应用研究。4. 蛋白质翻译后修饰的捕获富集技术：针对蛋白质磷酸化、泛素化、糖基化等免疫原性很低的翻译后修饰，设计磷酸化氨基酸、泛素与糖分子等靶分子体系，筛选翻译后修饰基团的核酸适配体，结合微流控学与微纳米分离技术，建立翻译后修饰蛋白组的捕获与富集方法。课题4 重大疾病蛋白质标志物的发现新方法研究参加单位： 中国医学科学院，苏州大学，中国科学院化学研究所负责人：马洁研究员学术骨干：宋咏梅副研究员，王成锋主任医师，刘祥军副研究员，彭睿副教授经费比例：27% 研究目标：以课题1、2、3的核酸适配体筛选及蛋白质分离与检测新方法为依据，筛选针对肝癌、食管癌的特异性核酸适配体分子，建立基于核酸适配体的肝癌、食管癌蛋白质标志物发现与甄别技术；同时，针对癌症早期诊断应用，建立用于肿瘤早期诊断和分型诊断的核酸适配体分子识别图谱，并为恶性肿瘤发生发展机制的研究提供新技术。主要研究内容：1. 不同来源肿瘤样本特异性核酸适配体图谱筛选：以食管癌、肝癌为例，利用细胞、组织等复合靶标以及相应的对照样品，筛选肿瘤特异性的核酸适配体分子。2蛋白质标志物的发现与验证：通过与病变体系特征的蛋白质标志物对应的核酸适配体分离与富集蛋白质标志物，并利用质谱与核磁谱技术鉴定相关的蛋白标志物。同时，利用基于核酸适配体的分子成像技术与流式细胞技术，开展标志物验证研究。3. 食管癌、肝癌的早期诊断和分型诊断：对大量早期食管癌、肝癌患者、健康对照人群血清样本检测，结合临床病历资料，探讨特异性核酸适配体作为恶性肿瘤早期诊断指标的价值。利用不同亚型和分期的食管癌、肝癌病理标本检测核酸适配体分子识别图谱在肿瘤分型诊断中的临床意义。将适用于分型诊断的核酸适配体用于血清样本的检测，评估其在早期恶性肿瘤患者分型诊断中的意义。4. 肿瘤发生发展的机制研究：以裸鼠为宿主，建立食管癌、肝癌裸鼠移植瘤模型，将癌细胞悬液皮下种植于裸鼠背部，待肿瘤生长一定体积后用于实验。利用活体成像方法考察所发展的核酸适配体探针对裸鼠接种成瘤后癌细胞的识别能力，通过在体、解剖和离体研究手段，考察肿瘤在裸鼠体内各脏器的分布及其随时间的变化情况，揭示肿瘤发生发展的分子机制。四、年度计划研究内容预期目标第一年系列DNA或RNA文库的合成；针对肝癌、食道癌相关蛋白的核酸适配体的初步筛选；肝癌食道癌细胞系、组织样品以及反筛选样品的制备。针对肝癌、食道癌细胞的核酸适配体初步筛选。以核酸适配体的分子识别效应与构象变化效应为基础，结合纳米生物技术，研究核酸适配体的非共价标记技术。探索基于各类集聚效应的信号传导新技术。开展适配体在微纳分离材料表面组装性质的研究，发展对应的微纳米载体表面核酸适配体的固定技术，开展适配体核酸碱基及分子结构的改造研究，系统研究多种固定载体与适配体仿生界面制备的规律；开展磁性微纳颗粒分离技术和新型适配体负载微纳米粒子材料的研究。发展通过细胞或组织筛选进行高通量的蛋白质标志物发现的新方法设计与合成5个DNA或RNA文库；初步富集到可识别肝癌、食道癌相关蛋白的核酸适配体库一个；初步富集到可识别肝癌、食道癌细胞的核酸适配库2个。构建基于非共价标记的核酸适配体分子探针。实现适配体在微纳材料表面的高效结合，为适配体仿生识别界面的建立提供理论指导和有效方法。建立快速、高效的磁性分离平台，建立低丰度蛋白的快速富集与检测技术。建立基于核酸适配体的蛋白标志物富集与鉴定方法。第二年克隆与表征特异性识别肝癌、食道癌相关蛋白及癌细胞的核酸适配体，进行结构分析与冗余序列的剪裁，进行识别机理的研究；进一步筛选针对肝癌、食道癌组织和血清样品的核酸适配体。