生物分离技术自己整理的笔记.doc

分派系数m：式中，cs和cm分别为组份在固定相和流动相中的浓度。m类型：A、B型曲线是一条典型的吸附等温线，吸附色谱法属于这类曲线。C和D型吸附等温线很少碰到。C曲线为线性分派等温线。线性色谱：溶质浓度低时，m为常数时的色谱意义：容易理解，溶质流过色谱柱时，m大的组份通过色谱柱所需要的时间长，m小的组份需要的时间短；当样品中各组份在两相的m不同时，就能实现差速迁移，达成分离的目的。按原理分类(P122 掌握)吸附等温线当吸附剂与溶液中的溶质达成平衡时，其吸附量q*同溶液中溶质的平衡应与温度有关。 当温度一定期，吸附量只和浓度有关，q* = f(c) - 吸附等温线。A)、Henry type在一定温度下，平衡时吸附剂吸附溶质浓度q*与液相溶质浓度c之间的关系为线性函数：m为分派系数。适应条件：在低浓度范围之内成立。当浓度较高时，上式无效。B)、Freundlich type其经验公式为其中，k和为常数，一般在0.1-1之间。 当吸附剂对溶质的吸附作用非常大的时候，也许小于0.1，此时游离浓度对吸附浓度的影响很小。 Freundlich等温线可以描述大多数抗生素、类固醇、甾类激素等在溶液中的吸附过程。C)、Langmuir type当吸附剂对溶质的吸附作用非常大时，这时存在 0.1 ，或用前式表达Kb非常大，这时游离的溶质浓度对吸附浓度影响极小，接近不可逆吸附。D)、Rectangle type如在固定化单克隆抗体的免疫亲和吸附中，一般存在0.1。1.塔板理论（plate theory）塔板理论的假设： (1) 在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达成； (2) 将载气看作成脉动（间歇）过程； (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略； (4) 每次分派的分派系数相同。l n称为理论塔板数(theoretical plate number)。与精馏塔同样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增长而增长，随塔板高H的增大而减小。n与半峰宽及峰底的关系式为: 式中tr(或Y1/2)应采用同一单位(时间或距离)。上式示：在tR一定期，假如色谱峰越窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。l 在实际工作中，按上式计算出来的n和H值有时并不能充足地反映色谱柱的分离效能，由于采用tR计算时，没有扣除死时间tM，所以，常用有效塔板数n有效表达柱效： 有效塔板高为： 例2 已知一根1米长的色谱柱的有效塔板数为1600块，组份A在该柱上的调整保存时间为100秒，试求A峰的半峰宽及有效塔塔板高度。塔板理论的特点和局限性(1)当色谱柱长度一定期，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分派的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。(2)不同物质在同一色谱柱上的分派系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表达被分离组分的实际分离效果，当两组分的分派系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气(流动相)流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。l 速率方程（也称范.弟姆特方程式）-影响柱效的因素他们吸取了塔板理论中塔板高的概念，并同时考虑影响塔板高的动力学因素，指出：谱峰扩宽受三个动力学因素的控制，即涡流扩散，分子扩散项，传质阻力项。这样, 上述塔板高方程表达 H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度， u：载气的线速度(cm/s)l A涡流扩散项A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。l B/u 分子扩散项B = 2 Dg ：弯曲因子，填充柱色谱，1。 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1） (1) 存在着浓度差，产生纵向扩散; (2) 扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差; (3) 分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散; (4) 扩散系数：Dg (M载气)-1/2 ； M载气，B值。l Cu 传质阻力项传质阻力涉及气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即： C =（Cg + CL）载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的重要因素，流速，柱效。载气流速低时： 分子扩散项成为影响柱效的重要因素，流速,柱效 。