IBDV阳离子PLGA微球...A疫苗的制备及其抗原性研究_王致远.pdf

中国动物传染病学报 Chinese Journal of Animal Infectious Diseases ISSN 1674-6422,CN 31-2031/S 中国动物传染病学报网络首发论文中国动物传染病学报网络首发论文 题目：IBDV 阳离子 PLGA 微球 DNA 疫苗的制备及其抗原性研究 作者：王致远，蒲德粉，陈盛峰，陈果，王威威，韦平，何秀苗 DOI：10.19958/31-2031/s.20230713.001 收稿日期：2023-06-13 网络首发日期：2023-07-13 引用格式：王致远，蒲德粉，陈盛峰，陈果，王威威，韦平，何秀苗IBDV 阳离子 PLGA微球 DNA 疫苗的制备及其抗原性研究J/OL中国动物传染病学报.https:/doi.org/10.19958/31-2031/s.20230713.001 网络首发网络首发：在编辑部工作流程中，稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶段。录用定稿指内容已经确定，且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期刊特定版式（包括网络呈现版式）排版后的稿件，可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合出版管理条例和期刊出版管理规定的有关规定；学术研究成果具有创新性、科学性和先进性，符合编辑部对刊文的录用要求，不存在学术不端行为及其他侵权行为；稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑、出版的技术标准，正确使用和统一规范语言文字、符号、数字、外文字母、法定计量单位及地图标注等。为确保录用定稿网络首发的严肃性，录用定稿一经发布，不得修改论文题目、作者、机构名称和学术内容，只可基于编辑规范进行少量文字的修改。出版确认出版确认：纸质期刊编辑部通过与中国学术期刊（光盘版）电子杂志社有限公司签约，在中国学术期刊（网络版）出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版，以单篇或整期出版形式，在印刷出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为中国学术期刊（网络版）是国家新闻出版广电总局批准的网络连续型出版物（ISSN 2096-4188，CN 11-6037/Z），所以签约期刊的网络版上网络首发论文视为正式出版。1IBDV 阳离子 PLGA 微球 DNA 疫苗的制备及其抗原性研究 王致远1，蒲德粉1，陈盛峰1，陈 果2，王威威2，韦 平2，何秀苗1（1广西民族大学海洋与生物技术学院 广西多糖材料与改性重点实验室，南宁 530006；2.广西大学动物科学技术学院，南宁 530005）摘要：探究聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）作为 IBDV-VP2 核酸疫苗递送载体的潜力。通过复乳溶剂挥发法制备阳离子 PLGA 微球，用扫描电镜观察其形态。检测阳离子 PLGA 微球的细胞毒性、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力及淋巴细胞增殖能力的影响，以及阳离子 PLGA 微球吸附 IBDV DNA 疫苗的能力、吸附后在体外的完整性和释放情况。通过动物实验检测微球疫苗的免疫效果。本研究制备的阳离子 PLGA微球平均粒径在 1-5 m之间，对正常生长的 Vero细胞无毒性作用，且能够促进巨噬细胞的吞噬作用和 B、T 淋巴细胞的增殖；该微球吸附 IBDV DNA 疫苗后 8 h 达到平衡，且 DNA 保持完整的结构和功能；使用 IBDV 阳离子 PLGA 微球 DNA 疫苗免疫 14 日龄三黄鸡，试验鸡 35 日龄时的 IBDV 抗体水平达到峰值，并且高于裸 DNA 疫苗组。阳离子 PLGA 微球作为 IBDV-DNA 疫苗的载体可以激发雏鸡产生较高水平的 IBDV 抗体，且抗体持续时间较长，本研究的结果将为 IBDV 微球核酸疫苗的研发提供依据。