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第二章第二章 遗传物质基础遗传物质基础第1页n生物亲代与子代之间，在形态、结构和生理功效上生物亲代与子代之间，在形态、结构和生理功效上经常相同，这就是经常相同，这就是遗传现象遗传现象。n生物遗传特征，使生物界物种能够保持相对稳定。生物遗传特征，使生物界物种能够保持相对稳定。依据当代细胞学和依据当代细胞学和遗传学研究得知，控制遗传学研究得知，控制生物性状主要遗传物质生物性状主要遗传物质是是脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA）。）。生物各项生命活动都有它生物各项生命活动都有它物质基础。生物遗传物质基础物质基础。生物遗传物质基础是什么呢？是什么呢？金丝猴后代依然是金丝猴金丝猴后代依然是金丝猴牛后代依然是牛牛后代依然是牛第2页n n第一节第一节 遗传物质本质遗传物质本质n n第二节第二节 核酸核酸化学组成化学组成n n第三节第三节 DNA二级结构二级结构n n第四节第四节 二级结构其它形式二级结构其它形式n n第五节第五节 DNA超螺旋结构超螺旋结构第3页第一节第一节 遗传物质本质遗传物质本质1.DNA是遗传物质是遗传物质2.RNA也能够作为遗传物质也能够作为遗传物质3.核酸之外其它遗传物质？核酸之外其它遗传物质？第4页1.1核素发觉核素发觉1.2 肺炎双球菌转化试验肺炎双球菌转化试验1.3 大肠杆菌噬菌体捣碎试验大肠杆菌噬菌体捣碎试验1.4化学试验化学试验1.5 遗传物质必须具备以下基本条件遗传物质必须具备以下基本条件1 DNA 是遗传物质是遗传物质第5页1 DNA 是遗传物质是遗传物质n n1.1 核素发觉n n 1868年，瑞士F.Miescher从绷带上白细胞核中分离出一个含磷酸性物质，命名为核素（nuclein）。n n核素主要成份是染色质，是DNA和蛋白质混合物。这是首次对基因化学本质进行探索。n n核酸(nucleic acids)这一名词于后才被正式启用。第6页n n19世纪末期，世纪末期，DNA和和RNA已经从细胞已经从细胞中分离出来，为深入化学分析奠定了基中分离出来，为深入化学分析奠定了基础。础。n n20世纪世纪30年代，年代，P.Levene和和W.Jacobs等等搞清了搞清了DNA和和RNA基本化学组成基本化学组成。还注。还注意到了意到了DNA和和RNA所含核糖差异。所含核糖差异。第7页1.2 肺炎双球菌转化试验肺炎双球菌转化试验（transformation）n n肺炎双球菌有两种类型肺炎双球菌有两种类型n n光滑型（光滑型（S型）型）n n粗糙型（粗糙型（R型）型）第8页 1）1928年，英国年，英国 F.Griffth2)1944年，年，O.Avery第9页图图 GriffthGriffth肺炎双球菌转化试验肺炎双球菌转化试验第10页第11页1.3大肠杆菌噬菌体捣碎试验大肠杆菌噬菌体捣碎试验第12页噬菌体侵染细菌过程：噬菌体侵染细菌过程：吸附吸附侵入侵入合成合成组装组装释放释放最终，这些噬菌体最终，这些噬菌体因为细菌解体而被因为细菌解体而被释放出来，再去侵释放出来，再去侵染其它细菌。染其它细菌。第13页大肠杆菌噬菌体捣碎试验大肠杆菌噬菌体捣碎试验n n1952年年Herchey和和Chase。n n用用32P和和35S分别标识噬菌体分别标识噬菌体DNA和蛋白质，和蛋白质，发觉发觉只有只有DNA进入宿主细菌内进入宿主细菌内，而蛋白质，而蛋白质则没有。则没有。第14页第15页1.4化学试验化学试验n n1950年以后，年以后，Chargaff、Markham等。等。n n不一样生物碱基组成不一样，含有严格不一样生物碱基组成不一样，含有严格种种特异性特异性。n n单体在不一样生物中都是相同。单体在不一样生物中都是相同。n nATGC等量等量n n四种碱基分子浓度可变。四种碱基分子浓度可变。第16页1.5DNA是遗传物质间接证据是遗传物质间接证据 （1 1）一个生物不一样组织细胞，不论年纪）一个生物不一样组织细胞，不论年纪大小，功效怎样，它大小，功效怎样，它DNADNA含量是恒定，而生含量是恒定，而生殖细胞精子殖细胞精子DNADNA含量则刚好是体细胞二分之含量则刚好是体细胞二分之一。多倍体生物细胞一。多倍体生物细胞DNADNA含量是按其染色体含量是按其染色体倍数性增加而递增，但细胞核里蛋白质并没倍数性增加而递增，但细胞核里蛋白质并没有相同分布规律。有相同分布规律。第17页（2 2）DNADNA在代谢上较稳定。在代谢上较稳定。