PCR引物作业流程设计详解.doc

PCR引物设计流程详解
本文目：复制出IL-4基因片段

一、 查找基因序列
1、 进入NCBI主页，下拉选框选取Nucleotide，在搜索栏输入要查找目基因，即IL-4，点击搜索

2 、在搜索成果选取灵长类（Homo sapiens）

2、 在灵长类IL-4基因中选取需要mRNA序列

3、 查看基因有关信息

外显子区域

CDs区域

4、 点击FASTA格式，并将序列保存到文档

二、 使用primer premier 5.0设计引物
1、 建立新文献，将所得序列复制进输入框内

2、 点击搜索按钮，搜索引物

3、 设立引物设计参数（由于在之前查找基因序列时候获知，外显子区域分别为：1-200、201-248、249-425、426-618，又知在引物设计时引物位置最佳跨越一种内含子，PCR产物长度普通为100-150bp，故设定上游引物位置为201-248，下游引物位置为249-425，产物长度为100-150bp）

4、确认条件后，显示搜索成果

4、 双击选中得分最高引物查看引物状况

（上图为上游引物状况，下图为下游引物状况）

5、 将设计上下游引物复制出来，保存到文档中

三、 使用oligo 6.0对设计引物进行评价
1、 建立新文献，将从cnki上获得cDNA复制进输入框，并点击accept接受

2、 接受后显示出该序列有关信息

3、 点击edit按钮录入用primer设计上游引物，每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接受

4、 同理，录入下游引物

5、 分析上下游引物二聚体形成状况

6、 分析上下游引物发卡形成状况

7、 分析上下游引物GC%

8、 检测上下游引物与PCR模板其他位置错配状况

9、 分析PCR整体状况

四、 引物特异性检查（primer blast）
1、 进入NCBI主页，并选取blast

2、 选取primer blast

3、 在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击get primer进行对比

4、 查看blast成果

Blast 成果显示，尽管IL-4与其他基因有相似区，但是引物3’端没有完全互补。故设计引物能特异性扩增出目基因