l 速率理论的要点1)组分分子在柱内运营的多途径与涡流扩散、浓度梯度所导致的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分派平衡不能瞬间达成等因素是导致色谱峰扩展柱效下降的重要因素。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4) 各种因素互相制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有助于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才干使柱效达成最高。分离度也称分辨度。它是指相邻两色谱保存值之差与两峰底宽平均值之比，即一般来说，当Rs 1.5时，两峰才干完全分离。当然，更大的Rs值，分度效果会更好，但会延长分析时间。运用上式，可以直接从色谱图上计算分离度。但该式没有体现影响分离度的诸因素。而下式清楚地指出了，分离度受柱效n、选择性和容量因子k三个参数的控制：意义：第一，增长塔板数，可以增长分离度，若通过增长柱长来增长塔板数，就会延长分析时间。所以，设法减少塔板高H，才是增大分离度的最佳方法。第二，加大容量因子可以增长分离度，但是会延长分析时间，至导致谱带检测困难。一般来说，当k 10时，分离度的提高并不明显；而当k 2时，即使在很短的时间内，组份也会完全分离。当a 1时，要完毕分离，必须增长柱长，延长分析时间。例如，为了达成同样的分离度，当a = 1.01时，所需的时间是a = 1.1时的84倍。显然，当a = 1时，无论如何提高柱效，加大容量因子等，Rs均为零。在这种情况下，两组份的分离是不也许的。液相色谱l 凝胶色谱l 排阻极限（exclusion limit） 凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩 散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。 例如Sephadex G50的排阻极限是30 kD, 即相对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝胶网络中，其洗脱体积为V0。l sephadex葡聚糖凝胶 G-25(50,75,100,100)的粒度的选择：组别分离时，选用孔径小的颗粒，虽然分辩率低，但由于组分的Kd值差异大，也能得到较好的分离。分级分离时，以孔径大的凝胶为主，并且规定颗粒大小均匀，以保证较高的分辩率。l 分子筛操作中的注意点 上样体积要足够的小（一般为整个柱体积的15），样品中可以具有一定的盐成分（脱盐柱），柱子要有合适的长度。 洗脱一般为无梯度的洗脱。 针对分离的目的和样品的特性要选用不同特性的色谱柱（各个厂家会有说明其合用的分子量范围），以达成最佳的分离效果。 分子筛也常用来测定蛋白的亚基装配方式及全分子量的测定。缺陷优点操作简便回收率高分离条件温和应用广泛 合用于生物大分子的初级分离，脱盐选择性低，料液解决量低产品被稀释脱盐 生物大分子溶液的脱盐，以及除去其中的低相对分子质量物质。l 树脂类：Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A ; Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N,N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶离子互换色谱（IEC）定义：运用离子互换剂为固定相，根据荷电溶质与离子互换剂之间静电互相作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。荷电溶质在离子互换剂上的分派系数： m(I)A/IBm I：流动相的离子强度； m：为离子强度无限大时溶质的分派系数，是静电互相作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子互换剂上的分派； 常数A和B为pH的函数；B：溶质的静电荷数与离子互换基的离子价数之比。蛋白质为多价电解质，在pH偏离等电点的溶液中净电荷数常为两位数以上，故B值比较大。l IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用线性梯度洗脱法、逐次洗脱法。l 离子互换层析的基本环节：平衡、上样吸附、洗脱、再生1. 层析柱平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要2. 样品进柱 为了达成满意的分离效果，进样量一般为介质互换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高l 样品总量不应超过柱的结合容量,上样体积一般无特殊的限制。缺陷优点IEC的操作变量远多于GFC，影响分离特性的因素非常复杂。解决量大，浓缩，高速；选择高，所需柱长较短；回收率高；离子互换剂种类多，价格也远低于亲和吸附剂。疏水性互相作用层析（HIC）定义：是运用表面偶联弱疏水性基团(疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性互相作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。l 配基修饰密度过小则疏水性吸附作用局限性，密度过大则洗脱困难。