（3 3）DNADNA是全部生物染色体所共有，而一些生是全部生物染色体所共有，而一些生物染色体上则没有蛋白质。物染色体上则没有蛋白质。（4 4）DNADNA通常只存在于细胞核染色体上，但通常只存在于细胞核染色体上，但一些能自体复制细胞器，如线粒体、叶一些能自体复制细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己绿体有其自己DNADNA。（5 5）在各类生物中能引发）在各类生物中能引发DNADNA结构改变化学结构改变化学物质都可引发基因突变。物质都可引发基因突变。第18页n n（1）储存并表示遗传信息）储存并表示遗传信息:n n（2）能够复制，把遗传信息传递给子代：）能够复制，把遗传信息传递给子代：n n (3)物理和化学稳定性：物理和化学稳定性：n n（4）有遗传改变能力：）有遗传改变能力：1.6 遗传物质必须具备以下基本条件：遗传物质必须具备以下基本条件：第19页第一节第一节 遗传物质本质遗传物质本质1.DNA是遗传物质是遗传物质2.RNA也能够作为遗传物质也能够作为遗传物质3.核酸之外其它遗传物质？核酸之外其它遗传物质？第20页2 RNA也能够作为遗传物质也能够作为遗传物质 2.1RNA病毒病毒:一些病毒也采取另一个核酸一些病毒也采取另一个核酸RNA作为遗传作为遗传物质物质，如逆转录病毒。，如逆转录病毒。烟草花叶病毒（烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus,TMV）第21页遗传物质是遗传物质是RNA试验证据试验证据第22页2.2 类病毒类病毒（viroid）n n类病毒：类病毒：类病毒：类病毒：不具蛋白质衣壳，仅有不具蛋白质衣壳，仅有不具蛋白质衣壳，仅有不具蛋白质衣壳，仅有RNARNA组成新病毒。组成新病毒。组成新病毒。组成新病毒。n n 1922 1922年年年年 美国美国美国美国 马铃薯纺锤形块茎病毒（马铃薯纺锤形块茎病毒（马铃薯纺锤形块茎病毒（马铃薯纺锤形块茎病毒（Potato Potato spindle tube viroidspindle tube viroid，PSTV PSTV）。）。）。）。n n特点：特点：特点：特点：n n单股闭合环状单股闭合环状单股闭合环状单股闭合环状RNARNA分子，分子量约分子，分子量约分子，分子量约分子，分子量约105Da105Da。n n能耐受紫外线和作用于蛋白质各种理化原因，在能耐受紫外线和作用于蛋白质各种理化原因，在能耐受紫外线和作用于蛋白质各种理化原因，在能耐受紫外线和作用于蛋白质各种理化原因，在9090下仍能存活。下仍能存活。下仍能存活。下仍能存活。第23页n n类病毒复制怎样进行？类病毒复制怎样进行？n n由宿主细胞酶来完成，其由宿主细胞酶来完成，其RNA作为复制模板。作为复制模板。n n类病毒现在仅在高等植物中发觉，普通经过类病毒现在仅在高等植物中发觉，普通经过接触，擦伤，节肢动物和菟丝子传输。接触，擦伤，节肢动物和菟丝子传输。第24页第一节第一节 遗传物质本质遗传物质本质1.DNA是遗传物质是遗传物质2.RNA也能够作为遗传物质也能够作为遗传物质3.核酸之外其它遗传物质？核酸之外其它遗传物质？第25页3 非核酸其它遗传物质非核酸其它遗传物质n n朊病毒朊病毒Prion：又称蛋白质侵染因子。又称蛋白质侵染因子。n n朊病毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内朊病毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制小分子无免疫性疏水蛋白质。复制小分子无免疫性疏水蛋白质。第26页n n羊瘙痒病羊瘙痒病羊瘙痒病羊瘙痒病n n19821982年，美国年，美国年，美国年，美国 斯坦利斯坦利斯坦利斯坦利 普鲁辛纳普鲁辛纳普鲁辛纳普鲁辛纳S.B.PrusinerS.B.Prusiner发觉发觉发觉发觉羊瘙痒病是蛋白质侵染引发疾病，并称为羊瘙痒病是蛋白质侵染引发疾病，并称为羊瘙痒病是蛋白质侵染引发疾病，并称为羊瘙痒病是蛋白质侵染引发疾病，并称为“Prion”“Prion”即朊病毒。即朊病毒。即朊病毒。即朊病毒。n n马鹿和鹿慢性消瘦病、猫海绵状脑病。马鹿和鹿慢性消瘦病、猫海绵状脑病。马鹿和鹿慢性消瘦病、猫海绵状脑病。马鹿和鹿慢性消瘦病、猫海绵状脑病。n n19961996年春天年春天年春天年春天“疯牛病疯牛病疯牛病疯牛病”：牛海绵状脑炎牛海绵状脑炎牛海绵状脑炎牛海绵状脑炎n n人慢性退化性紊乱疾病：人慢性退化性紊乱疾病：人慢性退化性紊乱疾病：人慢性退化性紊乱疾病：老年痴呆、帕金森氏病、老年痴呆、帕金森氏病、老年痴呆、帕金森氏病、老年痴呆、帕金森氏病、糖尿病等。