丝裂霉素C-全氟溴辛烷脂质体纳米药物对人翼状胬肉成纤维细胞治疗安全性及效果评价.pdf

欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉引文格式：李涛，廖灵珊，朱胜兰，唐娟，吴小利，方其林，等 丝裂霉素 全氟溴辛烷脂质体纳米药物对人翼状胬肉成纤维细胞治疗安全性及效果评价 眼科新进展，（）：【实验研究】丝裂霉素 全氟溴辛烷脂质体纳米药物对人翼状胬肉成纤维细胞治疗安全性及效果评价李涛廖灵珊朱胜兰唐娟吴小利方其林李盈李彪田琴万俊梅阳毅谭越月李佳倩杜鹃周燕张丹刘兴德欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉作者简介：李涛（：），男，年 月出生，四川资阳人，硕士研究生，重庆医科大学眼科学专业在读博士。研究方向：白 内 障 及 眼 视 光。：通信 作 者：刘 兴 德（：），男，年 月出生，四川简阳人，主任医师，四川省眼科专委会常务委员。研究方向：白 内 障 及 眼 视 光。：收稿日期：修回日期：本文编辑：臧赫基金项目：四川省资阳市医学科学课题计划项目（编号：，）；四川省资阳市科学技术局计划项目（编号：）；河北省医学科学研究课题计划（编号：）作者单位：四川省资阳市，资阳市第一人民医院眼科（李涛，吴小利，方其林，李盈，李彪，田琴，万俊梅，阳毅，谭越月，李佳倩，杜鹃，周燕，张丹，刘兴德）；四川省资阳市，资阳第一人民医院眼科重点实验室（李涛，吴小利，方其林，李盈，李彪，田琴，万俊梅，阳毅，谭越月，李佳倩，杜鹃，周燕，张丹，刘兴德）；重庆市，重庆大学附属肿瘤医院肿瘤放射治疗中心（廖灵珊）；四川省资阳市，资阳口腔职业学院基础教学部（朱胜兰）；四川省资阳市，资阳市第一人民医院内分泌科（唐娟）【摘要】目的制备一种以脂质体为载体，以液态的全氟溴辛烷（）为内核，丝裂霉素 （）搭载于脂质体壳的纳米药物 ，研究其对人翼状胬肉成纤维细胞（）增殖的抑制作用。方法采用薄膜分散 水化超声法制备 ，并检测其物理、化学性质。通过 、细胞活 死染色、流式细胞术等方法检测不同浓度 对 活性的影响。在激光共聚焦显微镜下采用 荧光标记的 观察纳米药物对于 的药物渗透性。建立 炎症细胞模型后，按照实验要求分为对照组（加入无菌 溶液）、组（加入 ）、组（加入 ）、组（加入 ）、正常组（加入新鲜培养基），共孵育 后，流式细胞仪检测炎症细胞的凋亡率以及从 角度分析细胞中白细胞介素（）、前裂腺素（）、肿瘤坏死因子（）及血管内皮生长因子（）基因表达水平。结果 平均粒径和 电位分别为（）和（），其包封率和载药率分别为（）和（）。体外 眼表环境下载药纳米微球缓释 可达（）。的生物安全性较 明显提高。荧光标记的 与炎症化 共同孵育 后，荧光标记弥漫性分布于炎症化 中。组炎症化 细胞凋亡率（）明显高于 组（）；检查结果显示，其余各组 、及 基因基因转录水平与对照组和 组相比均明显下降，其中 组降低最明显，差异均有统计学意义（均为 ）。结论本研究成功合成了一种新型的抗 增殖的纳米药物 ，且细胞毒性较原药明显降低，具有良好的生物相容性和抗炎效果，为降低翼状胬肉术后复发率提供了一种新的治疗思路。【关键词】翼状胬肉；丝裂霉素 ；脂质体；纳米医学；抗炎【中图分类号】翼状胬肉是睑裂区的球结膜及其膜下组织的异常增生肥厚，呈三角形向角膜浸润性生长的纤维血管组织疾病 。翼状胬肉浸润角膜后可能引起眼球转动障碍、角膜散光及视力下降等症状 。风尘、紫外线、干燥及烟雾等因素均可能导致翼状胬肉发生，是我国眼科临床的多发病及常见病 。目前关于翼状胬肉的最常见治疗方法是单纯切除 角膜缘干细胞移植，但手术治疗常存在术后复发率高与眼角修复困难等缺点 。既往研究显示，丝裂霉素（）是一种临床中广泛应用的抗代谢、抗增殖药物，可有效抑制多种细胞生长 。研究表明，手术过程中使用 对翼状胬肉患者进行干预，可有效降低患者术后复发率，但由于 易导致角膜穿孔、巩膜溶解、虹膜炎及继发性青光眼等并发症，其临床使用受到限制 。近年来，纳米技术逐渐应用于眼科研究，脂质体作为一种人工球形囊泡，由一个或多个磷脂双分子层组成，具有水溶性和脂溶性的药物载体特性，在药物的缓释、控释及降低药物不良反应 等 方 面 受 到 广 泛 关 注 。