进一步发展以纳米材料为依托的非标记核酸适配体传感技术，以小分子探针的集聚效应等为基础，发展基于核酸适配体的蛋白质检测新方法。探索基于光、电、磁的高效响应信号传导、放大新方法。开展适配体微流控芯片的研究，研究流路与流体控制对富集捕获效率的影响。开展适配体亲和色谱柱的研究，以筛选出的新适配体为亲和识别分子，开展适配体亲和电泳/色谱分离方法的研究。开展适配体微纳米材料分离细胞的研究。通过考察核酸适配体对大量食管癌、肝癌的细胞、组织及血清识别行为，系统评价所获得的核酸适配体对恶性肿瘤的特异性。将课题一筛选得到的核酸适配体用于食管癌、肝癌等蛋白标志物的发现。获得2-3种特异性识别肝癌、食道癌相关蛋白核酸适配体；获得3-4种特异性识别肝癌或食道癌细胞和组织的核酸适配体。利用核酸适配体与靶蛋白结合时的构象互变性质，发展非标记的蛋白质核酸适配体分析方法。利用荧光纳米颗粒等纳米材料具有稳定性好、信号强度高等优点，构建核酸适配体荧光探针，以解决微量蛋白质检测时高灵敏信号的获取问题。制备出适配体修饰的微流控芯片，实现低丰度蛋白质的自动化富集功能。研制可供蛋白质富集或去除的亲和色谱柱。建立基于适配体辅助分离与检测的蛋白质分析新方法。验证所获得的核酸适配体对肝癌、食管癌的特异性。发现一批食管癌、肝癌等蛋白标志物。第三年克隆与表征特异性识别肝癌、食道癌组织和血清的核酸适配体，进行结构分析与冗余序列的剪裁，进行识别机理的研究；对不同层次的核酸适配体筛选方法进行优化与总结，建立相应的标准化筛选平台；探讨核酸适配体的富集规律以及核酸适配体的分子识别机理。发展多种基于核酸适配体的蛋白质灵敏、方便的检测分析新技术。利用小分子探针、电化学阻抗、荧光共轭聚合物等开展基于适配体的传感器构建基础研究。利用各种信号放大技术发展基于适配体的蛋白质分析响应信号放大技术。研究不影响核酸适配体特异性识别功能的化学修饰与标记技术。开展适配体磁性颗粒对高丰度蛋白的去除研究；建立筛选针对磷酸化氨基酸、泛素与糖分子等靶分子的适配体筛选体系；开展适配体富集与分离多个肿瘤标志物的研究；开展肝癌与食道癌相关低丰度蛋白的核酸适配体分离与检测研究。结合质谱、核磁等蛋白质分析技术进行相关蛋白组的鉴定。获得3-4种特异性识别肝癌或食道癌细胞和组织的核酸适配体；建立蛋白、细胞组织筛选的三个层次的核酸适配体筛选平台；为其他课题提供核酸适配体以及高效率的筛选平台。发展无须分离直接在均相溶液中灵敏、快速、实时地检测混合组分中靶标的信号核酸适配体。制备灵敏、简便、经济的核酸适配体分子探针。建立高丰度蛋白质去除的分离最佳条件；筛选出翻译后修饰蛋白质修饰分子的适配体；实现适配体多个标志物蛋白质分离富集的功能。验证发现的食管癌、肝癌等蛋白标志物。第四年进一步克隆、表征筛选得到核酸适配体，并进行相关的结构与识别机理的研究；考察所筛选的核酸适配体对不同肝癌和食道癌的识别特异性，初步构建核酸适配体组；开展肝癌与食道癌的核酸适配体识别指纹谱的初步研究。深入研究各种响应信号的传导与放大技术，提高核酸适配体传感器的抗干扰能力，发展基于逻辑门技术、微阵列技术、表面等离子体共振等的核酸适配体高灵敏、高特异性生物传感技术。结合翻译后修饰蛋白质修饰分子适配体筛选成果，研究对修饰蛋白质的富集分离；以微流控芯片为分离平台，研究多流路高通量适配体亲和分离方法和材料，探索研究基于蛋白质靶标的肿瘤细胞微流控分析技术平台。 研究肿瘤发生发展的机制研究。