糖尿病等。糖尿病等。糖尿病等。朊病毒朊病毒引发风波引发风波第27页朊病毒特点：朊病毒特点：n n仅有蛋白质组成，仅有蛋白质组成，n n分子量分子量29kDa，n n含有蛋白质性质：能被蛋白酶灭活，含有蛋白质性质：能被蛋白酶灭活，不被不被核酸酶和辐射灭活，核酸酶和辐射灭活，对许多理化因子有很对许多理化因子有很强抵抗力。强抵抗力。第28页n n1997年年Prusiner对对朊病毒蛋白朊病毒蛋白感染机制进行了探讨。感染机制进行了探讨。n n朊病毒蛋白（朊病毒蛋白（PrP）以两种形式存在：）以两种形式存在：n n正常脑组织中发觉正常脑组织中发觉PrPC不含有感染性，对不含有感染性，对蛋白酶敏感，能够被完全降解；蛋白酶敏感，能够被完全降解；n n致病组织中致病组织中PrPSC含有感染性，含有抗蛋白含有感染性，含有抗蛋白酶性能。酶性能。第29页n nPrPC和和PrPSC一级结构一级结构完全相同，但二级结完全相同，但二级结构差异很大构差异很大：n nPrPC：螺旋含量约为螺旋含量约为40，几乎没有，几乎没有片层片层结构；结构；n nPrPSC：含有高达含有高达50片层结构，只有片层结构，只有20螺旋。螺旋。第30页致病致病n n 正常正常朊蛋白构型发生异常改变朊蛋白构型发生异常改变后造成疯牛后造成疯牛病，病，无需无需DNA或或RNA参加参加，致病因子朊蛋，致病因子朊蛋白就能够传染复制。白就能够传染复制。n n所谓所谓朊病毒繁殖就是正常朊病毒繁殖就是正常PrPC蛋白质转变蛋白质转变为为PrPSC过程，而且朊病毒感染后也含有指过程，而且朊病毒感染后也含有指数增加特征数增加特征。第31页1 1）合成朊病毒所需信息可能存在于寄主细胞中）合成朊病毒所需信息可能存在于寄主细胞中）合成朊病毒所需信息可能存在于寄主细胞中）合成朊病毒所需信息可能存在于寄主细胞中n n朊病毒作用，仅在于激活在寄主细胞中为朊病毒编朊病毒作用，仅在于激活在寄主细胞中为朊病毒编朊病毒作用，仅在于激活在寄主细胞中为朊病毒编朊病毒作用，仅在于激活在寄主细胞中为朊病毒编码基因，使得朊病毒得以复制繁殖。码基因，使得朊病毒得以复制繁殖。码基因，使得朊病毒得以复制繁殖。码基因，使得朊病毒得以复制繁殖。2 2）朊病毒蛋白质能为自己编码遗传信息）朊病毒蛋白质能为自己编码遗传信息）朊病毒蛋白质能为自己编码遗传信息）朊病毒蛋白质能为自己编码遗传信息n n发生逆转译产生为朊病毒编码发生逆转译产生为朊病毒编码发生逆转译产生为朊病毒编码发生逆转译产生为朊病毒编码RNARNA或或或或DNADNA，必须存，必须存，必须存，必须存在逆转译酶，甚至还要有逆转录酶。在逆转译酶，甚至还要有逆转录酶。在逆转译酶，甚至还要有逆转录酶。在逆转译酶，甚至还要有逆转录酶。n n蛋白质指导下蛋白质合成，即蛋白质本身可作为遗蛋白质指导下蛋白质合成，即蛋白质本身可作为遗蛋白质指导下蛋白质合成，即蛋白质本身可作为遗蛋白质指导下蛋白质合成，即蛋白质本身可作为遗传信息。传信息。传信息。传信息。朊病毒复制机理朊病毒复制机理：第32页n n第一节第一节 遗传物质本质遗传物质本质n n第二节第二节 核酸化学组成核酸化学组成n n第三节第三节 DNA二级结构二级结构n n第四节第四节 二级结构其它形式二级结构其它形式n n第五节第五节 DNA超螺旋结构超螺旋结构第33页第二节第二节 核酸化学组成核酸化学组成第34页嘧啶嘧啶Pyrimidines嘌呤嘌呤Purines1含氮碱基、核苷、核苷酸含氮碱基、核苷、核苷酸 碱基碱基Nitrogenous basesHUracil(U)第35页DNA:D-2-脱氧核糖脱氧核糖 A,G,C,TRNA:D-2-核糖核糖 A,G,C,U2 核酸化学组成核酸化学组成n n 核酸元素组成核酸元素组成C、H、O、N、P（9-10%）核酸核酸 核苷酸核苷酸 磷酸磷酸 核苷核苷 戊糖戊糖 碱基碱基第36页第37页3 DNA一级结构：一级结构：即是即是指四种核苷酸指四种核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定排列按照一定排列次序，经过磷酸二酯次序，经过磷酸二酯键连接形成多核苷酸键连接形成多核苷酸也称为碱基次序。也称为碱基次序。