关键词：阳离子 PLGA；IBDV-DNA 疫苗；免疫 Preparation and Antigenicity Study of IBDV Cationic PLGA Microspheres DNA Vaccine WANG Zhiyuan1，PU Defen1，CHEN Shengfeng1，CHEN Guo2，WANG Weiwei2，WEI Ping2，HE Xiumiao1（1.Guangxi Key Laboratory Cultivation Base for Polysaccharide Materials and Modifications,Guangxi Minzu University,Nanning,Guangxi 530006，China；2.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530005，China）Abstract:This study aimed to explore the potential of PLGA as a delivery carrier for IBDV-VP2 DNA vaccine.Cationic PLGA microspheres were prepared by double emulsion solvent evaporation method,and their morphology was observed by scanning electron microscopy.The effects of cationic PLGA microspheres on cell toxicity,phagocytosis of mouse peritoneal macrophages,lymphocyte proliferation,and the ability to adsorb IBDV DNA vaccine,as well as the integrity and release of adsorbed DNA vaccine in vitro,were detected.The immunization efficacy of the microsphere vaccine was tested by animal experiments.The cationic PLGA microspheres prepared in this study had an average particle size of 1-5 m,no toxicity to normal growing Vero cells,and could promote the phagocytosis of macrophages and the proliferation of B and T lymphocytes.The microspheres reached equilibrium with the adsorption of IBDV DNA vaccine after 8 h,and the DNA maintained its intact structure and function.When immunized with IBDV cationic PLGA microsphere DNA vaccine at 14 days of age,the IBDV antibody levels of the experimental chickens reached a peak at 35 days of age and were higher than those in the naked DNA vaccine group.Cationic PLGA microspheres,as carriers for IBDV-DNA vaccine,can induce high levels of IBDV antibodies in chicks,and the duration of the antibodies is longer.The results of this study will provide a basis for the development of IBDV microsphere DNA vaccine.Key words:Cationic PLGA;IBDV-DNA vaccine;Immunity 收稿日期：收稿日期：2023-06-13 基金项目：基金项目：国家自然科学基金项目（32160824）；国家现代农业产业技术体系广西肉鸡产业创新团队建设专项（nycytxgxcxtd-19-03）；广西民族大学自治区级大学生创新创业训练计划项目资助（S202210608154）；广西研究生教育创新计划资助项目（YCBZ2022034）作者简介：作者简介：王致远，男，硕士研究生，生物化学与分子生物学专业 通信作者：通信作者：何秀苗，E-mail： DOI：10.19958/31-2031/s.20230713.001 网络首发时间：2023-07-13 13:27:49网络首发地址：https:/ bursal disease,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）感染青年鸡引起的急性、高度接触性和溶淋巴细胞性疾病。