l 疏水性互相作用层析的应用及特点1. 互补工具：HIC重要用于蛋白质类分离纯化，虽然HIC不如IEC的应用广泛，但可以作为IEC的互补工具。如方法得当，HIC与IEC的分离效率相称。2. 与盐析衔接：由于在高浓度盐溶液中疏水性较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。3. 可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可根据目的产物的性质选择适当的吸附剂。4. 疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子互换剂相称。反相层析（RPC）定义：运用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法。l 前述HIC同样，RPC中溶质也通过疏水性互相作用分派于固定相表面，但是RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性。因此，必须采用极性有机溶剂（如甲醇、乙氰等）或其水溶液进行溶质的洗脱分离。l RPC重要用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活。所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。 l 因此RPC多采用减少流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。l 分离能力：SECHICIECRPC使样品变性的趋势：SECIECHICRPC1. 液相色谱按分离机制分为那几大类？2. 简述柱层析系统的工艺流程。3. 何谓保存值、分派容量K、分离度？4. 何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？5. 简述IEC的工作原理？6. 简述凝胶色谱的工作原理？7. IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用线性梯度洗脱法（linear gradient elution）、逐次洗脱法（stepwise elution）,为什么？思考题1. 液相色谱按分离机制分为那几大类？2. 简述柱层析系统的工艺流程。3. 何谓保存值、分派容量K、分离度？4. 何为理论塔板高度和理论塔板数？如何计算？5. 简述IEC的工作原理？6. 简述凝胶色谱的工作原理？7. IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用线性梯度洗脱法（linear gradient elution）、逐次洗脱法（stepwise elution）,为什么？第二章 发酵液预解决l 发酵液预解决目的1. 便于固液分离黏度大的悬浮液，不宜过滤 目的产物在发酵液中的浓度通常较低 成分复杂，固体粒子可压缩性大，悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大2. 除去部分杂质和改变发酵液的过滤性能l 发酵液预解决的内容：1. 发酵液杂质的去除，涉及除去蛋白质、无机离子、色素、热原、毒性物质等；2. 改善培养液的解决性能，重要是通过减少黏度、调节适宜的pH值和温度、絮凝和凝聚等操作来实现。无机离子的去除高价无机离子，如Ca2+、Mg2+、Fe3+等的存在，会影响离子互换树脂对生物活性物质的互换容量。1. 钙离子的去除 加入草酸，生成草酸钙，沉淀去除。 草酸与镁离子结合生成草酸镁，去除Mg2+ 草酸酸化发酵液，改变其胶体状态，有助于目的产物转入液相。 在用量大时，可用其可溶性盐。 反映生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液质量。2. 镁离子的去除 可加入三聚磷酸钠，形成络合物。 还可用磷酸盐解决，大大减少钙和镁离子。3. 铁离子的去除 一般用黄血盐去除，形成普鲁士蓝沉淀。可溶性蛋白质的去除 杂蛋白的存在，对分离纯化会产生三种影响 减少离子互换法和大网格树脂吸附法的树脂吸附能力 在用有机溶剂或双水相萃取时，会产生乳化现象； 常规过滤及膜过滤，会污染滤膜。 去除方法重要有：盐析法、等电点沉淀法、加热法、有机溶剂沉淀法、吸附法、其他沉淀法。盐析法水溶性蛋白质溶液是亲水胶体体系，其分子与水有很大的亲和力。水化层和双电层是胶体体系稳定的必要条件。离子半径小而带电荷较多的阴离子盐析效果比较好，含高价离子的盐比1-1价型盐的盐析效果好。 硫酸铵是使用最普遍的盐，硫酸钠和氯化钠也常用于盐析。 等电点沉淀法在等电点状态时，所带电荷为0。处在等电点时，蛋白质分子之间的静电排斥力最小，使它失去了作为胶体体系稳定的基本因素，迅速结合成聚集体，极易沉淀析出。等电点沉淀一般在低离子强度和pH值约为等电点的条件下进行。等电点沉淀法一般多用于疏水性较大的蛋白质。与盐析沉淀法相比，等电点沉淀省去了后续的脱盐操作。有机溶剂沉淀法 有机溶剂的加入，使蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化限度减少，即破坏蛋白质胶体的水化膜，同时也可减少溶液的介电常数，导致蛋白质分子间的静电引力增大，产生凝聚和沉淀。 