第38页DNADNA一级结构两种缩写方式：一级结构两种缩写方式：线条式：线条式：pTpGpCpApT pTpGpCpApT pT-G-C-A-T pT-G-C-A-T 文字式：文字式：第39页n n第一节第一节 遗传物质本质遗传物质本质n n第二节第二节 核酸化学组成核酸化学组成n n第三节第三节 DNA二级结构二级结构n n第四节第四节 二级结构其它形式二级结构其它形式n n第五节第五节 DNA超螺旋结构超螺旋结构第40页n n1 DNA双螺旋模型提出n n2 维持DNA双螺旋力n n3 双螺旋结构基本形式n n4 变性和复性第三节第三节 DNA二级结构二级结构第41页1.1研究背景：研究背景：n n1950年，年，Chargaff从大量不一样起源从大量不一样起源DNA样样品分析中发觉了品分析中发觉了DNA组成组成当量规律当量规律，即，即AT，GC，AGCT。n n不一样生物种属不一样生物种属DNA碱基组成不一样，碱基组成不一样，n n同一个体不一样器官、不一样组织同一个体不一样器官、不一样组织DNA含有含有相同碱基组成。相同碱基组成。1 DNA双螺旋模型提出第42页n n理论化学家L.Pauling利用化学简单定律来推理，研究了蛋白质-螺旋结构，此方法启发了Watson和和Crick。n nM.Wilkins、R.Franklin等在DNAX射线晶体结构方面作出了重大贡献。第43页n nR.FranklinX-射线衍射图第44页1953年沃森和克里克提出年沃森和克里克提出DNA分子双螺旋结构模型。分子双螺旋结构模型。1.2 DNA双螺旋结构模型提出：双螺旋结构模型提出：第45页Fig.2-5 Watson and Cricks paper in Nature 1953.第46页1.3DNA双螺旋结构模型关键点：双螺旋结构模型关键点：脱氧核糖和磷酸经过脱氧核糖和磷酸经过3,5磷酸二酯键交磷酸二酯键交互连接，成为螺旋链互连接，成为螺旋链骨架。骨架。n n两条链方向以两条链方向以反向平行反向平行方式组成方式组成右手双右手双螺旋螺旋。第47页第48页n n碱基互补配对：碱基互补配对：只有A和T配对，G和C配对才能满足正常螺旋（直径20）要求和chargaff当量规律。第49页螺旋参数螺旋参数螺旋直径螺旋直径nm。螺旋每旋转一周螺旋每旋转一周10对碱基，对碱基，每个碱基旋转角度为每个碱基旋转角度为36。螺距螺距3.4nm；碱基平面之间距离为碱基平面之间距离为0.34nm。第50页 大沟小沟大沟小沟大沟小沟大沟小沟 n n对于遗传上有主要功效对于遗传上有主要功效对于遗传上有主要功效对于遗传上有主要功效蛋蛋蛋蛋白质识别白质识别白质识别白质识别DNADNA双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构双螺旋结构上特定信息是非常主要。上特定信息是非常主要。上特定信息是非常主要。上特定信息是非常主要。n大沟大沟大沟大沟(2.2nm)(2.2nm)n小沟小沟小沟小沟(1.2nm)(1.2nm)第51页n n1 DNA双螺旋模型提出双螺旋模型提出n n2 维持维持DNA双螺旋力双螺旋力n n3 双螺旋结构基本形式双螺旋结构基本形式n n4 变性和复性变性和复性第三节第三节 DNA二级结构二级结构第52页2 维持维持DNA双螺旋力双螺旋力2.1 氢键氢键n nGC之间有三条氢键，之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，这是之间有两条氢键，这是DNA双螺旋结构主要特双螺旋结构主要特征之一，征之一，DNA许多许多物理物理性质性质如变性、复性以及如变性、复性以及Tm值值等都与此相关。等都与此相关。第53页2.2 碱基堆集力碱基堆集力DNA同一条链相邻碱基同一条链相邻碱基之之间非特异性作用力，包含间非特异性作用力，包含疏水作用力和疏水作用力和范德范德华力华力。n n疏水作用力：疏水作用力：不溶于水或难溶于水两个分子不溶于水或难溶于水两个分子在水中含有相互联合，成串联地结合在一起在水中含有相互联合，成串联地结合在一起趋势。趋势。n n嘌呤和嘧啶有一定程度疏水性，双螺旋结构嘌呤和嘧啶有一定程度疏水性，双螺旋结构内部形成一个强大疏水区，内部形成一个强大疏水区，使使DNA相邻碱基相邻碱基有相互堆集在一起趋势，这是形成碱基堆集有相互堆集在一起趋势，这是形成碱基堆集力主要原因之一。力主要原因之一。第54页n n范德华力：存在于分子间一种吸引力；n nDNA双链中嘌呤环和嘧啶范环德华半径是1.7 左右，其累积范德华力是相当可观，这么范德华力加强了疏水作用，这是形成碱基堆集力另一个重要因素。第55页氢键与碱基堆集力氢键与碱基堆集力协同作用协同作用n n已经堆基碱基更轻易发生氢键键合，对应已经堆基碱基更轻易发生氢键键合，对应地已经被氢键定向碱基更轻易堆集。地已经被氢键定向碱基更轻易堆集。n n两种作用力相互协同，形成一个非常稳定两种作用力相互协同，形成一个非常稳定结构。假如一个作用力被消除，另一个作结构。