全 氟 溴 辛 烷（）是一种相变材料，最初用于急性肺损伤治疗中改善肺功能。研究发现，可以靶向结膜上皮细胞，并局限作用于损伤区域的炎症，同时该材料可完全生物降解和相对无毒 。因此推测 和 结合在脂质体上，其抗炎效果会得到增强，同时可以有效降低单独使用 的不良反应。基于此，本研究制备一种以脂质体为载体，以液态 为内核，搭载于脂质体壳的纳米药物 ，研究其对人翼状胬肉成纤维细胞（）增殖的抑制作用，为临床治疗翼状胬肉提供参考。：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 材料与方法 实验材料选用 作为实验药物，以脂质体和 为包封材料制备 。主要试剂和仪器主要试剂和生产厂家分别为大豆卵磷脂（上海麦克林生化科技有限公司）；，双（二苯基膦基）乙烷（）（，瑞士）；胆固醇（西安瑞禧生物科技有限公司）；（，美国）；甲醇（重庆川东化工集团）；（）缓冲液；（西安山川生物科技有限公司）。主要仪器：旋转蒸发仪（上海泰坦生物有限公司）；声震仪（，美国）；低温 高 速 离 心 机（，德 国）；透 射 电 镜（）（，日本）；型激光粒径及电位测量仪（，美国）；紫外分光光度计（，日本）。制备方法 溶液配置采取精密天平称取 ，加入不同体积的 细胞培养液混合均匀，配制浓度分别为 、的 溶液备用。的制备采用薄膜分散 水化超声法（）制备 和 的脂质体（）。具 体 步 骤：精 密 称 取 的磷脂（大豆卵磷脂 胆固醇的质量比为 ），及 三氯甲烷放入 圆底烧瓶中；将圆底烧瓶转移到旋转蒸发仪上（，负压 ，），得到白色脂质膜，采用 洗脱，冷却，加入 ，镶嵌在脂质膜上的脂质体用 、（开 关时间为 ）工作模式的声震仪将已形成的脂质体均匀化，最后用低温离心机（，）进行纯化，低温避光保存，备用。用同样的方法制备载 脂质体（）以及添加了荧光标记物 的纳米药物 。纳米粒表征测量采用马尔文粒径仪测量 和 脂质体的粒径和 电位。配制不同浓度的汉防己甲素甲醇溶液，通过紫外分光光度计测量其吸收度，根据最大吸光度值确定吸收峰，并且计算各自的浓度 吸光度标准曲线。包封率 载药量 总投入量 ；载药率 载药量 脂质体总量 。同时采用高效液相色谱法测量 在（储存温度）和（眼表温度）情况下的药物释放率。培养选取资阳市第一人民医院翼状胬肉手术切除组织为标本，采用组织块培养法培养 。在恒温，含体积分数 的环境中，用含体积分数 胎牛血清和 青霉素 链霉素的 培养基培养，当细胞融合度达到 时进行传代。本实验取第 代 进行实验。生物安全性验证 实验将 种植在 孔板（每孔 个），细胞铺满 ，用血清培养基稀释 和 ，添加 组和添加 组中 浓度一致，分别为 、和 ，血清培养基处理组作为对照组。每组设置个复孔，孵育 和 后，移除培养基，清洗 次，最后向每孔加入 配制好的 溶液（无血清培养基 ），孵育 ，再用全自动酶标仪检测波长在 处每个孔的吸光度（）值。计算不同组别的细胞存活率：细胞存活率（）（实验组 对照组）对照组 。细胞活 死染色将 接种在共聚焦培养皿（个）上，分别加入血清稀释的 和 ，和 中 浓度一致（），共孵育 后，弃掉培养基，洗次，各皿加入 配制好的 双染试剂并孵育 ，观察细胞的存活 死亡情况。流式细胞术实验将 种植在 孔细胞培养板（每孔 个），待细胞铺满 ，分别加入血清稀释的 和 ，和 中 浓度一致（），共同孵育 ，利用无菌 溶液清洗孔细胞培养板次，胰蛋白酶 消化细胞 ，加入人角膜基质成纤维细胞专属培养液 终止消化，收集细胞悬液于 离心管，离心，弃掉废液，取细胞沉淀，加入 无菌 于 离心管混合均匀，转入 的 管，放入流式细胞仪检测各组中活细胞数量。纳米药物体外抗炎效果评价与分组采用共聚焦显微镜观察予以 治疗后炎症化 的数量及形态改变，同时利用 荧光标记的 纳米药物在共聚焦显微镜下观察纳米药物的渗透性；此外，将 种植在孔细胞培养板（每孔 个），细胞铺满 ，弃掉培养基，清洗 次，加入含炎症诱导因子 （）的培养基，炎症细胞模型建立后，按照实验要求分为对照组（加入无菌 溶液）、组（加入 ）、组（加入 ）、组（加入 ），正常 弃掉原有培养基后加入新鲜的培养基培养作为正常组，共孵育 后，收集每组的细眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：胞和上清液，每组的细胞及上清液分成 份，一份 后洗 次，重悬，在室温下黑暗环境中与 结合膜蛋白 和 共孵育 ，然后用流式细胞仪检测炎症细胞的凋亡率；另一份采用 快速试剂提取盒提取 ，进行 的逆转录，检测系统进行实时定量 ，进行各炎症因子基因转录水平分析比较。