IBDV 主要侵染鸡的中枢免疫器官-法氏囊，引起雏鸡法氏囊的 B 前淋巴细胞变性坏死和不同程度地免疫机能抑制，导致鸡群继发感染其他致病因子并最终死亡1-2，严重影响了养禽业的健康发展3-4。IBDV 属双节段的RNA 病毒科、禽双 RNA 病毒属，其基因组由 A、B 两个双链 RNA 节段组成，其中位于 A 节段的VP2基因编码的VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，可以诱导宿主产生保护性中和抗体5,6，是IBDV核酸疫苗研究的主要靶标7-8。目前，针对 IBDV 的传统疫苗，如活疫苗、灭活疫苗、免疫复合疫苗等已经被广泛应用于 IBD 的常规免疫中，并发挥着重要的作用9，然而活疫苗和免疫复合疫苗仍然能损伤法氏囊10-12、灭活疫苗具有需要多次接种才能达到很好的免疫效果11等缺点，因此急需研发新型疫苗。核酸疫苗作为第三次疫苗革命的产物，与传统的疫苗相比，其具有免疫保护力增强、应用安全、产生持久免疫应答等特点13，成为 IBD 疫苗研发的新方向。然而核酸疫苗在进入机体后易被体内环境所破坏，导致免疫效果不佳。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，其作为疫苗载体具有吸附能力强14、能够有效抵抗酶的降解、抵挡机械力对药物与疫苗的物理损坏等优点，被广泛用作药物和核酸疫苗的载体。张辉等15将猪繁殖和呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory symdrome virus，PRRSV）DNA 疫苗吸附在制备的 PLGA 微粒表面，发现与裸 DNA 免疫组相比，PLGA 可以显著增强所吸附的 DNA 诱导的体液免疫和细胞免疫。贾成成等16将人乳头瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）L1 五聚体抗原包裹在制备的两种不同粒径的 PLGA 微球中，结果表明，小粒径微球可以提升细胞免疫，而大粒径微球则有利于诱导高效的体液免疫。Choudary 等17将口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）VP1 DNA 疫苗吸附于 PLGA 微粒后免疫豚鼠，结果发现能够产生与灭活疫苗组相同的抗体滴度。Prabhuraj 等18发现 PLGA 可以用作药物运输载体，并能够克服药物半衰期较短等缺点。在前期研究中，课题组成功研制出了抗原性良好的泛素介导的 IBDV-Ub-VP2 核酸疫苗19，但该疫苗在进入机体后容易被体内环境破坏。因此，为了保护该核酸疫苗，需要使用载体进行保护。本研究旨在探究如何将前期研究中制备的核酸疫苗载入载体中，从而提高其稳定性和免疫效果。本研究将 PLGA 作为 IBDV 核酸疫苗的载体，通过对该体系的理化分析以及临床动物实验探索其免疫增强效果，为 IBD 新型疫苗的研制提供科学依据。1 材料与方法 1.1 试剂及实验动物 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA 50：50，分子量 60 kd，特征粘度 0.45-0.55）和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）分别购自济南岱罡生物工程有限公司和北京索莱宝科技有限公司，均为分析纯；DMEM 培养基和 RPMI 1640 培养基购自 Hyclone；胎牛血清（FBS）购自 Gibco；pVAX1-Ub-VP2 质粒由本课题组构建并保存19；非洲绿猴肾细胞（Vero）细胞由本实验室保存；6-8周龄昆明小鼠购自广西医科大学动物实验中心；鸡抗 IBDV 阳性血清由本实验室制备；SPF 鸡血清由实验室保存；实验动物：1 日龄三黄鸡购自广西南宁市良凤农牧有限公司；IBDV 抗体检测试剂盒由本课题组研制20。