获得8-20种特异性识别肝癌、食道癌相关蛋白、细胞、组织和血清的核酸适配体；考察5-10种识别肝癌的核酸适配体对不同肝癌的识别特异性，构建肝癌识别的核酸适配体组；考察5-10种识别食道癌的核酸适配体对不同食道癌的识别特异性，构建肝癌识别的核酸适配体组。制备高灵敏、高选择性、抗干扰能力强的核酸适配体蛋白质传感器。研制应用于修饰蛋白质富集的微纳米颗粒，实现无偏型蛋白质富集与分离；以微流控芯片为分离平台，建立肿瘤细胞微流控分析技术平台。 利用动物模型研究肿瘤发生发展的机制。第五年开展肝癌与食道癌的核酸适配体识别指纹图谱的研究，课题4合作建立不同病变体系的核酸适配体特征分子识别图谱，通过对大量样品进行核酸适配体特征分子识别图谱的评价与优化，通过特征提取算法进一步精简模型的描述变量，最终确定具有肝癌或食道癌的个性化诊断价值的核酸适配体组合以及识别模型。进一步提高适配体传感器的抗干扰能力，努力实现实际生物、临床样品的检测和分析。采用筛选出的核酸适配体实现对修饰蛋白质的共性富集， 结合微流控学与微纳米分离技术，建立翻译后修饰蛋白组的捕获与富集方法。利用临床大样本对大量早期食管癌、肝癌患者、健康对照人群的血清样本进行检测，结合临床病历资料，探讨核酸适配体作为恶性肿瘤早期诊断指标的价值。完善针对肝癌和食道癌的核酸适配体组；分别建立针对不同肝癌和食道癌的核酸适配体识别指纹图谱库；初步建立具有肝癌或食道癌的个性化诊断价值的核酸适配体识别模型。以血清学检验为目标，建立蛋白质高灵敏、高通量检测的生物传感新技术，并用于生物、临床样品的检测和分析。实现无偏性适配体的蛋白质组学应用研究，探索适配体在蛋白质磷酸化、泛素化与糖基化功能研究中的作用；建立具有共性化富集与个性化检测的新方法。完成核酸适配体分子识别体系在癌症早期诊断中的临床意义评估。一、研究内容本项目将主要进行以下四方面研究：核酸适配体筛选新方法的基础研究；基于核酸适配体的蛋白质分析检测技术研究；基于核酸适配体的蛋白质分离与富集新技术研究；基于核酸适配体的恶性肿瘤蛋白质标志物发现的基础研究。即一个筛选平台，三个蛋白质研究应用方向。1核酸适配体筛选新方法的基础研究：主要包括高效的筛选技术平台的建立、适配体筛选过程的进化理论研究以及核酸适配体分子识别图谱方法的建立。首先，将以发展细胞与组织筛选法为主，根据项目中肝癌、食管癌等恶性肿瘤疾病研究的需要，建立针对蛋白质、细胞、组织、血清等多层次靶标的快速、高效的核酸适配体筛选方法；根据复杂靶标体系的特点，建立负筛选中对照体系的选择与适配体特异性评价的系统性方法，为各课题的实施提供核酸适配体筛选技术平台。同时，对筛选过程存在的基本问题如核酸文库的设计、筛选流程的优化、配体进化的统计分布、配体高级结构的分子模拟、配体筛选进程中二级结构多样性等进行系统的研究，了解核酸适配体进化的基本规律，为其高效筛选提供理论指导。研究如何利用筛选得到的核酸适配体分子组，获得甄别病变体系特征的核酸适配体分子识别图谱，并探讨核酸适配体特征分子识别图谱的早期诊断价值。这部分将设一个课题。2基于核酸适配体的蛋白质分离检测技术研究将包括两个方面的内容，设二个课题：研究基于核酸适配体的蛋白质定量检测新方法，主要包括核酸适配体与蛋白质识别的分子基础的研究及蛋白质定量检测方法两个方面。将建立核酸适配体与蛋白质相互作用的谱学研究方法，结合蛋白质与核酸高级结构的分子模拟与对接分析，阐明核酸适配体的分子识别机理，并为研究基于核酸适配体的蛋白质分离与检测的新原理提供理论与技术依据。