假如一个作用力被消除，另一个作用力也大为减弱。用力也大为减弱。第56页磷酸基团间静电斥力磷酸基团间静电斥力带负电荷磷酸基带负电荷磷酸基静电斥力静电斥力，所以，所以DNA需要需要保留在含保留在含Na+生理盐条件生理盐条件。碱基分子内能碱基分子内能p物体内能是物体内全部分子分子动能与分子物体内能是物体内全部分子分子动能与分子势能之和。势能之和。p温度升高，碱基分子内能增加时，碱基定向温度升高，碱基分子内能增加时，碱基定向排列遭受破坏，消弱了碱基氢键结协力和碱排列遭受破坏，消弱了碱基氢键结协力和碱基堆集力，会使基堆集力，会使DNA双螺旋结构受到破坏。双螺旋结构受到破坏。2.3 2.3 不稳定原因不稳定原因第57页n n1 DNA双螺旋模型提出双螺旋模型提出n n2 维持维持DNA双螺旋力双螺旋力n n3 双螺旋结构基本形式双螺旋结构基本形式n n4 变性和复性变性和复性第三节第三节 DNA二级结构二级结构第58页3 双螺旋结构基本形式双螺旋结构基本形式 三种不一样形式三种不一样形式三种不一样形式三种不一样形式DNADNA构象构象构象构象第59页 A，B，Z型双螺旋特征型双螺旋特征双螺双螺双螺双螺旋旋旋旋类类类类型型型型直直直直径径径径(n(nm)m)螺螺螺螺距距距距(n(nm)m)每每每每轮轮轮轮碱基碱基碱基碱基数数数数碱基碱基碱基碱基间间间间距距距距(nm)(nm)碱基碱基碱基碱基倾倾倾倾角角角角()()螺旋螺旋螺旋螺旋扭角扭角扭角扭角()()n n存在条件存在条件沟型沟型沟型沟型相相相相对对对对湿度湿度湿度湿度盐盐盐盐种种种种类类类类大沟大沟大沟大沟小沟小沟小沟小沟A A2.32.32.82.811110.260.261313333375%75%NaNa+、KK+、CsCs+窄，深窄，深窄，深窄，深宽宽宽宽，深，深，深，深B B2.02.03.43.410.410.40.340.340 0363692%92%NaNa+低低低低盐盐盐盐宽宽宽宽，中，中，中，中等深等深等深等深窄，中窄，中窄，中窄，中等深等深等深等深Z Z1.81.84.64.612120.380.389 9-30-3043%43%NaNa+、MgMg2+2+高高高高盐盐盐盐平浅平浅平浅平浅窄，深窄，深窄，深窄，深第60页ABZ大沟宽大沟宽小沟窄小沟窄小沟窄小沟窄大沟变深大沟变深小沟宽深小沟宽深大沟不存在大沟不存在小沟窄而深小沟窄而深第61页n nA构象构象:在相对湿度在相对湿度75以下取得以下取得DNA纤纤维含有不一样与维含有不一样与B-DNA结构特点。结构特点。DNA-RNA杂交分子和杂交分子和RNA-RNA双链结构均采双链结构均采取取A构象。构象。n nZ-DNA形成是形成是DNA单链上出现嘌呤和嘧单链上出现嘌呤和嘧啶交替排列所造成，比如啶交替排列所造成，比如CGCGCGCG或或CACACACACA。第62页Z-DNA有什么生物学意义呢有什么生物学意义呢?n nZ-DNA在热力学上是不利。带负电荷磷酸根在热力学上是不利。带负电荷磷酸根距离太近，产生静电排斥。距离太近，产生静电排斥。n nDNA链链局部不稳定区存在就成为潜在解链位局部不稳定区存在就成为潜在解链位点点。n nDNA解链是解链是DNA复制和转录等过程中必要复制和转录等过程中必要步骤，所以步骤，所以Z-DNA结构与基因调整相关。结构与基因调整相关。第63页B-DNA是活性最高是活性最高DNA构象，构象，B-DNA变组成为变组成为A-DNA后，仍有活性，后，仍有活性，但若局部变构为但若局部变构为Z-DNA后则活性显著降后则活性显著降低。低。三种不一样构象三种不一样构象DNA活性活性第64页n n1 DNA双螺旋模型提出双螺旋模型提出n n2 维持维持DNA双螺旋力双螺旋力n n3 双螺旋结构基本形式双螺旋结构基本形式n n4 变性和复性变性和复性第三节第三节 DNA二级结构二级结构第65页4 变性和复性变性和复性4.1 变性变性(denaturation)4.1.1概念：概念：在一些理化原在一些理化原因作用下，因作用下，DNA分子互补分子互补碱基对之间氢键断裂，碱基对之间氢键断裂，DNA双螺旋结构涣散，变双螺旋结构涣散，变成单链过程成单链过程。