在低离子强度和等电点附近，较易生成沉淀，所需有机溶剂用量较少 蛋白质分子量越大，有机溶剂沉淀越易进行，所需有机溶剂用量越少 由于有机溶剂易引起目的蛋白变性，沉淀必须在低温下进行。只合用于解决量较少的情况。吸附法 杂蛋白可以被某些吸附剂或沉淀剂吸附除去。 运用黄血盐和硫酸锌的协同作用，生成亚铁氰化锌钾胶状沉淀来吸附蛋白质，应用于四环素类抗生素的生产中。发酵液解决性能的改善 1. 减少发酵液的黏度 减少液体黏度可提高过滤速率。 常用方法有加热法和加水稀释法。2. 调节pH值 pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，通过调节pH值可改善其过滤特性。3. 絮凝采用细胞絮凝技术，可增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速率，再结合其他的预解决方法减少发酵液黏度，就能采用普通过滤方法，简朴有效地实现固液分离。絮凝和凝聚的区别 絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。凝聚是指在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的减少（或由于微粒所带电荷被加入的带有相反电荷的高价离子中和），而使胶体体系不稳定，微粒互相黏着在一起的现象。细胞絮凝的种类 按是否添加絮凝剂分为两类：（1）自身絮凝 酵母细胞产生絮凝，由细胞表面蛋白和酵母细胞外壁的甘露聚糖结合所引起。（2）絮凝剂絮凝：从化学结构看，重要分为三类：高聚物、无机盐、有机溶剂和表面活性剂。根据活性基团在水中解离情况，可分为非离子型、阴离子型（含羧基）和阳离子型（含胺基）。l 高聚物絮凝剂具有长链状的结构，运用长链上的活性基团，通过静电引力，形成桥架连接，从而生成菌团沉淀。l 微生物絮凝剂：微生物在代谢过程中所分泌的特殊的高分子产物，能使液体中不易沉降的固体颗粒、菌体细胞及胶体粒子等凝集沉降。重要成分是多糖、糖蛋白、蛋白质和核酸。壳聚糖就是其中一种。l 蛋白质为主的絮凝剂对温度变化敏感，多糖组成的絮凝剂则热稳定好。絮凝机理与动力学絮凝机理：（1）胶体理论（2）高聚物架桥理论（3）双电层理论絮凝动力学 絮凝初期，颗粒聚并快，此时搅拌应剧烈些；絮凝后期，颗粒聚并速度变慢，搅拌速率应减少。 增长颗粒（细胞）的浓度，有助于聚并絮凝。 加大搅拌，增长速率梯度，有助于颗粒聚并；但搅拌速率过大时，剪切力会导致絮凝体破裂。絮凝的优化影响絮凝效果的因素：1) 絮凝剂浓度： 浓度增长有助于架桥充足，但是过多的加量会引起吸附饱和，絮凝剂争夺胶粒而使絮凝团的粒径变小2) 絮凝剂分子量： 分子量提高、链增长，可使架桥效果明显，但分子量不能超过一定的限度，由于随分子量提高，高分子絮凝剂的水溶性减少，因此，分子量的选择应适当。3) 絮凝剂类型：4) 溶液的pH：溶液pH的变化会影响絮凝剂功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，链节上相邻离子基团间的电排斥作用，使分子链从卷曲状态变为伸展状态，架桥能力提高。5) 搅拌速度和时间6) 助凝剂思考题 为什么要进行发酵液预解决？解决的目的及内容分别是什么？ 发酵液金属离子的去除方法分别有哪些？杂蛋白去除的方法和机理分别是什么？ 发酵液解决性能的改善有哪些方法？ 有哪些絮凝剂可以使用？ 影响絮凝效果的因素？第三章 固液分离技术固液分离的方法有分离筛、悬浮分离、重力沉降以及离心和过滤等。用于发酵液固液分离的重要是离心和过滤1. 过滤：运用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮物中的固体颗粒，从而实现固液分离的方法。 深层过滤 深层过滤所用的过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭和塑料颗粒等，过滤介质填充于过滤器内形成过滤层。过滤介质起重要作用。合用于固体含量少于1g/L、颗粒直径在5-100m的悬浮液。 滤饼过滤 滤饼过滤的过滤介质是滤布。悬浮液通过滤布时，固体颗粒被阻拦形成滤饼，滤饼起重要过滤作用。合用于固体含量大于1g/L的悬浮液。 按过滤推动力的不同，滤饼过滤又分为常压过滤、加压过滤和真空过滤三类。过滤理论（1）过滤速率：单位时间内通过过滤面积的滤液体积，又称滤液的透过速率。（2）滤饼阻力 发酵液过滤的滤饼比阻与一般的可压缩滤饼不同。当滤饼中所含固形物浓度达成一定的界线时，比阻会忽然升高，过滤速率会迅速下降，甚至不能过滤。 对于不可压缩性滤饼，比阻值为常数。但对于可压缩性滤饼滤饼的比阻值是，是操作压力差的函数，随操作压力差的提高而增大的。因此开始过滤时应注意不能不久提高压差，通常靠液柱的自然压差进料，并应缓慢地逐步地升高压力。过滤速率的影响因素 影响过滤速率的因素重要有两个： （1）过程的推动力 真空过滤最大真空度一般在85kPa以下； 加压过滤的压力差一般在500kPa以下。 （2）过滤阻力 与悬浮液的性质有关，黏度越大越不利于过滤 与过滤介质和滤饼的性质有关，滤饼阻力是由菌种和发酵条件决定。改善过滤性能的方法 （1）絮凝 （2）加助滤剂： 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒。工业上常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、白土、炭粒、淀粉等。助滤剂可预先涂在过滤介质表面;厚2mm;也可直接加入发酵液中，用量约等于悬浮液中固体含量，滤速最快。助滤剂的种类应根据目的产物、过滤介质来拟定，粒度必须与悬浮液中固体粒子的尺寸相适应。（3）加入反映剂 加入不影响目的产物的反映剂； 反映剂之间能互相或能和发酵液中的杂质反映，生成不溶性沉淀，从而那你呢提高过滤速率。 假如发酵液中具有不溶性多糖，过滤前最佳用酶将其转化为单糖。过滤设备及选择常用的过滤发酵液的设备重要有板框过滤机、加压叶滤机和鼓式真空过滤机三类。膜过滤和微滤 膜分离是运用品有一定选择透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化，过程的实质是物质通过膜传递速率不同而得以分离，过程近似于筛分。 经预解决的发酵液为悬浮液，可使用微滤进行固液分离离心原理 依靠惯性离心力的作用而实现的沉降过程。合用于两相密度差较小，颗粒粒度较细，在重力场中的沉降效率很低的非均相体系。区带离心： 可分为差速区带离心和平衡区带离心。两种区带离心的共同之处是：离心之前要先用某种低分子量溶液（如蔗糖溶液）调配好密度梯度，然后将待解决的料液加在已形成密度梯度的溶液之上，进行离心。平衡区带离心与差速区带离心的不同之处：其密度梯度比差速区带离心的密度梯度大。离心操作后，料液中的高分子溶质在与其自身密度相等的溶剂密度处形成稳定的区带，区带中的溶质浓度以该处密度为中心，呈高斯分布。思考题1. 固液分离的方法有哪些？其原理分别是什么？2. 生物产业过滤和离心分离常用的设备是什么？3. 改善过滤过程的方法有哪些？第四章 细胞破碎和分离提取技术细胞破碎技术：运用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内物质涉及目的产物成分释放出来的技术。l 机械方法破碎： 涉及珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波法等。优点：a) 解决量大，速度快，时间短，效率高，是工业规模细胞破碎的重要手段。b) 细胞受到挤压、剪切和撞击作用。c) 机械搅拌产生热量，破碎需冷却。（1）珠磨法细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻璃小珠、石英砂、氧化铝（d1mm）一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间互相碰撞、剪切，使细胞达成某种限度破碎，释放内含物。优点：操作简便稳定、破碎率可以控制、易放大。特别合用于有大量菌丝体的微生物和一些有质地坚硬亚细胞器的微生物。（2）高压匀浆法运用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于忽然减压和高速冲撞导致细胞破裂。在高压匀浆器中，细胞经历了高速导致的剪切、碰撞和从高压到常压的突变，从而导致细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放。优点：操作参数少，且易于稳定；操作时样品损失量少，合用于酵母和大多数细胞。l 对于易堵塞的团状或丝状真菌及一些易损伤匀浆阀、质地坚硬的亚细胞器一般不合用。具有包涵体的基因工程菌也不宜该设备。（3）超声波破碎法 原理：运用频率高于20kHz的超声波在水中传播，产生能释放巨大能量的激化和突发，即空穴作用。空穴作用产生的空穴泡由于受到超声波的冲击而闭合，从而产生一个高达数百个大气压的冲击力压力，由此引起悬浮细胞上产生剪切力，使细胞液体产生流动而破碎细胞。优点：解决少量样品操作方便，液体损失量少，破碎率高。缺陷：有效能量运用率极低，产生大量的热，操作需在冰水中进行或通入冷却剂，不易放大，不适于大规模操作，实验室小规模破碎常用。细胞物理破碎方法(1)渗透压冲击法先将细胞放在高渗介质中，达成平衡后，介质被忽然稀释，或者将细胞转入低渗溶液中。由于渗透压的忽然变化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞，引起细胞壁和膜膨胀破裂，从而将产物释放出来。l 合用于破碎易破细胞或细胞壁预先经酶解决的细胞，以及合成受克制而强度减弱的细胞()冷冻-融化法通过水结晶的形成和随后的融化而使细胞破碎的方法。细胞化学法破碎（1）碱解决： pH11.5-12.5碱解决细胞20-30min可导致细胞溶解。l 易破坏蛋白的活性，使蛋白失活。(2) 酸热法运用盐酸对细胞壁中的某些成分（重要是多糖和蛋白）的水解作用，改变其空间结构，使本来结构紧密的细胞壁变得疏松，同时经沸水浴解决，导致细胞膨胀并加速水解，破坏胞壁结构，使得内含物释放。化学试剂法(1) EDTA EDTA可解决革兰氏阴性菌（E.coli），对细胞的外层膜有破坏作用。解决其它革兰氏阴性菌，可提高通透性。(2)有机溶剂法异丙醇解决酵母细胞释放超氧化物歧化酶。()表面活性剂 表面活性剂或多或少地溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞渗透作用增强。生物破碎法: 运用酶反映分解、破坏细胞壁上特殊的化学健而达成破壁的目的，又称酶溶法。