1.2 阳离子 PLGA 微球制备 将 500 mg PLGA 完全溶解于 10 mL 二氯甲烷中，加入 1 mL PBS，13000 g 离心 3 min，后逐滴加入 50 mL 0.5%CTAB，20000g 离心 5 min，室温下磁力搅拌过夜至溶剂挥发，10000g 4离心 10 min，取沉淀，用 5%蔗糖洗涤两次后冷冻干燥 72 h 至粉末状，获得阳离子PLGA 微球，并通过扫描电镜观察微球形态，然后以 10%FBS 的 DMEM/RPMI 1640 完全培养基将微球配置成 0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 和 10 mg/mL 等不同浓度备用。1.3 阳离子 PLGA 微球细胞毒性检测 将铺满 96 孔培养板的 Vero 细胞弃去原液，以每孔 100 L 的量加入：试验组为不同浓度的阳离子 PLGA 微球，正常细胞对照组为 DMEM 完全培养基，每组 8个重复。置于 37，5%CO2培养 48 h，取出后利用 MTT 法21检测阳离子 PLGA 微球对 Vero 细胞的细胞毒性。1.4 阳离子 PLGA 微球对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响 无菌摄取小鼠腹腔巨噬细胞，经 PBS洗涤后重悬于 RPMI 1640 完全培养基，调整细胞浓度至 1106个/mL 并接种到 96 孔细胞培养板中，37、5%CO2培养箱中培养 2 h，洗去未贴壁细胞，试验组加入 100 L/孔不同浓度的阳离子 PLGA微球，对照组加入 100 L RPMI 1640 完全培养基，每组 8 个重复，37、5%CO2培养 48 h 后取出，利用小鼠巨噬细胞吞噬中性红实验22来检测巨噬细胞对中性红的吞噬情况。1.5 阳离子 PLGA 微球淋巴细胞增殖实验 无菌取小鼠脾脏和胸腺并分别制备成淋巴细胞悬液，经台盼蓝染色并计数（活细胞95%）后用 RPMI 1640 完全培养基调整细胞浓度至 2107后接种到 96孔培养板上（50 L/孔），试验分组：脾淋巴细胞悬液每孔加入 50 L LPS、胸腺淋巴细胞每孔加入50 L ConA 作为阳性对照，试验组加入 100 L 不同浓度的阳离子 PLGA 微球，阴性对照组加入 100 L RPMI 1640 完全培养基，阳性对照组加入 50 L RPMI 1640 完全培养基使得各试验组体积一致，每组 8 个重复。于 37、5%CO2培养 48 h 后取出，运用 MTT 法21检测 T、B 淋巴细胞增殖情况，并计算细胞刺激指数23：细胞刺激指数=实验组 OD490值/对照组 OD490值100%，刺激指数大于 1时，表明对细胞的增殖起促进作用。1.6 阳离子 PLGA 微球吸附 IBDV DNA 疫苗及其吸附量的检测 在 10 mg 阳离子 PLGA 微球粉末中加入 100 L pVAX1-Ub-VP2 DNA（0.5 g/L），4、100 r/min 振荡 2、4、6 和 8 h，然后于 4、10000g 离心 10 min，收集上清液，沉淀用无菌蒸馏水洗涤 2 次，冷冻干燥 36 h 至粉末。检测上清液的吸光度 OD260，测其浓度并计算 DNA 含量：DNA 含量=初始 DNA 含量-OD26050g/mL剩余体积；并计算包封率：包封率=系统中包封的 DNA 量 系统中包封与未包封的 DNA 量 100%。1.7 IBDV DNA 疫苗完整性实验 将已吸附 pVAX1-Ub-VP2 DNA 的阳离子 PLGA 微球密封于 5 mL青瓶中，分别置于 4和室温 3 个月，之后通过氯仿将微球溶解使其释放出 DNA，取上清进行电泳分析，考察微球中质粒 DNA 的完整性。1.8 阳离子 PLGA 微球体外释放 DNA 的检测 取 10 mg 冻干的阳离子 PLGA-pVAX1-Ub-VP2 DNA微球粉末，加入 1 mL PBS（pH 7.4），于 37恒温摇床 100 r/min 振荡，每隔 24 h 取出于 12000g离心 10 min，吸取上清液，通过检测上清液吸光度 OD260的方法测定释放的 DNA 含量，沉淀则重新加入 1 mL PBS（pH 7.4）于 37继续振荡，循环测定释放的 DNA 量，并测定 DNA 释放比例：释放比例=释放的 DNA 量 总 DNA 量。