第66页4.1.2惯用变性方法惯用变性方法热变性热变性碱变性碱变性应用广泛，尤其是用于变性动力学研究应用广泛，尤其是用于变性动力学研究缺点：缺点：高温引发磷酸二酯键断裂，得到长短高温引发磷酸二酯键断裂，得到长短不一单链不一单链pH11.3时，全部氢键被淘汰时，全部氢键被淘汰无热变性缺点，为制备单链无热变性缺点，为制备单链DNADNA首选方法首选方法 第67页4.1.3 核酸变性程度判定核酸变性程度判定紫外测定法：紫外测定法：n n原理：原理：n n嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，碱基、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，碱基、核苷、核苷酸、核酸在核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈紫外吸处有强烈紫外吸收，最大吸收峰在收，最大吸收峰在260nm处。处。第68页n n紫外光吸收值：紫外光吸收值：紫外光吸收值：紫外光吸收值：1 1 双链双链双链双链DNA ADNA A260260=1.00=1.00 2 2 单链单链单链单链DNA ADNA A260260=1.37=1.37 3 3 自由碱基自由碱基自由碱基自由碱基 A A260260=1.60=1.60第69页1.1851.01.37ODTm=OD增加值中点温度增加值中点温度(普通为普通为85-95)或或DNA双螺旋结构失去二分之一时温度双螺旋结构失去二分之一时温度4.1.4熔解曲线与熔解曲线与Tm值值 迟缓而均匀地增加迟缓而均匀地增加DNA溶液温度（现可做到溶液温度（现可做到0.1 分分）可依据各点可依据各点A260值绘值绘制成制成DNA熔解曲线。熔解曲线。这也是普通这也是普通PCRPCR试验技术中把变性温度定为试验技术中把变性温度定为9494原因原因 熔链温度熔链温度Tm第70页4.1.5 影响影响DNA Tm值大小原因：值大小原因：n nDNA均一性：均一性：n nG-C含量：含量：TmTm值计算公式：值计算公式：值计算公式：值计算公式：TmTm69.3+0.41(G+C)%69.3+0.41(G+C)%GC%=GC%=（Tm-69.3Tm-69.3）2.442.44n n介质中离子强度：介质中离子强度：n nDNA保留在高浓度缓冲液中，如保留在高浓度缓冲液中，如 1mol/LNaCl中。中。第71页4.2 复性及杂交复性及杂交 4.2.1 DNA复性复性(renaturation)n n变性变性DNA在适当条件下，分开两条单链分子在适当条件下，分开两条单链分子按照碱基互补标准重新恢复天然双螺旋构象按照碱基互补标准重新恢复天然双螺旋构象现象，又称为现象，又称为退火退火（annealing）。第72页n nDNA复性复性条件有两个条件有两个：（1）有）有足够盐浓度足够盐浓度以消除磷酸基静电斥力；以消除磷酸基静电斥力；（2）有）有足够高温度足够高温度以破坏无规则链内氢键，以破坏无规则链内氢键，但又不能太高，但又不能太高，n n普通使用普通使用比比Tm值低值低2025。第73页复性机制复性机制 n n 普通认为需要普通认为需要1020个碱基对个碱基对，尤其是富，尤其是富含含GC节段首先形成一个（或几个）双螺旋节段首先形成一个（或几个）双螺旋关键，这一步叫关键，这一步叫成核作用成核作用。然后两条单链。然后两条单链其余部分就会快速形成双螺旋结构。其余部分就会快速形成双螺旋结构。n n绝大部分复性绝大部分复性DNA分子都不是原配。分子都不是原配。第74页4.2.2 复性影响因子：复性影响因子：n n 温度和时间温度和时间：低于低于低于低于TmTm值值值值2525左右左右左右左右(60-65)(60-65)n n DNA浓度浓度：n n DNA片段大小片段大小：n n DNA次序复杂性次序复杂性；n n 反应溶液中离子强度反应溶液中离子强度。第75页n n多聚酶链式反应（多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）n n是一个是一个DNA体外扩增技术体外扩增技术，其基本原理类，其基本原理类似于似于DNA天然复制过程天然复制过程。n n在待扩增在待扩增DNA片段两侧和与其两侧互补两片段两侧和与其两侧互补两个寡核苷酸个寡核苷酸引物引物，经，经变性、退火和延伸变性、退火和延伸若若干个循环后，干个循环后，DNA扩增扩增2n倍。倍。第76页第77页4.3 杂交（杂交（hybridization）n n杂交：杂交：亲缘关系很近不亲缘关系很近不一样起源一样起源DNA单链或单链或RNA单链与单链与DNA单链单链之间经过碱基互补形成之间经过碱基互补形成杂交分子过程。杂交分子过程。第78页图核酸杂交及其应用示意图图核酸杂交及其应用示意图1粗细线粗细线分别代分别代表不一表不一样样DNA。杂化双链杂化双链B代表天然代表天然DNA；C是是B缺失突变体；缺失突变体；虚线框内是虚线框内是已缺失部分已缺失部分,D显示从天显示从天然然DNA链鼓链鼓出小泡出小泡.