常用的溶酶有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等l 溶菌酶对细菌类细胞有效，重要是革兰氏阳性菌超临界细胞破碎技术超临界流体是指温度和压力处在临界条件之上的流体，它具有类似于气体的低黏度和类似于液体的高密度，有较好的流动性、传质性能和溶解性能。选择性释放目的产物的一般原则仅破坏或破碎存在目的产物的位置周边(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目的产物释放率条件下，减少细胞的破碎限度。思考题 1. 珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法分别是什么原理？常用什么设备？ 2. 选择破碎方法的原则？ 3.酶溶法的原理是什么？对细菌和酵母分别常用什么酶？革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，不久就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为重要成分，所以也能采用溶菌酶。酵母和真菌由于细胞壁的组分重要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的重要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。细胞破碎后，细胞碎片的分离是一个难题，以下为细胞碎片分离的有效方法。双水相分离技术因两种水溶性聚合物的水溶液，或一种水溶性聚合物水溶液与盐溶液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统。双水相萃取的特点： 具有特殊的物理性质：含水量高（75%-90%），两相界面张力极低（10-7-10-4mN/m），相间密度差低，这有助于保持生物活性和强化相间的物质传递。 分相时间短（5-15min） 萃取环境和条件温和 生物相容性好，有时有稳定作用 分派系数可控，容易放大 大量杂质可以与固体物质一起去除缺陷和局限性 双水相系统含较高浓度的水溶性聚合物和盐，会带到产物中，去除需要辅助解决方法 成本较高。 选择性较低，分离纯化倍数低，一般只合用于粗分离具体操作： 萃取：适量的细胞匀浆液与双水相体系（一般为PEG/盐）混合。 上下相的分离：在萃取达成平衡后，就必须使上下相分离。有两种方法：重力沉降和离心分离。 多聚物的分离：当目的蛋白是分派在PEG富集的上相中（细胞或细胞碎片所有分派在下相中，只有目的产物分派在上相中），相与相分离后，在上相中加入盐，形成新的双水相体系，在适当的条件下，蛋白质重新被萃取进入盐相，而大量的PEG得到回收，盐相中残余的PEG可用超滤或透析除去。膨胀床分离技术膨胀床吸附技术（EBA或EB）,亦称扩张床吸附。膨胀床吸附集澄清、浓缩和初步纯化于一体的分离纯化技术，它兼具流化床和填充床吸附的优点，既能比较容易地让固体颗粒通过填料层，又可以填充床的模式来吸附目的产物。膨胀床的操作按顺序可分为五个部分:(1)平衡、(2)吸附、(3)冲洗、(4)洗脱和(5)在位清洗。泡载分离技术泡载分离又称为泡沫分离，根据表面吸附的原理，运用通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体，对液相中的溶质或颗粒进行分离。待分离物质自身具有表面活性(如表面活性剂) 泡沫分离的优点：1）特别适合于对低浓度的产品进行分离；2）分辨率高，可浓缩表面活性高的成分；3）富集率高；4）运营成本低；5）操作简便。 缺陷：表面活性剂难以回收，消耗量大，返混现象影响分离效率，稳定性差，浓度难以控制。思考题 1.双水相去除细胞碎片分离目的产物的原理和一般过程？ 2.膨胀床的概念？膨胀床吸附分离的特点和原理是什么？一般的操作过程？ 3.何谓泡沫分离技术？其原理是什么？ 4.比较双水相分离技术、膨胀床分离技术和泡沫分离技术的优缺陷。第六章 沉淀和膜分离技术沉淀分离技术 （重要涉及有机溶剂沉淀、盐析、高聚物沉淀和聚电介质沉淀、等电点沉淀等。）l 沉淀是指在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度减少，形成固相从溶液中析出从而达成分离的一种技术。 优点：过程简朴，成本低，原料易得，便于小批量生产，在产物浓度越高的溶液中沉淀越有利，收率越高 缺陷：过滤困难，对于复杂产品体系，分离度不高，产品质量较低，需重新精制。重要涉及有机溶剂沉淀、盐析、高聚物沉淀和聚电介质沉淀、等电点沉淀等。l 沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中溶解度不同而达成分离的目的。有机溶剂沉淀法的原理： 有机溶剂沉淀是指在溶液中加入极性有机物（如甲醇、乙醇、丙醇等），使溶质从溶液中沉淀析出，达成分离的目的。有机溶剂沉淀法机理*A 减少溶剂介电常数（介电常数D有机 D水），使蛋白质或酶分子间静电引力增大，因互相吸引而聚合沉淀。*B 破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周边的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，使蛋白质沉淀。*C 疏水基团暴露：有机溶剂也许破坏蛋白质的某种键，使疏水集团暴漏。