1.9 IBDV 阳离子 PLGA 微球 DNA 疫苗动物免疫方案 1 日龄三黄鸡 35 羽于无菌隔离器中饲养至 14日龄后随机分为 4 个小组 A-D（表 1），其中，A 组为未免疫对照组，5 羽；B 组为 pVAX1-Ub-VP2组，10 羽；C 组为 B87 组，10 羽；D 组为阳离子 PLGA-pVAX1-Ub-VP2 组，10 羽。每组随进选取5 只进行翅静脉采血制备血清，-80保存备用。同时进行第一次免疫，21 日龄进行第二次免疫，各组免疫途径和免疫量均如表 1 所示，首免及首免后每隔 1 周进行翅静脉采血，制备血清，用课题组研制的 ELISA-IBDV 抗体检测试剂盒检测抗 IBDV 抗体水平。表表1 实验动实验动物免疫方案物免疫方案 Table 1 Experimental animal immunization protocol 组别 Group 名称 Name 数量（羽）Quantity(feather)免疫途径 Immune pathway 免疫量 Immune dose A 未免疫对照组 5-B pVAX1-Ub-VP2组 10 颈部肌肉注射 100 g C B87组 10 口服 按说明书进行 D 阳离子PLGA-IBDV-Ub-VP2组 10 口服 20 mg 2 结果与分析 2.1 阳离子 PLGA 微球制备结果 所制备的阳离子 PLGA 微球经过扫描电镜观察，结果如图 1 所示，微球具有完整的球形结构，在球表面有相应的孔道和沟壑，粒径在 1-5 m 之间。图图 1 阳离子阳离子 PLGA 微球扫描电镜图微球扫描电镜图 Fig.1 Scanning electron microscopy of cationic PLGA microspheres a:1000;b:2000;c:5000;d:10000 a:1000;b:2000;c:5000;d:10000 2.2 阳离子 PLGA 微球细胞毒性检测结果 细胞毒性检测结果如表 2 所示，0.005 mg/mL 和 0.01 mg/mL 的阳离子 PLGA 微球处理组的 OD490值与空白对照组相比差异不显著，而 0.05 mg/mL 和 0.1 mg/mL 浓度处理组则显著高于对照组，表明，所制备的阳离子 PLGA 微球对 Vero 细胞没有毒性，其中，0.05 mg/mL 和 0.1 mg/mL 浓度组能显著促进 Vero 细胞增殖。表表 2 阳离子阳离子 PLGA 微球细胞毒性结果微球细胞毒性结果 Table 2 Cytotoxicity results of cationic PLGA microspheres 组别 Group 浓度 Concentration OD490值 OD490 value cell control 0 0.41638 0.041979a PLGA 0.005mg/mL 0.42513 0.090392a PLGA 0.01mg/mL 0.43375 0.061369a PLGA 0.05mg/mL 0.50988 0.079713c PLGA 0.1mg/mL 0.58938 0.079615b 不同字母代表存在显著差异（P0.05）Different letters represent significant differences(P0.05)2.3 阳离子 PLGA 微球对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响结果 吞噬作用结果如图 2 所示，阳离子 PLGA 微球浓度从 0.1 mg/mL 开始随浓度增加，细胞上清 OD490值逐渐增加，并显著高于未处理细胞对照组，并在 10 mg/mL 的浓度时达到最高值，表明，制备的阳离子 PLAG 微球能促进小鼠腹腔巨噬细胞的异物吞噬能力，随着浓度的升高，促进作用显著增强。图图 2 阳离子阳离子 PLGA 微球吞噬作用结果微球吞噬作用结果 Fig.2 Results of cationic PLGA microsphere phagocytosis 不同字母代表存在显著差异（P0.05）Different letters represent significant differences(P0.05)2.4 阳离子 PLGA 微球对淋巴细胞增殖的促进作用 脾脏 B 淋巴细胞增殖试验结果如表 3 所示，与空白细胞对照和 LPS 诱导组相比，不同浓度的 PLGA 阳离子试验组的细胞刺激指数显著增加，并随PLGA 浓度增加而增加，表明，所制备的阳离子 PLGA 微球具有促进 B 淋巴细胞增殖的能力，且浓度越高促进作用越强，具有剂量依赖性。胸腺 T 淋巴细胞增殖试验结果如表 3 所示，与空白对照组和 ConA 诱导组相比，不同浓度的 PLGA 阳离子试验组的细胞刺激指数显著增加，并随着浓度的升高，促进 T 淋巴细胞增殖的能力越强。