在此过程中合成应用了引物前列腺素（）、血管内皮生长因子（）、白细胞介素（）、肿 瘤 坏 死 因 子（）。统计学处理应用 统计软件处理数据，计数资料采用均数 标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准：。结果 基本理化性质分析 的 平 均 粒 径 （）大于 （），与 的 电位分别为（）与（），动态光分散指数分别为 与 。相同浓度 情况下，溶液呈乳白色，悬浊液乳白色颜色更深（图 ）。纳米微球在投射电镜下呈脂质体的壳核结构，可观察到磷脂双分子层和实心球形结构（图 ）；检测 和 纳米微球 的粒径变化，结果显示，分散在 中高度稳定（图 ）；进一步采用用紫外分光光度计检测 的光学性质，结果显示，和 在 处有特征性吸收峰，而 则没有（图 ）。纳米微球的包封率为（），载药率为（）。药物释放实验方面，在（储存温度）和（眼表温度）条件下，经过 累积释放率分别为（）和（）（图 ）。图 溶液与 悬浊液颜色比较（浓度相同）。图 下的 纳米微球结构（浓度：）生物安全性分析 实验结果表明，活力在 溶液和 溶液中随 浓度的增加而呈剂量依赖性降低，相较于 溶液，纳米药物中的 活力明显较高（图 ）。当 浓度为 时，在活 死染色图像中，添加 的悬浊液中绿色荧光细胞（活细胞）的大量存在证明该浓度 对 安全（图 ）。同时流式细胞术实验结果表明，在共同孵育 后，添加 的 细胞凋亡率（）明显低添加 的 细胞凋亡率（）（图 ）。各实验结果显示，与纳米载体结合后，的生物安全性高于 。：的粒径分布（马尔粒径仪监测）；：中的粒径大小变化。图 和 纳米微球 粒径变化图 、及 的紫外吸收波普与吸收峰分布（浓度均为 ）。图 溶液中 的的体外累积释放率：共孵育 ；：共孵育 。两两比较，：差异无统计学意义。图 与不同浓度 溶液和 悬浊液共孵育 与 后细胞活力比较：添加 溶液；：添加 悬浊液。图 与 溶液及 悬浊液共孵育 后细胞活 死染色图（浓度：）：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：添加 溶液；：添加 悬浊液。图 流式细胞术检测 与 溶液及 悬浊液共孵育 后细胞凋亡率分期图（浓度：）对翼状胬肉术后抗炎效果评价通过炎症诱导因子 诱导 转变为翼状胬肉术后纤维化炎症细胞模型（图 ），予以 纳米药物治疗 后，炎症化细胞数量明显减少，细胞体积变小（图 ）；进一步采用 荧光标记的 与炎症化 共同孵育，结果显示，荧光标记纳米药物弥漫性分布于炎症化 中，说明 可有效进入炎症化 中发挥抗炎作用（图 ）；同时流式细胞术检测结果显示，和 与炎症化 共同孵育 后，组炎症化 细胞凋亡率（）明显高于 组（）（图 ）；进 一 步 提 取 正 常 组、对 照 组、组、组、组中细胞 进行实时定量 检查，结果显示，对照组和 组中 、及 基因表达水平均高于正常组，予以 和 治疗后，、及 基因转录水平与对照组和 组相比均明显下调，其中 组降低最明显，差异均有统计学意义（均为 ）（图 ）。：诱导的翼状胬肉术后纤维化炎症细胞模型；：与炎症化 共孵育 后细胞形态。图 炎症化 模型及 与炎症化 共同孵育 后细胞形态变化图：荧光标记的 ；：炎症化 ；：荧光标记的 进入炎症化 。图 荧光标记的 与炎症化 共孵育荧光标记图：组；：组。图 流式细胞术分析炎症化 与 及 共孵育 后细胞凋亡图：各组 的 基因转录水平；：各组 的 基因转录水平；：各组 的 基因转录水平；：各组 的 基因转录水平。组间两两比较，；：差异无统计学意义。图 各组 炎症相关因子基因转录水平分析柱状图 讨论翼状胬肉是眼科常见的眼表疾病，翼状胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术是目前最常用的手术方式，但瘢痕增生及复发等情况是眼科临床亟待解决的问题 。