有机溶剂沉析剂选择依据：水溶性要好、介电常数要小(致变性作用要小（甲醇）(毒性要小、挥发性适中、容易获取沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂有机溶剂沉淀法的影响因素温度： 有机溶剂沉淀一定要在低温下进行 pH值 样品浓度：样品较稀时，将增长有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增长共沉作用 。一般认为蛋白质的初浓度以0.52为好，多糖则以12较合适。 中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有助于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.010.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐；l 缺陷是：1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作规定在低温下进行。3）成本高 4）易燃溶剂盐析沉淀法在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度减少，产生沉淀的过程。盐析法机理（1）破坏水化膜：将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周边的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）中和电荷，减少静电斥力： 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力减少，导致蛋白溶解度减少，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。盐析用盐的选择在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱阴离子盐析效果 ：PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN-阳离子盐析效果：NH4+ K+Na+阴离子的影响大于阳离子蛋白质溶解度与盐浓度的关系S=-s和Ks的物理意义代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；Ks盐析常数，代表图中直线的斜率；从一些实验结果表白，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。用盐析法分离蛋白质的二种方法第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于初期的粗提液；第二种叫分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。盐析的影响因素pH值为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白等电点处温度在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增长而增长。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。（随温度升高减小，热促失水膜 Ks不随温度而变）蛋白质浓度，高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会减少。盐析法特点：1. 成本低，不需要特别昂贵的设备。2. 操作简朴、安全。3. 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。4. 分离效果不抱负，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。l 盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠高聚物沉淀 （非离子性聚合物 (PEG)： 是一种水溶性的高分子聚合物）机理：这些亲水性高分子上有许多可结合水分子的羟基，加入后结合自由水分子，破坏蛋白质的水化膜。优点：1. 室温2. 颗粒大，易于收集3. 提高蛋白质的稳定性4. PEG 难回收，成本高思考题常用的沉淀方法涉及哪些？ 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 影响有机溶剂沉析的重要因素有哪些？ 何谓盐析？其原理是什么？ 何谓“Ks”分级盐析法？何谓“”分级盐析法？ 常用的盐是什么，影响盐析的重要因素有哪些？ 高聚物沉淀的原理是什么？常用的高聚物是什么？第十一章 电泳分离技术电泳：指带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。电泳技术：运用带电粒子在电场中移动速度不同而达成分离的技术称。 等电聚胶电泳（IFE）：分离蛋白质以特殊的两相电解质为载体，在外加电场的作用下形成PH梯度场，具有特定等电点的蛋白质在PH梯度场中形成蛋白质区带，从而得到蛋白质组分。分辨率高，分离效率高，但两性电解质价格昂贵，只能一次性使用，成本较高一、电泳的基本原理