表表 3 阳离子阳离子 PLGA 微球促进微球促进 B、T 淋巴细胞刺激指数淋巴细胞刺激指数 Table 3 Stimulation index of B and T lymphocytes promoted by cationic PLGA microspheres 组别 Group B 淋巴细胞刺激指数 B lymphocyte stimulation index 组别 Group T 淋巴细胞刺激指数 T lymphocyte stimulation index cell control 1a cell control 1a LPS control 1.00993 0.014167a ConA control 1.16213 0.111790b 0.01 mg/mL PLGA 1.10473 0.066091b 0.01 mg/mL PLGA 1.20200 0.150946b 0.1 mg/mL PLGA 1.43095 0.046451c 0.1 mg/mL PLGA 1.28796 0.224901bc 0.5 mg/mL PLGA 1.52218 0.036611d 0.5 mg/mL PLGA 1.42283 0.543828bc 1 mg/mL PLGA 1.68827 0.023878e 1 mg/mL PLGA 1.53306 0.340769c 10 mg/mL PLGA 1.79960 0.070100f 10 mg/mL PLGA 1.68373 1.304038c 不同字母代表存在显著差异（P0.05）Different letters represent significant differences(P0.05)2.5 阳离子 PLGA 微球吸附 IBDV DNA 疫苗及其吸附量的检测结果 阳离子 PLGA 微球吸附 DNA能力检测结果如图 3 所示，阳离子 PLGA 微球对 pVAX1-Ub-VP2 的吸附在 4 h 内迅速上升，DNA 吸附量达到 40 g，包封率达 80%，而后缓慢吸附，到 8 h 时吸附含量达到 49 g，包封率可以达到 98%。图图 3 阳离子阳离子 PLGA 微球吸附微球吸附 DNA 能力能力 Fig.3 DNA adsorption capacity of cationic PLGA microspheres 2.6 IBDV DNA 疫苗完整性实验结果 IBDV DNA 疫苗完整性实验结果如图 4 所示，4条件保存 3个月的 PLGA-DNA 微球的 DNA 电泳条带清晰，质粒 DNA 的带形完整，双链闭环构型的 DNA 条带较亮，表明其完整性良好；室温条件保存 3 个月的 PLGA-DNA 微球的 DNA 亦出现两种构型的质粒DNA 条带，但亮度较 4条件的稍淡；而 4保存 3 个月的无 PLGA 保护的质粒 DNA 电泳条带成火箭状，条带不清晰，有降解的趋势；而室温条件保存 3 个月的无 PLGA 保护的 DNA 样品电泳后无可见条带。结果表明，所制备的阳离子 PLGA 微球 DNA 疫苗无论在 4还是在室温条件下均具有较好的 DNA 保护作用。图图 4 DNA 完整性实验结果电泳图完整性实验结果电泳图 Fig.4 Electrophoresis of DNA integrity test results M:15000 bp Marker;1：4 保存 PLGA-pVAX1-Ub-VP2-DNA 疫苗;2：室温保存 PLGA-pVAX1-Ub-VP2-DNA疫苗;3：4 保存 pVAX1-Ub-VP2;4：室温保存 pVAX1-Ub-VP2 M:15000 bp marker;1:PLGA-pVAX1-Ub-VP2-DNA vaccine was preserved at 4;2:PLGA-pVAX1-Ub-VP2-DNA vaccine was stored at room temperature;3:pVAX1-Ub-VP2 was preserved at 4;4:Store pVAX1-Ub-VP2 at room temperature 2.7 阳离子 PLGA 微球体外释放 DNA 的检测结果 复合微球体外释放能力检测结果如图 5 所示，阳离子 PLGA-DNA 复合微球在 4 天内具有突释效应，释放比例占 40%-45%，剩余 DNA 在突释后缓慢释放，在 26 d 前后释放完全。