研究表明，翼状胬肉术后 受到手术刺激，会大量产生 、及 等炎症因子表达，而该类炎症因子的表达是术后翼状胬肉复发的重要原因，因此抗炎治疗在该病的发生和发展中具有非常重要的作用 。既往研究表明，手术过程中使用 可以有效降低术后翼状胬肉复发风险，但由于 易导致角膜穿孔、巩膜溶解、虹膜炎及继发性青光眼等并发症，其临床使用受限 。因此，本研究利用脂质体为载体，以液态的 为内核，搭载于脂质体壳，合成纳米粒 ，利用纳米材料易修饰性、缓释性及良好的生物相容性等优势，研制一种旨在抑制翼状胬肉术后复发且不良反应较小的新药。本研究采用薄膜 分散 水化超声法成功合成了一种新型纳米脂质体 。的粒径、形态、电位以及紫外光谱结果均表明 成功负载到 脂质体上，并且 纳米药物 的粒径变化分析进一步证明了该纳米药物的良好稳定性，同时 眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：和 温度释放曲线表明该纳米药物在眼表环境下（）具有良好的释放性；其中 电位结果显示，纳米微球带负电荷电位，负载 药物后，纳米药物带正电荷，说明大部分药物负载于脂质体内部，形成表面带正电荷的纳米脂质体，这有利于与带负电荷的细胞膜相互作用，增强细胞对载药纳米粒的摄取。有研究表明，在泪液的黏蛋白层中，糖基侧链中含有大量 和 ，使眼球表面附带负电荷，正负电荷的静电作用将有助于延长载药纳米微球的眼表滞留时间，更好地发挥药物的治疗作用 。脂质体几乎无毒性，具有良好生物安全性。有研究发现，脂质体浓度为 时仍未对结膜上皮细胞产生任何毒性 。本研究进一步采用 、流式细胞术及活 死染色分析了 和 的生物安全性，结果表明，随着 浓度的增加，纳米药物的细胞活力明显高于直接使用 ，特别是在 药物浓度非常高（）的情况下，组细胞仍然保持良好的细胞活力。进一步将 和 中 浓 度 设 置 为 ，与 共同孵育 后行细胞活 死染色检查发现，溶液中的细胞存活率明显高于 溶液；流式细胞术进一步从数据角度验证了该观点。上述结果均表明，和纳米载体结合后，药物毒性降低，新合成的纳米药物 生物安全性良好。眼表炎症是翼状胬肉术后复发的重要因素，研究表明，炎症细胞因子 、及 等在翼状胬肉的发生和发展中发挥重要作用，通过抑制 、及 的表达可显著降低翼状胬肉术后复发率 。因此，本研究通过体外实验检测了 和 的抗炎效果，炎症化的 经过 治疗后，炎症细胞数量明显减少，细胞体积变小；同时 荧光标记的 纳米药物在细胞质中的弥漫性分布进一步说明了该纳米药物对于炎症化的 具有良好的渗透性。采用流式细胞术检测经 和 处理后的炎症化 的存活率，结果显示，组炎症化 凋亡率明显高于 组；同时在体外实验中，检测正常 和经 、及 处理过后的炎症化 中 、及 等细胞因子的表达，实时定量 结果显示，经 和 处理后，种炎症因子的表达均下调，其中 组中 种炎症因子的表达下降最明显。上述结果表明，与单独使用 治疗相比，与纳米载体相结合后，药物作用时间延长，纳米药物对细胞增殖的抑制作用明显增强，可达到有效降低眼表炎症的目的，降低翼状胬肉术后复发风险。结论本研究成功合成了一种新型的抗翼状胬肉术后复发的纳米药物 ，该纳米药物具有良好的生物相容性、缓释效应和抗炎效果，可以有效降低翼状胬肉术后眼表炎症反应，为翼状胬肉术后降低复发率提供了一种新的治疗思路。参考文献 ，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，（）：安美霞，吴开力，林少春 初发和复发翼状胬肉成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶的比较及汉防己甲素对其的影响 眼科新进展，（）：，（）：，：，：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，：【】（），（）（）（），（），（），（），（）（），（），（），（）（）（）（），（）（），（），（）（），（），（），【】；眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：