突变体判别突变体判别I 变性、复性和杂交变性、复性和杂交 第79页.分子探针标识分子探针标识n n核酸分子探针：核酸分子探针：用同位素、生物素或荧光用同位素、生物素或荧光染料染料标识一小段已知核苷酸序列标识一小段已知核苷酸序列作为探针，作为探针，探针序列假如与探针序列假如与DNA或或RNA序列互补，就序列互补，就能够探知核酸分子。能够探知核酸分子。粗线表示分子探针粗线表示分子探针图核酸杂交及其应用示意图图核酸杂交及其应用示意图2第80页杂交分类：杂交分类：1）液相杂交：）液相杂交：不一样起源不一样起源DNA在溶液中进行杂在溶液中进行杂交。交。2)滤膜杂交：滤膜杂交：将将DNA或或RNA吸附到硝酸纤维素吸附到硝酸纤维素膜上再进行杂交。膜上再进行杂交。n nSouthern杂交：杂交：用于判别用于判别DNA杂交杂交n nNorthern杂交：杂交：用于判别用于判别RNA杂交杂交第81页Southern 印迹法（印迹法（Southern blotting）：）：DNA限制片段限制片段限制性内切酶限制性内切酶带有带有DNA片段凝胶片段凝胶琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱液浸泡，并中和碱液浸泡，并中和凝胶上凝胶上DNA变性变性变性单链变性单链DNA转移至转移至硝酸纤维素薄膜上硝酸纤维素薄膜上放射性标识探针杂交放射性标识探针杂交杂交杂交DNA-DNA分子分子放射自显影放射自显影显示出杂交分子位置显示出杂交分子位置第82页第83页第84页n n遗传物质基础证实试验遗传物质基础证实试验n nDNA双螺旋结构模型基本参数双螺旋结构模型基本参数n n维持维持DNA双螺旋结构力双螺旋结构力n nDNA变性、变性、DNA复性、杂交复性、杂交回顾回顾第85页n n第一节第一节 遗传物质本质遗传物质本质n n第二节第二节 核酸化学组成核酸化学组成n n第三节第三节 DNA二级结构二级结构n n第四节第四节 二级结构其它形式二级结构其它形式n n第五节第五节 DNA超螺旋结构超螺旋结构第86页第四节 二级结构其它形式n n1 单链核酸形成二级结构单链核酸形成二级结构n n2 反向重复与反向重复与二级结构二级结构n n3 三螺旋三螺旋DNAn n4 DNA四链结构四链结构第87页1 单链核酸形成二级结构n n单链核酸某段碱基能够与另一独立单链分单链核酸某段碱基能够与另一独立单链分子碱基配对，形成双螺旋，能够是子碱基配对，形成双螺旋，能够是DNA-DNA、RNA-RNA，也有，也有DNA-RNA分子分子杂交。杂交。第88页发夹结构（发夹结构（hairpin structure）：n n同一个单链同一个单链RNA/DNA一段碱基序列附近一段碱基序列附近存在着和它互补碱基序列时，这个单链本存在着和它互补碱基序列时，这个单链本身回折产生一个反平行双螺旋结构。身回折产生一个反平行双螺旋结构。第89页单链单链RNA形成发夹结构形成发夹结构 发夹结构由碱基配对双螺旋区茎和末端不配对环构成。第90页互补序列间间隔较短或无间隔互补序列间间隔较短或无间隔互补序列间间隔较长互补序列间间隔较长第91页第92页第93页2反向重复与二级结构反向重复与二级结构n n反向重复反向重复（invertedrepeatitiveinvertedrepeatitiveIRIR）：双链：双链DNA中一段序列按中一段序列按确定方向，确定方向，读双链中每读双链中每条链条链序列都相同序列都相同，n n反向重复中序列又称回文序列。反向重复中序列又称回文序列。第94页单链形成发夹结构单链形成发夹结构第95页形成十字结构要更耗能，所以在体外反向形成十字结构要更耗能，所以在体外反向重复结构存在多，而体内无该结构。重复结构存在多，而体内无该结构。反反向向重重复复与与十十字字结结构构第96页作用：作用：1）较短回文序列可能是作为一个信号）较短回文序列可能是作为一个信号如：限制性内切酶识别位点如：限制性内切酶识别位点一些调控蛋白识别位点一些调控蛋白识别位点比如限制性内切酶比如限制性内切酶EcoR识别位点识别位点5GAATTC33CTTAAG5第97页2 2）转录作用终止与回文结构也相关系。）转录作用终止与回文结构也相关系。第98页第四节 二级结构其它形式n n1 单链核酸形成二级结构单链核酸形成二级结构n n2 反向重复与二级结构反向重复与二级结构n n3 三螺旋三螺旋DNAn n4 DNA四链结构四链结构第99页1953年年Watson&Crick双螺旋双螺旋DNA构型构型证实沿大沟存在多出氢键作为给体与受体证实沿大沟存在多出氢键作为给体与受体潜在专一与潜在专一与DNA(蛋白质蛋白质)结合能力结合能力形成三链形成三链DNA可能性可能性3 三螺旋三螺旋DNA（triple helix DNA）第100页n n1957年年Felsenfield发觉：当双螺旋发觉：当双螺旋DNA中一中一条链为全嘌呤链，另外一条链为全嘧啶链时，条链为全嘌呤链，另外一条链为全嘧啶链时，会出现核酸三链结构。