1、PCR引物设计流程详解本文目:复制出IL-4基因片段一、 查找基因序列1、 进入NCBI主页,下拉选框选取Nucleotide,在搜索栏输入要查找目基因,即IL-4,点击搜索2 、在搜索成果选取灵长类(Homo sapiens)2、 在灵长类IL-4基因中选取需要mRNA序列3、 查看基因有关信息外显子区域CDs区域4、 点击FASTA格式,并将序列保存到文档二、 使用primer premier 5.0设计引物1、 建立新文献,将所得序列复制进输入框内2、 点击搜索按钮,搜索引物3、 设立引物设计参数(由于在之前查找基因序列时候获知,外显子区域分别为:1-200、201-248、249-42
2、5、426-618,又知在引物设计时引物位置最佳跨越一种内含子,PCR产物长度普通为100-150bp,故设定上游引物位置为201-248,下游引物位置为249-425,产物长度为100-150bp)4、确认条件后,显示搜索成果4、 双击选中得分最高引物查看引物状况(上图为上游引物状况,下图为下游引物状况)5、 将设计上下游引物复制出来,保存到文档中三、 使用oligo 6.0对设计引物进行评价1、 建立新文献,将从cnki上获得cDNA复制进输入框,并点击accept接受2、 接受后显示出该序列有关信息3、 点击edit按钮录入用primer设计上游引物,每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接受4、 同理,录入下游引物5、 分析上下游引物二聚体形成状况6、 分析上下游引物发卡形成状况7、 分析上下游引物GC%8、 检测上下游引物与PCR模板其他位置错配状况9、 分析PCR整体状况四、 引物特异性检查(primer blast)1、 进入NCBI主页,并选取blast2、 选取primer blast3、 在输入框内输入模板序列和上下游引物,并设定对比数据库,点击get primer进行对比4、 查看blast成果Blast 成果显示,尽管IL-4与其他基因有相似区,但是引物3端没有完全互补。故设计引物能特异性扩增出目基因