图图 5 阳离子阳离子 PLGA-DNA 复合微球体外释放能力复合微球体外释放能力 Fig.5 In vitro release capacity of cationic PLGA-DNA composite microspheres 2.8 IBDV 阳离子 PLGA 微球 DNA 疫苗动物免疫实验结果 抗体水平检测结果如图 6 所示，试验鸡于 14 日龄首免，21 日龄二免后于 28 日龄（首免后 2 周，二免后 1 周）检测到抗体水平升高，其中，pVAX1-Ub-VP2 裸 DNA 疫苗组以及商品疫苗 B87 组的抗体水平提高的速度较快，于二免后一周（28日龄）即达到最高值，pVAX1-Ub-VP2 组的滴度最高，其次是 B87 组，随后逐渐下降，并在首免后4 周（42 日龄）后与未免疫对照组相当，而 PLGA-pVAX1-Ub-VP2 组的抗体水平上升速度相对缓慢，并在首免后 3 周（35 日龄）左右达到峰值，首免后 5 周（49 日龄）时检测到的抗体滴度仍然显著高于其他免疫组，首免 6 周（56 日龄）时所有的试验鸡仍然检测到 OD 值，而其他组均已检测不到。根据实验结果，空白组测得的 OD 值与表 4 中提供的 SPF 鸡血清测得的 OD 值相比较高，这表明实验三黄鸡具有 IBDV 的母源性抗体。图图6 抗体水平柱状图抗体水平柱状图 Fig.6 Histogram of antibody levels 不同字母代表存在显著差异（P0.05）Different letters represent significant differences(P0.05)表表 4 ELISA 检测检测 SPF 鸡血清鸡血清 Table 4 Detection of SPF chicken serum by ELISA SPF 血清 SPF serum OD 值 OD value 1-5 0.094 0.107 0.113 0.109 0.117 6-10 0.138 0.129 0.11 0.113 0.151 11-15 0.148 0.18 0.114 0.093 0.153 16-20 0.074 0.1 0.078 0.105 0.074 21-25 0.075 0.082 0.138 0.083 0.072 26 0.079 阳性 1.34 阴性 0.095 3 讨论 在基因递送系统的相关研究中，由于 PLGA 能够保护 DNA 不被内吞溶酶体降解，并且显著提高免疫反应能力24，已被广泛应用于基因治疗、药物运输、核酸疫苗等的递送15,16,18。PLGA 由于表面电势较低，吸附DNA的效果不佳，必须首先与CTAB结合形成一种表面带正电荷的PLGA/CTAB微粒才能使得吸附 DNA 的效果更强。此外，由于 DNA 是吸附在 PLGA 微粒的表面，并不是包裹到PLGA 微粒内部，因此可以避免 DNA 发生变性、降解，从而保持 DNA 的完整性25。与此一致，本研究将 PLGA 与 CTAB 结合后成功获得了阳离子 PLGA 微球，与 IBDV-Ub-VP2 结合后能够更长时间保持质粒 DNA 的完整性，此外，所制备的 PLAG 微球对体外培养的细胞无毒性，并具有增强巨噬细胞吞噬的能力，促进脾脏和胸腺淋巴细胞增殖的能力，动物免疫试验进一步证实了所研制的阳离子 PLGA IBDV-Ub-VP2 微球能有效激发机体产生高水平的 IBDV 抗体，并具有缓释的功能，使抗体产生的时间延长，结果为 IBDV 核酸疫苗的进一步应用提供了科学依据。由于微球的形状、粒径等将影响复合微球在粘膜下皮层的穿过而最终影响其免疫效果26。而以PLGA 作为原料制备微球，不同的 PLGA 的粘度、分子量以及粒径等特性均不相同而使制备获得的复合物微球的粒径、形状、表面结构等也有所不同，最终影响复合微球的免疫效果，本试验选择特征粘度为 0.45-0.55，分子量为 60 kd，乳酸和乙醇酸的含量比为 50：50 的端羟基聚（外消旋乳酸乙醇酸）共聚物作为阳离子PLGA共聚物微球原料制备微球，通过扫描电镜观察，制备的阳离子PLGA微球形状规则、分散均匀、粒径适宜，有明显的孔道和沟壑，其规则的孔状结构是潜在的核酸疫苗载体，能够充分发挥作为载体的优势，进而提高表达效率和免疫效果，这与 Negash 等27制备的基于阳离子 PLGA-MP（即阳离子聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球）的 IBDV-VP2-DNA 疫苗不同，除了所使用的 PLGA 分子量不同，该 PLGA IBDV 疫苗肌肉注射免疫后，仅有 75%的试验鸡产生了抗体，而本研究制备的 PLGA 阳离子微球 DNA 疫苗免疫三黄鸡，免疫后 6 周，100%的实验鸡均有较高的抗体水平，并且口服后在鸡体内持续存在 6 周，表明本研究制备的阳离子 PLGA 微球 DNA 疫苗免疫效果较好。