会出现核酸三链结构。poly(U)+poly(U)+poly(A)三螺旋三螺旋RNA双螺旋双螺旋DNA概念概念第101页n n三链三链DNA是由三条核苷酸链按一定规律绕是由三条核苷酸链按一定规律绕成螺旋状结构。成螺旋状结构。结构单元：三碱基体，结构单元：三碱基体，结合方式：碱基间形成氢键；结合方式：碱基间形成氢键；三螺旋三螺旋双螺旋第102页基本类型：基本类型：基本类型：基本类型：n n嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶-嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤-嘧啶型（嘧啶型（嘧啶型（嘧啶型（YR*YYR*Y）：）：）：）：第三条嘧啶链以平第三条嘧啶链以平第三条嘧啶链以平第三条嘧啶链以平行于双螺旋中嘌呤链方向，缠绕到双螺旋大沟上，行于双螺旋中嘌呤链方向，缠绕到双螺旋大沟上，行于双螺旋中嘌呤链方向，缠绕到双螺旋大沟上，行于双螺旋中嘌呤链方向，缠绕到双螺旋大沟上，与嘌呤链结合。与嘌呤链结合。与嘌呤链结合。与嘌呤链结合。n n如如如如TA*TTA*T和和和和CG*CCG*C；n n其中其中其中其中C C必须质子化才能稳定三螺旋结构，其碱基氢必须质子化才能稳定三螺旋结构，其碱基氢必须质子化才能稳定三螺旋结构，其碱基氢必须质子化才能稳定三螺旋结构，其碱基氢键结构是霍氏（键结构是霍氏（键结构是霍氏（键结构是霍氏（K.HoogsteenK.Hoogsteen）首先提出，称为）首先提出，称为）首先提出，称为）首先提出，称为HoogsteenHoogsteen霍氏氢键霍氏氢键霍氏氢键霍氏氢键。n n嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤-嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤-嘧啶（嘧啶（嘧啶（嘧啶（YR*R YR*R）：）：）：）：第三条嘌呤链反平行第三条嘌呤链反平行第三条嘌呤链反平行第三条嘌呤链反平行于双螺旋嘌呤链方向缠绕到双螺旋大沟上，与嘌呤于双螺旋嘌呤链方向缠绕到双螺旋大沟上，与嘌呤于双螺旋嘌呤链方向缠绕到双螺旋大沟上，与嘌呤于双螺旋嘌呤链方向缠绕到双螺旋大沟上，与嘌呤链结合；链结合；链结合；链结合；n n如如如如CG*GCG*G、TA*ATA*A、TA*TTA*T、CG*ACG*A四种。四种。四种。四种。第103页三链三链DNA可能功效可能功效a)可阻止调整蛋白与可阻止调整蛋白与DNA结合结合,关闭基因转录过程关闭基因转录过程b)b)与基因重组与基因重组,交换相关交换相关c)加入第三条加入第三条DNA作为分子剪刀作为分子剪刀,定点切割定点切割DNA分子分子d)加入反义第三条链终止基因表示加入反义第三条链终止基因表示第104页4 DNA四链结构四链结构(TetrableHelixDNA)第105页DNA3-末末端端较较长长富富含含G序序列列能能够够形形成成回回折折结结构构（下下列列图图a和和b），经经过过碱碱基基间间非非标标准准配配对对形形成成G四链四链DNA（下列图（下列图c和和d）。）。在在这这么么结结构构中中，G形形成成一一个个四四联联体体，相相互互间间经经过过霍氏氢键霍氏氢键霍氏氢键霍氏氢键方式结合。方式结合。GGGG第106页p在在在在G-G-四链体结构中：四链体结构中：四链体结构中：四链体结构中：G-G-四联体四联体以螺旋方式堆积而成，以螺旋方式堆积而成，以螺旋方式堆积而成，以螺旋方式堆积而成，四个鸟嘌呤组成四个鸟嘌呤组成四个鸟嘌呤组成四个鸟嘌呤组成G-G-四方体平面，其中每个鸟嘌呤四方体平面，其中每个鸟嘌呤四方体平面，其中每个鸟嘌呤四方体平面，其中每个鸟嘌呤都作为碱基对氢键供体和受体。都作为碱基对氢键供体和受体。都作为碱基对氢键供体和受体。都作为碱基对氢键供体和受体。p结构单元：结构单元：鸟嘌呤四联体鸟嘌呤四联体GGGG第107页类型:第108页53TTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTTGGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT真核生物染色体端粒真核生物染色体端粒