本研究制备的阳离子 PLGA 微球在 8 h 吸附 IBDV DNA 疫苗的量高达 49 g，包封率为 98%，说明制备的阳离子 PLGA 微球能够有效吸附 DNA 疫苗。相关研究表明，相较于将 DNA 包裹在 PLGA内部的方法，将 DNA 吸附于 PLGA 微球表面能够有效增强 DNA 与 TLR 受体作用，提高包裹效率28。进一步研究发现制备的阳离子 PLGA-DNA 复合微球疫苗可以缓慢释放，但其在释放前期表现出了突释效应，我们推测这可能与质粒 DNA 置于 PLGA 的酸性微环境中有关29，因为在制备过程中，PLGA会降低液相环境中的 pH 值。然而微球在释放前期大量地释放 DNA 疫苗仍然是该体系中不可避免的难点，这不仅会损失大量的 DNA 疫苗，还可能引起免疫耐受或炎症等情况。因此，解决突释问题是未来缓释载体研究必须要解决的一个关键点。在动物免疫实验中，观察到与 SPF 鸡血清的 OD 值相比，未经免疫的空白组的 OD 值较高，这表明所使用的三黄鸡具有 IBDV 母源性抗体。尽管实验用三黄鸡存在母源性抗体，但 PLGA-pVAX1-Ub-VP2 组的抗体水平在首免 3 周达到峰值，且与空白组的抗体水平相比差异显著，说明母源性抗体并没有干扰疫苗的免疫效果。在养殖场中，商业鸡群通常会通过母鸡获得母源性抗体。通过使用含有 IBDV 母源性抗体的三黄鸡，可以更好地模拟养殖场中的实际情况，以评估疫苗在真实养殖环境中的抗原性能。在含有 IBDV 母源性抗体的三黄鸡中进行抗原性实验，可以评估疫苗在存在母源性抗体的情况下的免疫效果。这有助于确定疫苗对 IBDV 的预防能力以及其在母源性抗体阳性鸡群中的有效性30。刘岩等31使用丝素蛋白和壳聚糖作为载体研制的 IBDV VP2/4/3 DNA 疫苗免疫鸡群后，微球DNA 疫苗组的抗体水平高于裸 DNA 疫苗组，表明制备的复合微球可以提高疫苗的临床免疫效果。本研究制备的 IBDV 阳离子 PLGA 微球 DNA 疫苗与之研究结果相似，在首次免疫鸡群 3 周时达到抗体水平的峰值，相比裸 DNA 疫苗具有相对较长的抗体产生持续期，在首免 6 周仍可检测到抗体。这表明本研究制备的 IBDV 阳离子 PLGA 微球 DNA 疫苗能够有效激发水平高、持续时间长的抗体滴度。与之不同的是本研究制备的 IBDV 阳离子 PLGA 微球 DNA 疫苗应用时以口服的方式免疫鸡群，克服了传统注射疫苗造成的针头交叉污染的缺点，有利于大规模免疫动物。本研究成功制备了IBDV阳离子PLGA微球DNA疫苗，并通过口服途径免疫动物。研究结果表明，该疫苗能够在鸡体内持续存在至少六周，并具有较长的缓释期。此外，本研究进一步证实了阳离子PLGA微球能够有效激发机体产生高水平的IBDV抗体，并促进脾脏和胸腺淋巴细胞增殖的能力。这些结果为进一步应用IBDV核酸疫苗提供了有力的科学依据。参考文献参考文献 1 吴甜甜,李辉,刘爱晶,等.利用 SPF 鸡胚分离传染性法氏囊病病毒超强毒的研究J.中国家禽,2017,39(17):19-23.2 Fan L,Wang Y,Jiang N,et al.Residues 318 and 323 in capsid protein are involved in immune circumvention of the atypical epizootic infection of infectious bursal disease virusJ.Front Microbiol,2022,13:909252.3 He X,Xiong Z,Yang L,et al.Molecular epidemiology studies on partial sequences of both genome segments reveal that reassortant infectious bursal disease viruses were dominantly prevalent in southern China during 2000-2012J.Arch Virol,2014,159:3279-92.4 He X,Chen G,Yang L,et al.Role of naturally occurring genome segment reassortment in the pathog